重組草魚干擾素-白介素1二聯(lián)蛋白的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種重組草魚干擾素-白介素1二聯(lián)蛋白的制備方法及應(yīng)用，其特征是包括如下步驟：（1）草魚IL-1基因的克隆；（2）構(gòu)建包含IFN和IL-1的聯(lián)合表達載體pET-32a(+)/CiIFN-IL-1；（3）表達和純化重組二聯(lián)蛋白：將聯(lián)合表達載體pET-32a(+)/CiIFN-IL-1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，IPTG誘導(dǎo)表達重組蛋白IFN-IL-1并通過Ni-NTA親和層析純化融合蛋白。本發(fā)明能夠同時發(fā)揮IFN和IL-1的免疫功效，克服了在飼料中分別添加IFN與IL-1的量及其精確比例等等不足，是一種高效、無毒的草魚抗病制劑。
【專利說明】重組草魚干擾素-白介素1二聯(lián)蛋白的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及基因重組方法及應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]草魚肉質(zhì)肥嫩，味道鮮美，同時具有食性簡單、餌料來源廣泛、生長迅速、經(jīng)濟效益明顯等特點，為我國水產(chǎn)養(yǎng)殖一個優(yōu)良的主養(yǎng)或配養(yǎng)魚種，在漁業(yè)中占有重要地位。近幾年來，我省草魚的養(yǎng)殖規(guī)模以及養(yǎng)殖水平都有很大的提高，其養(yǎng)殖產(chǎn)量已躍居首位，為繁榮當(dāng)?shù)剞r(nóng)村經(jīng)濟做出了很大貢獻。然而，伴隨著高密度養(yǎng)殖的發(fā)展，草魚從魚苗至成魚的整個生長時期均備受各類疾病困擾，特別是病毒病和細菌病，這已成為制約草魚良性發(fā)展的瓶頸。有關(guān)魚病防控方法有很多，包括化學(xué)法、抗生素法和疫苗法等?；瘜W(xué)法由于可能會對魚體帶來損傷并對水體環(huán)境的大規(guī)模污染甚至破壞而基本禁用；抗生素法只對細菌有良好的效果而無法殺滅病毒，并且會造成魚體的抗生素法殘留，使用便要非常慎重。疫苗法雖然效果較好但不穩(wěn)定，也就大大限制了其推廣應(yīng)用。而在應(yīng)對外界刺激、病原體侵襲的防御過程中，魚類的非特異性免疫起著主要作用。除了巨噬細胞、細胞毒性細胞、粒細胞等具有吞噬功能的細胞外，目前已克隆獲得了一系列與草魚非特異性免疫相關(guān)因子的基因，主要包括干擾素、白介素、趨化因子、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及抗菌肽等。因此，從長遠來說，利用廣譜的抗病基因進行魚類疾病防治可能最有發(fā)展前途，這也符合當(dāng)今綠色水產(chǎn)養(yǎng)殖要求。
[0003]干擾素(Interfeixm，IFN)是一類具有抗病毒、抗腫瘤、控制細胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等重要作用的細胞因子，由于其在機體非特異性免疫系統(tǒng)中扮演著重要角色而備受關(guān)注。IFN基因通常狀態(tài)下并不表達，只有當(dāng)受到病毒、dsRNA等誘生劑刺激后，通過一系列信號級聯(lián)反應(yīng)最終激活I(lǐng)FN基因的轉(zhuǎn)錄，或者通過與未感染病毒的細胞上IFN受體結(jié)合，誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生大量的ISG(Interferon stimulated genes)蛋白來實現(xiàn)。類似于哺乳類細胞，在病毒或Poly 1:C等誘導(dǎo)下,魚類機體和細胞也會產(chǎn)生IFN。目前，已在斑馬魚rerio)等多種魚類中獲得了 Type I IFN基因,其后鯽魚、Carassius aruatus) Type I IFN基因的鑒定更充分證明了魚類IFN系統(tǒng)的存在。本實驗室通過基因組步移等方法也已克隆了I魚ACtenophaiyngodon idella) I型干擾素完整基因組序列(⑶139255)。白細胞介素(Interlecukin, IL)則是由活化的單核-巨噬細胞及淋巴細胞等產(chǎn)生的一類細胞因子，作用于淋巴細胞、巨噬細胞或其他細胞，負責(zé)信號傳遞，聯(lián)絡(luò)白細胞群，在機體免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。白細胞介素家族龐大，迄今已在人和哺乳類中發(fā)現(xiàn)并命名的就有30余種。近年來，有關(guān)魚類白細胞介素研究也獲得重要進展，已克隆鑒定了 IL-l、IL-2、IL-8、IL-1O等家族成員。
