一種水稻蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用為由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在如下a1）或a2）中的應(yīng)用：a1）調(diào)控植物抗旱性；a2）選育抗旱性提高的植物品種。本發(fā)明利用可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將所述蛋白子的編碼基因（OsFLP基因）導(dǎo)入水稻細(xì)胞進(jìn)行過量表達(dá)，或?qū)sFLP基因表達(dá)進(jìn)行干擾，可改變轉(zhuǎn)基因植株對干旱的耐受能力。本發(fā)明對于植物耐旱的分子機(jī)制的研究，植物抗逆性品種的選育具有重要的理論及實(shí)際意義。
【專利說明】一種水稻蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種水稻蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著全球氣候變化，非生物脅迫對植物生長的影響已經(jīng)成為人類面臨的重大挑戰(zhàn)之一，嚴(yán)重制約著植物的生長和發(fā)育，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中直接造成作物減產(chǎn)。非生物脅迫是指在特定環(huán)境下，任何非生物因素對植物所造成的不利影響，包括干旱、低溫、鹽堿等因素，其中干旱是制約植物生長的一個(gè)最主要的脅迫因素。而水稻是目前全世界最重要的糧食作物之一，是全世界56%人口的主食。據(jù)統(tǒng)計(jì)非生物脅迫中的干旱脅迫對水稻造成的減產(chǎn)已經(jīng)是其他因素造成減產(chǎn)的總和，因此提高水稻的耐干旱能力已經(jīng)是現(xiàn)代社會解決的關(guān)鍵問題。研究水稻在干旱脅迫下的功能基因調(diào)節(jié)及脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理已成為當(dāng)今最熱點(diǎn)的課題之一，通過基因工程技術(shù)與突變體篩選培育手段獲得非生物脅迫耐受性相關(guān)的基因品種對提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有十分重要的實(shí)踐意義。
[0003]水稻(Oryzasativa L.)成為繼擬南芥(Arabidopsis thaliana)之后的另外一類重要的模式植物，它比其他作物如玉米、小麥等的基因組小，基因組長度大約為420萬堿基對，估計(jì)約有2-4萬個(gè)表達(dá)基因。到目前為止參與非生物脅迫應(yīng)答響應(yīng)的很多基因已經(jīng)被研究報(bào)道，根據(jù)功能將其分為以下幾類:(I)滲透保護(hù)大分子，包括氨基酸類物質(zhì)、胺類物質(zhì)、糖和糖醇類物質(zhì)。與這些大分子合成相關(guān)的基因被認(rèn)為對植物非生物脅迫響應(yīng)有作用。(2)胚胎發(fā)育后期豐富蛋白(Late Embryogenesis Abundant Proteins, LEA),過量表達(dá)該類基因可以有效的提高植物對干旱和高鹽的耐受性。(3)抗氧化基因，植物受到非生物脅迫后，體內(nèi)的活性氧化物(Reactive Oxygen Species, R0S)含量上升,從而對植物細(xì)胞造成傷害。清除ROS的系統(tǒng)可有效清除細(xì)胞內(nèi)R0S，已有研究與ROS清除相關(guān)的基因編碼蛋白包括，超氧化物歧化酶(S0D)、抗壞 血酸過氧化物酶(APX)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶(GR)、單脫氫抗壞血酸還原酶等。(4)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，調(diào)控膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)是提高鹽脅迫的重要手段。如擬南芥中的Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的AtNHXl基因及SOS信號途徑中的SOSl (Salt Overly-Sensitivel)同樣編碼質(zhì)膜Na+/H+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。(5)轉(zhuǎn)錄因子，是在逆境脅迫信號途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用的調(diào)節(jié)蛋白。與脅迫響應(yīng)基因表達(dá)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族bZIP、MYC/MYB、HD-Zip、Zn finger和ABI3/VP1家族。(6)蛋白激酶，蛋白磷酸化是一種重要的蛋白翻譯后修飾，這種作用在植物應(yīng)答非生物脅迫中起著重要作用。如MPK3和MPK6以及S0S2 (Salt Overly Sensitive〗)。(7)激素信號，激素合成及信號途徑是傳遞脅迫信號的到胞內(nèi)的重要過程。包括ABA，生長素，茉莉酸和水楊酸。(8)miRNA，是一類具有20個(gè)左右核苷酸長度的RNA分子，它們能為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RNA-1nducedsilencing complex, RISC)提供底物特異性,從而調(diào)節(jié)祀基因的表達(dá)，在非生物脅迫中起到重要作用。如此眾多類型的調(diào)控非生物脅迫響應(yīng)的途徑已經(jīng)被揭示，由于多數(shù)是在擬南芥中進(jìn)行研究，而在大田作物中的研究還較為匱乏，因此進(jìn)一步在水稻中挖掘和探索與非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的新基因是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種水稻蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物抗旱性中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明所提供的應(yīng)用，具體為由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(命名為OsFLP蛋白)或其編碼基因(命名為OsFLP基因)在如下al)或a2)中的應(yīng)用:
[0006]al)調(diào)控植物抗旱性；
[0007]a2)選育抗旱性提高的植物品種。
[0008]在上述al)中，所述調(diào)控植物的抗旱性，具體體現(xiàn)在:所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的OsFLP蛋白在所述植物中的表達(dá)量越低，所述植物的抗旱性越弱；所述由序列表中序列2所不的氣基酸序列組成的OsFLP蛋白在所述植物中的表達(dá)量越聞，所述植物的抗旱性越強(qiáng)。
