克隆表達(dá)優(yōu)化的非洲豬瘟vp72基因引物序列、基因、核酸疫苗及構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種克隆表達(dá)優(yōu)化的非洲豬瘟VP72基因引物序列、基因、核酸疫苗及構(gòu)建方法，該核酸疫苗由序列表中SEQ?ID?NO.3非洲豬瘟病毒的VP72基因和真核表達(dá)載體pcDNA3.3組成。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所構(gòu)建的核酸疫苗可以有效地刺激宿主的免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生較好的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
【專利說明】克隆表達(dá)優(yōu)化的非洲豬瘟VP72基因引物序列、基因、核酸疫苗及構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及獸醫(yī)生物技術(shù)和基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種克隆表達(dá)優(yōu)化的非洲豬瘟VP72基因引物序列、基因、核酸疫苗及構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]非洲豬瘟是豬的一種烈性病毒病，自1909年首次在非洲發(fā)現(xiàn)以來，目前已蔓延擴(kuò)散到整個(gè)非洲、歐洲和南美洲等國家和地區(qū)，發(fā)病國家因此蒙受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，該病被國際動物衛(wèi)生組織(OIE)列為重要動物疫病。我國雖然還沒有發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟疫情，但根據(jù)周邊國家的發(fā)病情況，以及2006年以來我國部分省市暴發(fā)的豬流行性疫病給我們敲響了警鐘，我國已面臨ASFV傳入和流行的嚴(yán)重威脅。目前，國內(nèi)外學(xué)者對其疫苗研制開展了大量工作，但還無有效的疫苗和藥物可以預(yù)防和治療該病。研究發(fā)現(xiàn)，非洲豬瘟滅活疫苗效果不明顯，而弱毒疫苗的安全性差，易導(dǎo)致慢性流行，迫切需要一種新型疫苗來克服目前存在的問題。
[0003]核酸疫苗與傳統(tǒng)的滅活疫苗、亞單位疫苗和基因工程疫苗等相比，其具有如下優(yōu)點(diǎn):1免疫保護(hù)力增強(qiáng)，主要是通過接種后蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，直接與組織相容性復(fù)合物MHC I或II類分子結(jié)合，同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫；2制備簡單，省時(shí)省力。核酸疫苗作為一種重組質(zhì)粒，易在工程菌內(nèi)大量擴(kuò)增，提純方法簡單，且可將編碼不同抗原基因的多種重組質(zhì)粒聯(lián)合應(yīng)用，制備多價(jià)核酸疫苗，這樣可大大減少人力、物力、財(cái)力以及多次接種帶來的應(yīng)激反應(yīng)；3同種異株交叉保護(hù)是核酸疫苗的最大優(yōu)點(diǎn)之一，可通過對基因表達(dá)載體所攜帶的靶基因進(jìn)行改造，從而選擇抗原決定簇；4核酸疫苗應(yīng)用較安全，接種后蛋白質(zhì)抗原在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，不存在毒力返祖或殘留毒力病毒引起發(fā)病的危險(xiǎn)，也不會引起對機(jī)體的不良反應(yīng)；5可產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答，一次接種可獲得長期免疫力，無需反復(fù)多次加強(qiáng)免疫；6貯存、運(yùn)輸方便，核酸疫苗的質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性好，便于貯存和運(yùn)輸，無須冷藏。因此，核酸疫苗可能是解決非洲豬瘟免疫防控的有力工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，針對當(dāng)前國內(nèi)外無非洲豬瘟有效疫苗防控的問題，提供一種克隆表達(dá)優(yōu)化的非洲豬瘟VP72基因引物序列、基因、核酸疫苗及構(gòu)建方法。
[0005]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是，提供一種克隆表達(dá)優(yōu)化的非洲豬瘟VP72基因引物序列，其特征在于，該引物序列如序列表中的SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所述，其中SEQ ID N0.1為非洲豬瘟病毒VP72基因上游引物，SEQ ID N0.2為非洲豬瘟病毒VP72基因下游引物。
[0006]本發(fā)明還提供一 種克隆表達(dá)優(yōu)化的非洲豬瘟VP72基因，包括序列表中SEQ IDN0.3的基因序列。
[0007]本發(fā)明還提供一種非洲豬瘟核酸疫苗，該疫苗由序列表中SEQ ID N0.3的非洲豬瘟VP72基因和真核表達(dá)載體組成。
[0008]在本發(fā)明所述的非洲豬瘟核酸疫苗中，所述的真核表達(dá)載體可為任何一種DNA疫苗載體。
[0009]在本發(fā)明所述的非洲豬瘟核酸疫苗中，所述的真核表達(dá)載體為pcDNA3.3。
[0010]本發(fā)明還提供一種非洲豬瘟核酸疫苗的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0011](I)合成ASFV VP72基因，并克隆至PUC18克隆載體中，標(biāo)記為PUC18-ASFV VP72 ；