[0004]隨著基因重組技 術(shù)的迅猛發(fā)展，重組蛋白藥物的生產(chǎn)、應(yīng)用日趨成熟。在哺乳類和鳥類中，重組IFNa/β已被廣泛用于抑制腫瘤和治療病毒性疾病。類似的，魚類重組干擾素同樣具有抗病毒活性。Altmann SM等發(fā)現(xiàn)(Molecular and functionalanalysis of an interferon gene from the zebrafish, Danio reri0.J Virol,2003，77 (3):1992-2002.),轉(zhuǎn)染含IFN-α質(zhì)粒的斑馬魚胚胎細胞ZF4，能明顯增加對鱧彈狀病毒(SHRV)感染的抵抗力。Li DM等研究表明(Immunoprotection of grass carp{Ctenopharyngodon i del I a) with recombinant interferon (rCYIFN) against GCHVinfection.Aquaculture, 2013, 388 - 391:42-48.),將 0.1、1、10 Ug/g 魚體重等三種不同劑量的重組草魚干擾素(rC/IFN)經(jīng)由腹腔注射免疫草魚均能產(chǎn)生較好的免疫保護效力，但以I μ g/g魚體重的免疫劑量為最佳；另外，以每天拌料投喂rC/IFN總量為I μ g/g魚體重的劑量免疫草魚I d、2 d、5 d，發(fā)現(xiàn)連續(xù)投喂2 d的免疫組草魚的相對存活率最高。熒光定量PCR的結(jié)果也佐證了這一結(jié)果，r^/IFN可以顯著性地提高ISG的轉(zhuǎn)錄表達水平。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種重組草魚干擾素-白介素I 二聯(lián)蛋白的制備方法及應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中同時添加重組IFN和IL-1后，草魚成活率較之于單獨添加重組IFN或IL-1后提高更為顯著，雖然具體機制乃不十分清楚，但是IFN與IL-1之間的協(xié)同作用是產(chǎn)生這一結(jié)果的原因之一。而在飼料中添加IFN與IL-1的量及其精確比例也不容易把握。所以，本發(fā)明將IFN和IL-1同時構(gòu)建于pET-32a(+)上，表達IFN-1L-1新的重組蛋白，這種新的二聯(lián)蛋白能夠同時發(fā)揮IFN和IL-1的免疫功效。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。它包括如下步驟:
(1)草魚TZ-7基因的克??；
(2)構(gòu)建包含IFN和IL-1的聯(lián)合表達載體pET-32a(+)/CYIFN-1L-1；
(3)表達和純化重組二聯(lián)蛋白:將聯(lián)合表達載體pET-32a(+)/CYIFN-1L-1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS中，IPTG誘導(dǎo)表達重組蛋白IFN-1L-1并通過N1-NTA親和層析純化融合蛋白；
(4)測定重組蛋白的抗病毒活性(性質(zhì)的檢測)及其對草魚的免疫保護力。
[0008]本發(fā)明在草魚抗病毒上的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明所述的干擾素(IFN)的GenBank上的序列號為⑶139255。
[0010]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:本發(fā)明制備的重組草魚IFN-1L-1 二聯(lián)蛋白能夠同時發(fā)揮IFN和IL-1的免疫功效，克服了在飼料中分別添加IFN與IL-1的量及其精確比例等等不足，是一種高效、無毒的草魚抗病制劑，具有良好的經(jīng)濟效益和市場前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為pET-32a(+)/CYIFN-1L-1載體的構(gòu)建示意圖。