[0009]在上述a2)中，在實(shí)際應(yīng)用中，當(dāng)所選育的植物品種為抗旱性強(qiáng)的植物品種時(shí)，需將所述OsFLP蛋白表達(dá)量較高的植株作為親本進(jìn)行雜交。當(dāng)所選育的植物品種為抗旱性低的植物品種時(shí)，需將所述OsFLP蛋白表達(dá)量較低的植株作為親本進(jìn)行雜交。
[0010]所述OsFLP蛋白或其編碼基因在調(diào)控植物體內(nèi)干旱脅迫響應(yīng)基因表達(dá)量中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011]所述調(diào)控植物體`內(nèi)干旱脅迫響應(yīng)基因表達(dá)量，具體體現(xiàn)在:當(dāng)所述植物體內(nèi)的所述OsFLP蛋白或其編碼基因表達(dá)量增高時(shí)，所述干旱脅迫響應(yīng)基因的表達(dá)量會相應(yīng)增高。
[0012]所述干旱脅迫響應(yīng)基因可為如下中的至少一種:0sLEA3基因、0sDREB2A基因和0sNAC6 基因。
[0013]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0014]本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可為如下(A)或(B):
[0015](A)培育抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:
[0016]a)向目的植物中導(dǎo)入由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物；
[0017]b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物；
[0018]所述抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物中所述OsFLP蛋白的表達(dá)量高于所述目的植物。
[0019](B)培育抗旱性降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:
[0020]c)在目的植物中對由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因進(jìn)行抑制表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植物；
[0021]d)從步驟c)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，抗旱性降低的轉(zhuǎn)基因植物；
[0022]所述抗旱性降低的轉(zhuǎn)基因植物中所述OsFLP蛋白的表達(dá)量低于所述目的植物。
[0023]在上述應(yīng)用或方法中，所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)(OsFLP蛋白)的編碼基因(OsFLP基因)是如下I)至3)中任一所述的核苷酸序列:
[0024]I)序列表中序列I所示的核苷酸序列；
[0025]2)在嚴(yán)格條件下與I)所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；
[0026]3)與I)或2)所限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
[0027]上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，
0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。
[0028]其中，序列I由1617個(gè)脫氧核苷酸組成，為所述OsFLP基因的cDNA序列，整個(gè)序列即為編碼序列(ORF);編碼具有序列表中序列2的氣基酸殘基序列的蛋白質(zhì)(OsFLP蛋白)，序列2由538個(gè)氨基酸殘基組成。
[0029]在上述方法(A)中，所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因具體可通過含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中。
[0030]在上述方法(B)中，所述在目的植物中對由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因進(jìn)行抑制表達(dá)，可為任何可降低所述目的植物中所述OsFLP基因的表達(dá)的方法。
[0031]在本發(fā)明中，所述在目的植物中對由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因進(jìn)行抑制表達(dá)，具體是通過將如下式(I)所示的DNA片段轉(zhuǎn)入所述目的植物中實(shí)現(xiàn)的:
[0032]SEQ正向-X-SEQ反向(I)
[0033]所述SEQ挪是序列表中序列3的第13-241位核苷酸；
[0034]所述SEQ的序列與所述序列反向互補(bǔ)；
[0035]所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQIE向及所述SEQ反向均不互補(bǔ)。
[0036]在本發(fā)明中，所述式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列3的第13-800 位。
[0037]序列3由1044個(gè)核苷酸組成。其中，第13-241位為所述OsFLP基因的一個(gè)片段的正向序列(對應(yīng)上述式(I)中的SEQ1^1，與序列表中序列I的第117-345位一致)，第269-555位為內(nèi)含子核苷酸序列，對應(yīng)上述式(I)中的X，第572-800位為所述OsFLP基因的一個(gè)片段的反向序列(對應(yīng)上述式(I)中的SEQfi^1，為序列表中序列I的第117-345位的反向互補(bǔ)序列)。
[0038]在上述方法(A)中，所述重組表達(dá)載體可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN 或其它衍生植物表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，例如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子、泛素基因Ubiquitin啟動子(pUbi)、脅迫誘導(dǎo)型啟動子RD29A等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用重組表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。也可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0039]進(jìn)一步，所述重組表達(dá)載體中啟動所述編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為35S啟動子，如花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述重組過表達(dá)載體具體為在PH7WG2D.1載體的attRl和attR2之間插入所述OsFLP基因后得到的重組質(zhì)粒。
[0040]在上述方法(B)中，所述式(I)所示的DNA片段是通過RNA干擾表達(dá)載體的形式轉(zhuǎn)入所述目的植物中的；所述RNA干擾表達(dá)載體上啟動所述式(I)所示的DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動子單子葉植物玉米的泛素基因Ubiquitin啟動子。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述RNA干擾表達(dá)載體具體為在pCAMBIAl301-Ubi的多克隆位點(diǎn)處插入所述OsFLP基因的RNA干擾序列(序列3的第7-1038位)后得到的重組質(zhì)粒。
[0041]在上述培育轉(zhuǎn)基因植物的方法(A)和方法(B)中，將攜帶有所述OsFLP基因的所述重組過表達(dá)載體或所述OsFLP基因片段的所述RNA干擾表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物，具體可為:通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。
[0042]在上述各應(yīng)用或各方法中，所述植物即可為單子葉植物，也可為雙子葉植物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述植物具體為單子葉植物水稻，如水稻品種中花11。
[0043]如下式(I)所示的DNA片段也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:
[0044]SEQ正向-X-SEQ 反向(I)
[0045]所述SEQ挪是序列表中序列3的第13-241位核苷酸；
[0046]所述SEQg的序列與所述序列反向互補(bǔ)；
[0047]所述X是所述SEQm與所述SEQg之間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQIE向及所述SEQ反向均不互補(bǔ)；
[0048]所述DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中的序列3的第13-800位。
[0049]含有所述DNA片段的重組載體、重組菌、表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0050]所述重組載體既可以為重組表達(dá)載體，也可以為重組克隆載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組表達(dá)載體中啟動所述RNA干擾序列轉(zhuǎn)錄的啟動子為單子葉植物玉米的泛素基因Ubiquitin啟動子。具體的，所述重組表達(dá)載體為在pCAMBIA1301_Ubi載體的多克隆位點(diǎn)處插入所述OsFLP基因的RNA干擾序列(序列3的第7-1038位)后得到的重組質(zhì)粒；更為具體的，所述RNA干擾表達(dá)載體是按照包括如下步驟的方法制備:用Kpn I和Sac I酶切序列表中序列3所示DNA片段，回收酶切片段后與經(jīng)過同樣雙酶切的pCAMBIA1301-Ubi載體的骨架大片段相連，得到所述重組表達(dá)載體。
[0051]本發(fā)明利用可以引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將OsFLP基因?qū)胨炯?xì)胞進(jìn)行過量表達(dá)，或?qū)sFLP基因表達(dá)進(jìn)行干擾，可改變轉(zhuǎn)基因植株對干旱的耐受能力。本發(fā)明對于植物耐旱的分子機(jī)制的研究，植物抗逆性品種的選育具有重要的理論及實(shí)際意義?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0052]圖1為水稻OsFLP基因表達(dá)模式分析。
[0053]圖2為水稻OsFLP基因受到干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)情況。
[0054]圖3為水稻OsFLP基因全長cDNA的擴(kuò)增結(jié)果。其中，M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:水稻OsFLP基因全長cDNA的擴(kuò)增條帶。
[0055]圖4為T1代OsFLP轉(zhuǎn)基因水稻的表達(dá)量分析結(jié)果。
[0056]圖5為T1代OsFLP轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性分析結(jié)果。其中，A為植株表型；B為植株存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
[0057]圖6為T1代OsFLP轉(zhuǎn)基因水稻干旱脅迫相關(guān)基因表達(dá)情況。
[0058]圖7為水稻OsFLP基因RNAi序列的擴(kuò)增結(jié)果。其中，M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:水稻OsFLP基因RNAi序列的擴(kuò)增條帶。
[0059]圖8為OsFLP基因RNAi水稻株系中OsFLP基因的相對表達(dá)量檢測結(jié)果。其中，#5、#6、#7、#12、#15、#23 和 #24 分別表示 T1 代 OsFLP 基因 RNAi 水稻株系 0sFLP_RNAi#5、0sFLP-RNAi#6、 0sFLP_RNAi#7、 0sFLP_RNAi#12、 0sFLP_RNAi#15、 0sFLP-RNAi#23 和0sFLP-RNAi#24。
[0060]圖9為OsFLP基因RNAi水稻株系生長5天和25天的植株表型。其中，A為生長5天；B為生長25天。
[0061]圖10為OsFLP基因RNAi`水稻株系的抗旱性分析結(jié)果。A為植株表型；B為植株存活率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0062]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0063]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0064]水稻(Oryza.sativa L.)品種中花11:商業(yè)途徑可購買，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所選育，在“謝道昕，范云六，倪丕沖等.蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因?qū)胫袊耘嗨酒贩N中花11號獲得轉(zhuǎn)基因植株.中國科學(xué)(B輯化學(xué)生命科學(xué)地學(xué))，1991年08期”一文中有記載。
[0065]PHT7WG2D.1 質(zhì)粒:記載于“GATEWAY vectors for Agrobacterium-mediated planttransformation, Trends in Plant Science; 7 (5): 193-5”一文，公眾可從中國科學(xué)院植物
研究所獲得。