[0012]圖2為原核表達和純化IFN-1L-1的電泳圖。
[0013]圖3為攻毒實驗圖:草魚累計死亡率。
[0014]圖4為攻毒實驗圖:免疫保護率。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但所述實施例不以任何形式限制本發(fā)明。
[0016] 實施例1。[0017]重組草魚干擾素-白介素I 二聯(lián)蛋白的制備方法。
[0018](1)草魚7Z-7基因的克隆。
[0019]根據(jù)已知的草魚IL-1 的 cDNA 序列(GenBank accession N0.JX014320) Sii對引物IL-F(tatccatggctatggcatgcgaacg)(含Afco I)和6YIL-R(tcaggatcccttgttctccagtgtg)(含I)，以純化后的cDNA為模板進行PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體系:10 X Ex TaqBuffer 2.5 μ L, dNTP (2.5 mM) 1.0 μ L，引物各 0.5 μ L, cDNA 1.0 μ LjTaKaRa Ex Taqpolymerase (5 U/ μ L) 0.25 μ L,加滅菌 ddH20 至 25 μ L。反應(yīng)條件如下:94 °C預(yù)變性 5min，94 °C變性 30 sec, 58 °C退火 30 sec, 72 °C延伸 I min，72 1:繼續(xù)延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化上述擴增產(chǎn)物，于1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測純化效果O
[0020](2)包含IFN和IL-1的聯(lián)合表達載體構(gòu)建。
[0021]先構(gòu)建包含IFN 的表達載體 pET-32a(+)/C/IFN (Li DM, Lin G, Yu XJ,Huang SHj Lai QNj Liu Y， Wu ZQj Hu CY.1mmunoprotection of grass carp{Ctenopharyngodon i del la) with recombinant interferon (rCYIFN) against GCHVinfection.Aquaculture, 2013，388 - 391:42-48.)0
[0022]將上述純化后的PCR產(chǎn)物(IL-1)和pET_32a(+) /^iIFN表達質(zhì)粒分別用進行雙酶切，反應(yīng)體系:10XBuffer 2 μ L, Nco 1、BamH I各I μ L，目的基因或載體10 yL，加滅菌ddH20至20 UL0 750C 3 min滅活內(nèi)切酶，而后使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化目的DNA片段，I %瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0023]將IL-1與pET-32a(+)/C/IFN的酶切產(chǎn)物連接，連接反應(yīng)體系如下:10 X T4Ligation Buffer 2 “1^，酶切后的11^-1 9 μ L，酶切后的 pET_32a (+)/CYIFN 2 μ L, T4Ligase I yL，加滅菌ddH20至20 μ L0將連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5 α感受態(tài)細胞，熱激后涂布已加入40 μ I X-gal (4 mg/ ml)及4μ1 ITPG(40 mg/ml)的含Amp的LB平板，37°C培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落，菌落PCR反應(yīng)并測序驗證篩選得到的陽性克隆。
[0024]擴大培養(yǎng)陽性克隆，用質(zhì)粒小抽提試劑盒提取重組pET-3 2a (+) /CYIFN-1L-1質(zhì)粒，并將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3) pLysS感受態(tài)，37 1:恒溫培養(yǎng)，挑單克隆，菌液PCR檢測陽性克隆。
[0025]( 3 )重組二聯(lián)蛋白的表達。
[0026]將測序驗證正確的含重組pET_32a(+)/C/IFN-1L-1質(zhì)粒的大腸桿菌BL21 (DE3)pLysS按照I %的接種量接種于20 ml LB培養(yǎng)基中(含終濃度為50 μ g/ml Amp)，37 °C水浴培養(yǎng)約8 h，置于4 °C保存。200 μ I上述種子液接種于20 ml含終濃度為50 μ g/mlAmp的LB培養(yǎng)基中，37 °C水浴劇烈振蕩培養(yǎng)至0D600=0.6~0.8，加入終濃度約為I mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達4 h。取未誘導(dǎo)的菌液與誘導(dǎo)表達后的菌液各I ml，12 000 rpm離心
2min收集菌體。用50 μ I I X SDS Loading Buffer重新懸浮菌體,煮沸3~5 minl2 %SDS-PAGE電泳檢驗蛋白質(zhì)表達效果。
[0027](4)重組二聯(lián)蛋白的的純化。
[0028]大量誘導(dǎo):I %的接種量接種于200 ml的LB培養(yǎng)基(50 μ g/ml Amp)，37 °〇水浴振蕩培養(yǎng)至0D600=0.6~0.8，然后加入IPTG (終濃度約為I mmol/L)，誘導(dǎo)表達4 h。4100 g、4 °C離心 15 min 收集菌體，然后用 12 ml 冰預(yù)冷的 I XBinding Buffer (0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, 5 mmol/L imidazole, pH 7.9)重懸。超聲波破碎菌體后，12 000 g、4 °C離心30 min收集上清。經(jīng)N1-NTA親和層析獲得純化的融合蛋白。
[0029]蛋白透析:剪下合適長度的透析袋(MW: 8000-14400)，先在50 ml透析緩沖液(20% 甘油，150 mmol/L NaCl, I mmol/L DTT, 0.5 mmol/L EDTA, 20 mmol/L HEPES, pH7.5)中平衡約3 h，然后將洗脫收集的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋，置于I L透析緩沖液中，4°C透析過夜。12 % SDS-PAGE檢測蛋白質(zhì)純化效果。純化蛋白_20°C保存。
[0030]實施例2。
[0031]重組草魚IFN-1L-1蛋白的效價測定。
[0032](I)草魚出血病病毒(GCHV)的滴度測定:通過常規(guī)性的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法(50% tissue culture infectious dose assay, TCID50)測定 GCHV 的滴度。
[0033](2)效價的測定:在96孔細胞培養(yǎng)板中接種CIK細胞，28 °C培養(yǎng)15 h，生長繁殖至單層細胞鋪滿孔底，以初始蛋白濃度為750 μ g/mL的實施例1中純化后的重組蛋白作連續(xù)10倍梯度稀釋刺激細胞，每個稀釋梯度設(shè)置8個復(fù)孔，28°C繼續(xù)培養(yǎng)6 h，隨后加入1.0X IO4 5 TCID5Q/mL劑量的GCHV感染CIK細胞，至病毒感染對照組細胞(未經(jīng)蛋白處理)出現(xiàn)明顯的細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)。在梯次稀釋度中，以仍能保護半數(shù)細胞免受攻擊病毒損害的最高稀釋度的倒數(shù)為重組蛋白的效價，并以U/yg作為其量化衡量單位。
[0034]實施例3。
[0035]重組草魚IFN-1L-1抗草魚出血病病毒GCHV的免疫保護效果。
[0036](I)重組草魚IFN-1L-1對CIK細胞的保護。
[0037]A、MTT工作液配制:稱取50 mg MTT粉末，將其充分溶解于10 mL的PBS(0.01 mol/L, pH7.4)中，用0.22 μπι的微孔濾器無菌操作，過濾除菌。
[0038]B、收集CIK細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100 μ L，調(diào)整待測細胞密度至1000^10000/孔(邊緣孔用無菌PBS填充)。
[0039]C、28 °C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，至96孔平底板的單層細胞鋪滿孔底，加入系列10倍稀釋濃度梯度(10-f 10-8)的實施例1中純化蛋白溶液:每孔100 μ L，設(shè)置8個復(fù)孔。同時設(shè)置陰性對照組。28 °C繼續(xù)培養(yǎng)4 h，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。