[0066]pCR8/GW/T0P0載體:Invitrogen公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為K2500-20。
[0067]pBIntron 載體:在 Liu Y, Cui S，Wu F，Yan S，Lin X, Du X, Chong K, SchillingS，Theissen G, Meng Z (2013) Functional conservation of MIKO-Type MADS box genesin Arabidopsis and rice pollen maturation.Plant Cell25:1288-1303 —文中有記載，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。
[0068]pCAMBIA1301-Ubi 載體:在 Cui R, Han J, Zhao S，Su K, Wu F，Du X，Xu Q, ChongK,Theissen G, Meng Z (2010)Functional conservation and diversification of classE floral homeotic genes in rice (Oryza sativa).Plant J61:767-781一文中有記載，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。[0069]根癌農(nóng)桿菌H1105:記載于“秦永華，張上隆.影響根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的豐香草莓遺傳轉(zhuǎn)化因素分析.核農(nóng)學(xué)報(bào)，2007年05期”一文中，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。
[0070]實(shí)施例1、水稻OsFLP表達(dá)模式分析
[0071]本實(shí)施例中所涉及的水稻OsFLP基因的cDNA序列如序列表中序列I所示，序列I由1617個(gè)核苷酸組成，其中第1-1617位為編碼序列(ORF);序列2編碼序列表中序列I所示的蛋白質(zhì)(OsFLP蛋白)，序列2由538個(gè)氨基酸殘基組成。
[0072]1、水稻OsFLP基因表達(dá)模式分析
[0073]收集水稻(Oryza sativa L.)品種中花11的不同組織材料,包括幼苗葉片、成熟葉片、根和花。將以上材料用TRizol (Invitrogen公司產(chǎn)品)提取其總RNA，經(jīng)甲醛變性RNA瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。將鑒定合格的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照ReverseTranscription System (Promega公司產(chǎn)品)的使用說明操作。以所得cDNA為模板,用引物I和引物2對OsFLP基因的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，以O(shè)sACTIN為內(nèi)參，所用引物為引物3和引物4。
[0074]引物1:5’ -AGTTCTTGGGAACAAATGGAC-3’(序列 I 的第 294-314 位)；
[0075]引物2:5’-TGTACCAATGCCCTCTTTGA-3’(序列 I 的第 445-464 位的反向互補(bǔ)序列)；
[0076]引物3:5，-GGATCCATCTTGGCATCTCTCA-3，；
[0077]引物4:5 ’ -GGGCCAGACTCGTCGTACTC-3，。
[0078]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系:正向引物(10 μ Μ)0.5 μ L，反向引物(10 μ Μ)0.5 μ L，2X SYBR Premix Ex taq7.5 μ L，cDNA 模板 I μ L，補(bǔ)充滅菌超純水至 15 μ L。其中，2X SYBRPremix Ex taq為TaKaRa公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為RR820A。
[0079]實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序:三步法:預(yù)變性95°C 30s;變性95°C 15s，退火58°C 15s，延伸 72°C 20s，循環(huán)數(shù) 40 次。
[0080]數(shù)據(jù)處理:獲得不同樣品的Ct值(對數(shù)期設(shè)定的熒光閾值所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù))，根據(jù)公式計(jì)算X4tl=XtlXZn計(jì)算出40個(gè)循環(huán)后擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量，起始模板數(shù)量Xtl設(shè)定為1，η為內(nèi)參基因與目標(biāo)基因Ct差值。
[0081]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0082]結(jié)果如圖1所示，可見OsFLP基因在幼苗葉片、成熟葉片，根和花中均有表達(dá)，并且在成熟葉片中表達(dá)量最高，幼苗葉片和花中次之，根中表達(dá)量最少。
[0083]2、水稻OsFLP基因在干旱處理后表達(dá)模式分析
[0084]將生長2周的水稻(Oryza sativa L.)品種中花11的幼苗置于20% (20g/100mL)PEG4000溶液中處理0h、2h、6h、12h后提取植物總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后針對OsFLP基因進(jìn)行qRT-PCR檢測。具體操作參照步驟I進(jìn)行。
[0085]結(jié)果如圖2所示，OsFLP基因受到干旱脅迫后瞬時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)6小時(shí)OsFLP基因表達(dá)量得到最高值。
[0086]實(shí)施例2、OsFLP轉(zhuǎn)基因水稻的獲得及功能鑒定
[0087]本實(shí)施例中所涉及的水稻OsFLP基因的cDNA序列如序列表中序列I所示，序列I由1617個(gè)核苷酸 組成，其中第1-1617位為編碼序列(ORF);序列I編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)(OsFLP蛋白)，序列2由538個(gè)氨基酸殘基組成。
[0088]1、重組表達(dá)載體 Super_pH7WG2D.1-OsFLP 的構(gòu)建[0089]以pH7WG2D.1質(zhì)粒為骨架載體，采取Gateway方法構(gòu)建重組表達(dá)載體Super-pH7WG2D.1-OsFLP，具體如下:
[0090](I) OsFLP-TOPO 載體的構(gòu)建
[0091]以水稻(Oryza.sativa L.)品種中花11的幼苗為材料，取100_200mg，用TRizol(Invitrogen公司產(chǎn)品)提取其總RNA，經(jīng)甲醛變性RNA瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。將鑒定合格的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照Reverse Transcription System (Promega公司產(chǎn)品)的使用說明操作。
[0092]OsFLP基因擴(kuò)增條件如下，將合成的cDNA稀釋10倍，作為以下PCR反應(yīng)的模板:采用Τ0Υ0Β0公司的高保真DNA聚合酶KOD-Plus，以引物5和引物6對OsFLP基因cDNA全長進(jìn)行擴(kuò)增。
[0093]引物5:5’ -ATGGCGACCGGACCCGATCTG-3’(序列 I 的第 1-21 位)；
[0094]引物6:5’-TCATAGGCTATTAAGGAGAGC-3’(序列 I 的第 1597-1617 位的反向互補(bǔ)序列)。
[0095]擴(kuò)增體系(50μL):10XK0D buffer5 μ L, 2mM dNTP mix5 μ L，10 μ M 引物 5 和引物6各1.5 μ L，KOD-Plus DNA聚合酶0.5 μ L，cDNA模板1-5 μ L,補(bǔ)充滅菌超純水至50 μ L。反應(yīng)體系在冰上進(jìn)行操作。
[0096]BIO-RAD PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，54°C 30s, 68°C 2min，循環(huán)數(shù) 32 個(gè)；68°C延伸 lOmin。
[0097]將擴(kuò)增片段用I % 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(圖3)，回收擴(kuò)增片段，連接到pCRS/GW/Τ0Ρ0捐獻(xiàn)載體上，得到重組載體。送樣測序，將經(jīng)測序正確且在pCR8/GW/T0P0質(zhì)粒的aatLl和aatL2之間正向插入序列表中序列I所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為0sFLP-T0P0。
[0098](2)重組表達(dá)載體 Super_pH7WG2D.1-OsFLP 的構(gòu)建
[0099]將步驟(1)中構(gòu)建好的OsFLP-TOPO捐獻(xiàn)載體，用限制性內(nèi)切酶Pvu I在37°C條件下，酶切3小時(shí)，把酶產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離，切膠回收。取回收產(chǎn)物1.5μ L，pH7WG2D.1 質(zhì)粒 0.5 μ L 及 Gateway LR Clonase II enzyme mix (invitron 公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號為11791-020)0.5 μ L混合，于25°C反應(yīng)4小時(shí)。終止反應(yīng)后，將混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5ci，得到單菌落克隆，對單菌落進(jìn)行繁殖并提取質(zhì)粒。采用引物5和引物6對所得重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步將經(jīng)PCR鑒定初步判定正確的重組質(zhì)粒(PCR產(chǎn)物大小約為1617bp)，送樣測序，將經(jīng)測序正確表明在pH7WG2D.1質(zhì)粒的aatLl和aatL2之間正向插入序列表中序列I所不DNA片段的重組質(zhì)粒命名為Super-pH7WG2D.1-OsFLP。
[0100]在重組表達(dá)載體Super-pH7WG2D.1-OsFLP中，啟動序列I所示DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動子為花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動子。
[0101]2、含有OsFLP基因的重組表達(dá)載體異源轉(zhuǎn)化水稻品種中花11
[0102]將步驟I獲得的重組質(zhì)粒Super_pH7WG2D.1-OsFLP采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，即將I μ L質(zhì)粒加入100 μ L ΕΗΑ105感受態(tài)細(xì)胞中混勻，冰上放置5min后轉(zhuǎn)入預(yù)冷無菌的電轉(zhuǎn)杯中，利用基因?qū)雰x進(jìn)行轉(zhuǎn)化，條件為電壓1.8kV，脈沖5ms，然后迅速加入ImL LB培養(yǎng)基，280C，200rpm搖菌1.5h，取100 μ L菌液涂布含有50 μ g/mL利福平和壯觀霉素的LB平板，28 °C生長2天。對轉(zhuǎn)化后的重組農(nóng)桿菌用由引物5和引物6組成的引物對進(jìn)行PCR鑒定，將經(jīng)鑒定表明含有OsFLP基因(PCR目的條帶大小為1617bp)的重組農(nóng)桿菌命名為EH105/Super-pH7WG2D.1-OsFLP。同時(shí)設(shè)置向根癌農(nóng)桿菌H1105中轉(zhuǎn)入pH7WG2D.1空載體的對照，將轉(zhuǎn)入PH7WG2D.1空載體的重組農(nóng)桿菌命名為EH105/pH7WG2D.1。
[0103]將以上所得兩種重組農(nóng)桿菌(EH105/Super-pH7WG2D.1-OsFLP 或 H1105/PH7WG2D.1)侵染水稻品種中花11愈傷組織(參考文獻(xiàn):Hiei Y, Ohta S，KomariT, Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediatedbyAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T—DNA.The PlantJournal6:271-282),經(jīng)過共培養(yǎng)、除菌、抗生素篩選和分化，收獲T1代種子。將T1代種子在含有25 μ g/ μ L潮霉素(AMRESC0公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為Κ547-20，規(guī)格25mg/mL)的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，得到根和葉均能生長的抗性T1代轉(zhuǎn)化植株。
[0104]3、OsFLP轉(zhuǎn)基因水稻的分子鑒定
[0105]從步驟2獲得的T1代OsFLP轉(zhuǎn)基因水稻，以及轉(zhuǎn)入pH7WG2D.1空載體的對照植株中分別提取基因組DNA。
[0106]對于1'1代08?1^轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)入？!171620.1空載體的對照植株，均采用針對GFP基因的引物?和引物8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)鑒定得到大小約為580bp的目的條帶的植株為陽性水稻植株。
[0107]引物7:5’ -CGACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’ ；