[0040]D、每孔加入100 μ L上述GCHV 10倍稀釋液，28 1:繼續(xù)培養(yǎng)2 h。每孔加入25UL MTT溶液(5 mg/mL), 28 1:繼續(xù)培養(yǎng)4h。終止培養(yǎng)，用醫(yī)用I mL的針管小心吸棄培養(yǎng)液。
[0041] E、每孔加入100 μ L DMSO,置96孔板于搖床上低速振蕩10 min,以充分溶解紫色結(jié)晶物甲瓚(formazan)。以570 nm為測試波長，630 nm為參考波長，在酶標(biāo)儀上檢測各孔吸光值。
[0042]F、按下列公式計算相對細胞存活率:細胞存活率(%)=(實驗組OD57tlnm—空白對照組OD57tlJ / (陰性對照組OD57tl M —空白對照組OD57tl ?) X 100%。
[0043](2)重組草魚IFN-1L-1對草魚的免疫保護。
[0044]將適養(yǎng)2周后的健康草魚經(jīng)腹腔注射(intraperitoneal injection, ip)或拌料投喂(口服)rC/IFN免疫草魚，而后對其進行GCHV攻毒實驗。為方便實驗，所有草魚在實驗前均將其放在含0.005 % MS-222的水腫進行麻醉處理。[0045]A、腹腔注射免疫組。將適養(yǎng)2周后的健康草魚隨機分為四組，每組20余尾。其中有3組為免疫組，另設(shè)I組為對照組。3個免疫組經(jīng)腹腔注射100 μ L實施例1中純化蛋白溶液免疫草魚，其中蛋白用量用量分別為0.1、I和10 μ g/g魚體重?？瞻讓φ兆⑸湎嗤w積的PBS。24 h后進行GCHV攻毒實驗。
[0046]B、口服免疫組。將實施例1中純化蛋白溶液與市售顆粒飼料相混合后每天定點定量投喂給受試草魚，重組蛋白原液以PBS稀釋成合適濃度，每天投喂飼料總量為魚體重的I%左右，且每克魚體重攝入1//^.的蛋白總量。分別連續(xù)投喂1、2和5 d。對照組草魚投喂同等質(zhì)量的混有PBS的同種市售顆粒飼料。
[0047]C、GCHV攻毒實驗。腹腔注射免疫組的草魚在注射重組草魚IFN-1L-1后24 h、口服免疫組草魚在連續(xù)投喂免疫不同天數(shù)后，每尾草魚均行腹腔注射100 UL GCHVd X 104.5TCID50/mL)進行人工染毒處理。
[0048]D、數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計分析。攻毒實驗結(jié)束后每天觀察草魚的染病情況，一發(fā)現(xiàn)有死亡個體立即撈出。每組草魚觀察記錄21 d。每個實驗重復(fù)2次，以盡可能減小實驗偏差。相對存活率(relative percentage survival, RPS)的計算方法是:RPS = [I — (rCYIFN免疫組死亡百分數(shù)/對照組死亡百分數(shù))]X 100 %。采用Mann-Whitney U檢驗方法檢測群組之間的數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學(xué)上是否具有顯著性意義。ρ〈 0.05和？〈 0.01表示數(shù)據(jù)組之間的差異分別具有顯著 性和極顯著意義。
【權(quán)利要求】
1.一種重組草魚干擾素-白介素I 二聯(lián)蛋白的制備方法，其特征是包括如下步驟: (1)草魚TZ-7基因的克隆； (2)構(gòu)建包含IFN和IL-1的聯(lián)合表達載體pET-32a(+)/CYIFN-1L-1； (3)表達和純化重組二聯(lián)蛋白:將聯(lián)合表達載體pET-32a(+)/CYIFN-1L-1轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS中，IPTG誘導(dǎo)表達重組蛋白IFN-1L-1并通過N1-NTA親和層析純化融合蛋白。
2.權(quán)利要求 1所述的重組草魚干擾素-白介素I二聯(lián)蛋白在草魚抗病毒上的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/70GK103936861SQ201410071528
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】胡成鈺, 吳初新, 李東明 申請人:南昌大學(xué)