[0108]引物8:5，-CTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCA-3，。
[0109]將經(jīng)上述鑒定陽性的T1代OsFLP轉(zhuǎn)基因陽性水稻植株中隨機(jī)選取4個(gè)株系，分別記為 0sFLP-0E#l，0sFLP-0E#2，0sFLP-0E#2 和 0sFLP_0E#4。以上植株在含 25 μ g/ μ L 潮霉素溶液中生長2周后，取能正常生長的水稻幼苗提取植物總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后針對OsFLP基因利用引物I和引物2進(jìn)行qRT-PCR檢測，具體操作參照實(shí)施例1步驟I進(jìn)行。
[0110]結(jié)果如圖4所示，0sFLP-0`E#l和0sFLP_0E#4轉(zhuǎn)基因陽性水稻株系OsFLP基因表達(dá)量與空載體的對照植株相比增高，而0sFLP-0E#4株系表達(dá)量增高值最大，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)將采用0sFLP-0E#l和0sFLP-0E#4兩個(gè)轉(zhuǎn)基因陽性水稻株系。
[0111]4、T1代OsFLP轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱性分析
[0112]獲得的T1代OsFLP轉(zhuǎn)基因水稻株系0sFLP-0E# I和0sFLP_0E#4、未轉(zhuǎn)基因的水稻(Oryza sativa L.)品種中花11和向水稻(Oryza sativa L.)品種中花11中轉(zhuǎn)入PH7WG2D.1空載體的對照植株為實(shí)驗(yàn)材料。用于實(shí)驗(yàn)的每種材料的植株數(shù)為60株。
[0113]將各實(shí)驗(yàn)材料的種子播種成苗后，將其栽培至土壤中正常生長25天，然后停止?jié)菜?5天，復(fù)水一周后觀察各植株的表型并照相。同時(shí)設(shè)置未經(jīng)干旱處理的對照組。
[0114]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，定量數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值。
[0115]結(jié)果顯示:
[0116]干旱處理組中，未轉(zhuǎn)基因的水稻(Oryza sativa L.)品種中花11大部分發(fā)黃并萎焉死亡，而步驟3獲得的T1代OsFLP轉(zhuǎn)基因水稻株系0sFLP-0E#4多數(shù)存活(圖5中A)。進(jìn)一步，對存活的水稻植株進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如圖5中B所示,未轉(zhuǎn)基因的水稻(Oryza sativa L.)品種中花11存活率達(dá)到40%左右，而步驟3獲得的T1代OsFLP轉(zhuǎn)基因水稻株系0sFLP_0E#4存活率均在70%左右，顯著高于中花11 (P〈0.05)。而向水稻(Oryza sativa L.)品種中花11中轉(zhuǎn)入pH7WG2D.1空載體的對照植株，其植株表型及存活率與未轉(zhuǎn)基因的水稻(Oryzasativa L.)品種中花11基本一致，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。[0117]未經(jīng)干旱處理的對照組，所有植株均正常生長。
[0118]以上結(jié)果表明OsFLP基因能明顯增強(qiáng)水稻對干旱的耐受性。
[0119]5、T1代OsFLP轉(zhuǎn)基因水稻中干旱脅迫相關(guān)基因的表達(dá)分析
[0120]以步驟2獲得的T1代OsFLP轉(zhuǎn)基因水稻株系0sFLP_0E#4、未轉(zhuǎn)基因的水稻(Oryzasativa L.)品種中花11和向水稻(Oryza sativa L.)品種中花11中轉(zhuǎn)入pH7WG2D.1空載體的對照植株為實(shí)驗(yàn)材料。以上植株在含25 yg/ μ L潮霉素溶液中生長2周后,取能正常生長的水稻幼苗提取植物總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后針對OsFLP、0sLEA3、0sDREB2A和0sNAC6基因分別利用引物I和引物2、引物9和引物10、引物11和引物12和引物13和引物14，進(jìn)行qRT-PCR檢測，以O(shè)sACTIN為內(nèi)參，所用引物為引物3和引物4。具體操作參照實(shí)施例1步驟I進(jìn)行。
[0121]引物9:5 ’ -CGGCAGCGTCCTCCAAC-3，；
[0122]引物10:5，-CGGTCATCCCCAGCGTG-3，。
[0123]引物11:5’ -GCTGCACATCAGCACCTTCA-3’ ；
[0124]引物12:5 ’ -TCCTGCACCTCAGGGACTAC-3 ’。
[0125]引物13:5，-CTGTACGGAGAGAAGGAGTGG-3，；
[0126]引物14:5，-GTGCATGATCCAGTTGGTCT-3，。
[0127]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，`定量數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值。
[0128]結(jié)果顯示:與中花11和向水稻(Oryza sativa L.)品種中花11中轉(zhuǎn)入pH7WG2D.1空載體的對照植株相比，在0sFLP_0E#4轉(zhuǎn)基因水稻(Oryza sativa L.)品種中，干旱脅迫響應(yīng)基因0sLEA3、0sDREB2A和0sNAC6基因表達(dá)量均增加，結(jié)果如圖6所示。以上結(jié)果表明過表達(dá)OsFLP基因明顯增強(qiáng)水稻抗旱性與增加脅迫相關(guān)基因的表達(dá)相關(guān)。
[0129]實(shí)施例3、OsFLP基因RNAi水稻植株的獲得及功能鑒定
[0130]本實(shí)施例中所涉及的水稻OsFLP基因的cDNA序列如序列表中序列I所示,序列I由1617個(gè)核苷酸組成，其中第1-1617位為編碼序列(ORF);序列I編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)(OsFLP蛋白)，序列2由538個(gè)氨基酸殘基組成。
[0131]1、RNAi 表達(dá)載體 0sFLP-pCAMBIA1301-Ub1-RNAi 的構(gòu)建
[0132]根據(jù)序列表中序列I設(shè)計(jì)如下RNAi引物序列:
[0133]引物15:5’ -GGGGTACCTCTAGATGTGCTTCGTACTCAAATTGC-3’ (下劃線處依次為酶切位點(diǎn)Kpn I和Xba I的識別序列，其后為序列I的第117-137位)；
[0134]引物16:5’ -GGGTCGACCCCGGGAGTTCTGCCTGAGACAACCTT-3’ (下劃線處依次為酶切位點(diǎn)Sal I和Sma I的識別序列，其后為序列I的第325-345位的反向互補(bǔ))。
[0135]以序列表中的序列I為模板，用引物15和引物16在BIO-RAD PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，54°C 30s, 68°C 30s，循環(huán)數(shù)32個(gè)；68°C延伸lOmin。將擴(kuò)增片段用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(圖7)，回收擴(kuò)增片段，為OsFLP-RNAi片段。
[0136]用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sma I雙酶切OsFLP-RNAi片段，回收酶切片段后將其與經(jīng)過Xba I和Sma I雙酶切的pBIntron載體骨架大片段相連,得到中間質(zhì)粒I。再用限制性內(nèi)切酶Kpn I和Sal I雙酶切OsFLP-RNAi片段，回收酶切片段，將其與經(jīng)過Kpn I和Sal I雙酶切的中間質(zhì)粒I的骨架大片段相連，得到中間質(zhì)粒2。最后利用Kpn I和Sac I酶切中間質(zhì)粒2，回收目的片段1000bp左右，與經(jīng)過Kpn I和Sac I雙酶切的pCAMBIA1301_Ubi載體的骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒，送樣測序。測序正確結(jié)果表明在pCAMBIAl301-Ubi載體的酶切位點(diǎn)Kpn I和Sac I之間插入序列表中序列3的第7-1038位所示的DNA片段的重組質(zhì)粒命名為 0sFLP-pCAMBIA1301-Ub1-RNAi。
[0137]在RNAi表達(dá)載體0sFLP-pCAMBIA1301-Ub1-RNAi中，啟動序列表中序列3所示的DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動子為單子葉植物玉米Ub1-1啟動子。
[0138]序列3由1044個(gè)核苷酸組成。其中，第13-241位為所述OsFLP基因的一個(gè)片段的正向序列(與序列表中序列I的第117-345位一致)，第269-555位為來自于pBIntron載體上的X內(nèi)含子(intixm)核苷酸序列，第572-800位為所述OsFLP基因的一個(gè)片段的反向序列(為序列表中序列I的第117-345位的反向互補(bǔ)序列)。正向序列和反向序列之間由一段內(nèi)含子(intron)序列隔開以維持載體的穩(wěn)定性；該系統(tǒng)在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin)的dsRNA,引發(fā)RNAi,從而抑制目的基因的表達(dá)。
[0139]2、RNAi 表達(dá)載體 0sFLP-pCAMBIA1301_Ub1-RNAi 轉(zhuǎn)化水稻
[0140]將步驟I獲得的RNAi表達(dá)載體0sFLP-pCAMBIA1301-Ub1-RNAi采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EH105，對轉(zhuǎn)化后的重組農(nóng)桿菌用由引物15和引物16組成的引物對進(jìn)行PCR鑒定。將經(jīng)鑒定表明含有PCR目的條帶大小為229bp的重組農(nóng)桿菌命名為H1105/0sFLP-pUN1301-RNAio
[0141]同時(shí)設(shè)置向根癌農(nóng)桿菌H1105中轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301_Ubi空載體的對照。將轉(zhuǎn)入pCAMBIAl301-Ubi 空載體的重組農(nóng)桿菌命名為 H1105/pCAMBIA1301-Ubi。
[0142]將以上所得兩種重組農(nóng)桿菌(EH105/0sFLP-pCAMBIA1301-Ub1-RNAi或 H1105/pCAMBIA1301-Ubi)通過侵染水稻品種中花11愈傷組織(參考文獻(xiàn):Hiei Y, Ohta S，KomariT, Kumashiro T (1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.) mediated byAgrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T—DNA.The PlantJournal6:271-282),經(jīng)過共培養(yǎng)、除菌`、抗生素篩選和分化，收獲T1代種子。將T1代種子在含有25 μ g/ μ L潮霉素(AMRESC0公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為Κ547-20，規(guī)格50mg/mL)的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，得到根和葉均能生長的抗性T1代轉(zhuǎn)化植株。
[0143]3、OsFLP基因RNAi水稻中OsFLP基因轉(zhuǎn)錄水平分析
[0144]從步驟2獲得的抗性T1代OsFLP基因RNAi水稻陽性植株中隨機(jī)選取八個(gè)株系，分別記為 0sFLP-RNAi#l、0sFLP_RNAi#5、0sFLP_RNAi#6、0sFLP_RNAi#7、0sFLP_RNAi#12、0sFLP-RNAi#15、0sFLP-RNAi#23 和 0sFLP_RNAi#24。以上株系在含 25 μ g/ μ L 潮霉素溶液中生長2周后，取能正常生長的水稻幼苗提取植物總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后針對OsFLP基因進(jìn)行qRT-PCR檢測。具體操作參照實(shí)施例1步驟I進(jìn)行。
[0145]實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)基因的水稻(Oryza.sativa L.)品種中花11和向水稻(Oryza.sativa L.)品種中花11中轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301_Ubi空載體的植株作為對照。
[0146]結(jié)果顯示,相比未轉(zhuǎn)基因的水稻(Oryza sativa L.)品種中花11,步驟2獲得的T1代 OsFLP 基因 RNAi 水稻株系 0sFLP-RNAi#l、0sFLP-RNAi#5、0sFLP-RNAi#6、0sFLP_RNAi#7、0sFLP-RNAi#12、0sFLP-RNAi#15、0sFLP-RNAi#23 和 0sFLP_RNAi#24 中 OsFLP 基因的表達(dá)量顯著降低(P〈0.05),部分植株鑒定結(jié)果如圖8所示。而向水稻(Oryza sativa L.)品種中花11中轉(zhuǎn)入pCAMBIAl301-Ubi空載體的對照植株中OsFLP基因的表達(dá)量與未轉(zhuǎn)基因的水稻(Oryza sativa L.)品種中花11相比,基本一致,在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異。
[0147]4、OsFLP基因RNAi水稻的抗旱性分析
[0148]以步驟2 獲得的 T1 代 OsFLP 基因 RNAi 水稻株系 0sFLP_RNAi#5、0sFLP_RNAi#23 和0sFLP_RNAi#24,未轉(zhuǎn)基因的水稻(Oryza.sativa L.)品種中花11和向水稻(Oryza.sativaL.)品種中花11中轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301-Ubi空載體的對照植株為實(shí)驗(yàn)材料。用于實(shí)驗(yàn)的每種材料的植株數(shù)為60株。
[0149]將各實(shí)驗(yàn)材料的種子播種成苗后，觀察生長5天和25天的植株表型，如圖9所示，步驟2獲得的T1代OsFLP基因RNAi水稻株系與未轉(zhuǎn)基因的水稻(Oryza.sativa L.)品種中花11相比株高降低。將各水稻植株轉(zhuǎn)移至96孔水培板，生長25天的植株澆灌濃度為10% (10g/100mL)的PEG4000水溶液模擬干旱實(shí)驗(yàn)，每株一次性澆灌100mL。處理3天后澆水恢復(fù)生長2天，觀察表型并照相。同時(shí)設(shè)置未經(jīng)PEG4000處理的對照組。
[0150]實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0151]結(jié)果如圖10所示，經(jīng)PEG4000處理組，步驟2獲得的T1代OsFLP基因RNAi水稻株系與未轉(zhuǎn)基因的水稻(Oryza.sativa L.)品種中花11相比大部分發(fā)黃并萎焉死亡，中花11經(jīng)PEG4000處理后存活率為75%左右，0sFLP-RNAi#5存活率僅為40%左右，表現(xiàn)出對干旱脅迫的超敏感性。而向水稻(Oryza sativa L.)品種中花11中轉(zhuǎn)入pCAMBIA1301_Ubi空載體的對照植株的表型與未轉(zhuǎn)基因的水稻(Oryza sativa L.)品種中花11相比,基本一致，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異。`而未經(jīng)PEG4000處理的對照組，所有植株均正常生長。
【權(quán)利要求】
1.由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)在如下al)或a2)中的應(yīng)用: al)調(diào)控植物抗旱性； a2)選育抗旱性提高的植物品種。
2.由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因在如下al)或a2)中的應(yīng)用: al)調(diào)控植物抗旱性； a2)選育抗旱性提高的植物品種。
3.培育抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，為如下(A)或(B): (A)培育抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟: a)向目的植物中導(dǎo)入由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因，得到表達(dá)所述編碼基因的轉(zhuǎn)基因植物； b)從步驟a)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物； (B)培育抗旱性降低的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟: c)在目的植物中對由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因進(jìn)行抑制表達(dá)，得到轉(zhuǎn)基因植 物； d)從步驟c)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到與所述目的植物相比，抗旱性降低的轉(zhuǎn)基因植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，或權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是如下I)至3)中任一所述的核苷酸序列: 1)序列表中序列I所示的核苷酸序列； 2)在嚴(yán)格條件下與I)所限定的DNA分子雜交且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列； 3)與I)或2)所限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述(A)中，所述由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因是通過含有所述蛋白質(zhì)的編碼基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中的； 所述(B)中，所述在目的植物中對由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的編碼基因進(jìn)行抑制表達(dá)，是通過將如下式(I)所示的DNA片段轉(zhuǎn)入所述目的植物中實(shí)現(xiàn)的: SEQ正向-X-SEQ反向(I) 所述SEQ丨自是序列表中序列3的第13-241位核苷酸； 所述SEQ的序列與所述序列反向互補(bǔ)； 所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ1向及所述SEQfi^1均不互補(bǔ)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于:所述(B)中，所述式(I)所示的DNA片段的核苷酸序列為序列表中的序列3的第13-800位。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述(A)中，所述重組表達(dá)載體中啟動所述編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子為35S啟動子；所述(B)中，所述式(I)所示的DNA片段是通過RNA干擾表達(dá)載體的形式轉(zhuǎn)入所述目的植物中的；所述RNA干擾表達(dá)載體上啟動所述式(I)所示的DNA片段轉(zhuǎn)錄的啟動子是單子葉植物玉米的泛素基因Ubiquitin啟動子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的應(yīng)用或方法，其特征在于:所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
9.如下式(I)所示的DNA片段: SEQ正向-X-SEQ反向(I) 所述SEQ丨自是序列表中序列3的第13-241位核苷酸； 所述SEQ的序列與所述序列反向互補(bǔ)； 所述X是所述SEQ1^1與所述間的間隔序列，在序列上，所述X與所述SEQ1向及所述SEQfiJg不互補(bǔ)； 所述DNA片段的核苷酸序列具體為序列表中的序列3的第13-800位。
10.含有權(quán)利要求9所述DNA片段`的重組載體、重組菌、表達(dá)盒或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
【文檔編號】C12N1/19GK103819549SQ201410072652
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】樂捷, 屈霄霄, 鄒俊杰 申請人:中國科學(xué)院植物研究所