[0012](2)根據(jù)已經(jīng)合成的ASFV VP72基因核酸序列，利用核酸引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性PCR引物，并在上游引物引入G/A NN序列，引物序列分別如序列表中SEQ ID N0.1和SEQID N0.2所示；并從pUC18-ASFV VP72質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得包括NN序列和ASFV VP72全基因的序列，大小為1944bp，如序列表中SEQ ID N0.3所示；
[0013](3)將步驟(1)中擴(kuò)增獲得的ASFV VP72基因經(jīng)過凝膠電泳、回收后，克隆到pcDNA3.3真核表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒pcDNA-ASFV-VP72 ；
[0014](4)用Puv I限制性內(nèi)切酶將高度純化的pcDNA-ASFV-VP72線性化后，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中，經(jīng)過G418持續(xù)加壓篩選、PCR檢測鑒定后，獲得陽性細(xì)胞系。
[0015]根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的非洲豬瘟核酸疫苗，使得非洲豬瘟VP72基因在哺乳動物細(xì)胞中顯著表達(dá)，并有效刺激被接種動物的免疫系統(tǒng)，使之產(chǎn)生較好的體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)，有利于免疫抵抗非洲豬瘟 病毒。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1非洲豬瘟VP72基因的PCR擴(kuò)增
[0017]圖2 重組質(zhì)粒 pcDNA-ASFV-VP72 的 PCR 鑒定
[0018]其中1:陰性對照；2、3:VP72弓丨物對擴(kuò)增pcDNA-ASFV_VP72質(zhì)粒的PCR結(jié)果；
[0019]4、5:載體上游引物和VP72下游引物擴(kuò)增pcDNA-ASFV_VP72質(zhì)粒的PCR結(jié)果；
[0020]6:VP72 基因陽性對照；M:DL6000DNA Marker。
[0021]圖3重組質(zhì)粒pcDNA-ASFV-VP72轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后的PCR鑒定結(jié)果
[0022]其中1、4:正常細(xì)胞對照；2、3、5、6:轉(zhuǎn)染細(xì)胞；7:陰性對照；8:pcDNA_VP72質(zhì)粒對照；M:DL2000DNA Marker。
[0023]圖4重組質(zhì)粒pcDNA-ASFV-VP72轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后的間接免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果。
[0024]圖4A為pcDNA-ASFV-VP72重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后表達(dá)蛋白的免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果。
[0025]圖4B為pcDNA-lacZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后表達(dá)蛋白的免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果。
[0026]圖5Balb/C小鼠血清中VP72抗體0D450值變化趨勢圖，其中A組為pcDNA_VP72核酸疫苗免疫組組為pcDNA-lacZ載體對照組；C組為PBS對照組。
[0027]圖6新西蘭兔血清中VP72抗體0D450值變化趨勢圖，其中A組為pcDNA_VP72核酸疫苗免疫組組為pcDNA-lacZ載體對照組；C組為PBS對照組。
【具體實(shí)施方式】
[0028]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0029]實(shí)施例1:非洲豬瘟病毒VP72基因的PCR擴(kuò)增與序列分析
[0030]根據(jù)Genebank上發(fā)布的非洲豬痕病毒VP72的基因序列，利用PrimerPrimer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)一對PCR引物，可擴(kuò)增VP72基因的完整序列，并在上游引物的5’端引進(jìn)(G/A) NN序列，引物序列如序列表中的SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2:
[0031]SEQ ID N0.1Pl: 5’ -AATATGGCATCAGGAGGAGCTT-3’
[0032]SEQ ID N0.2P2:5，-TTAGGTACTGTAACGCAGCACAG-3’
[0033]以pUC18-ASFV VP72質(zhì)粒為模板，利用引物對P1/P2進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μ L:10XBuffer5y L,25mM dNTP Mixl μ L, 25mM MgCl22 μ L,上下游引物各 I μ L，Taq 酶 0.2μ L，質(zhì)粒模板5 μ L，用滅菌的雙蒸水補(bǔ)充至50 μ L0
[0034]反應(yīng)程序?yàn)?94°CImin ；94°C lmin，56°C lmin，72°C 2min，30 個(gè)循環(huán)；72°C lOmin,4 °C 2h。
[0035]經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一條特異性擴(kuò)增條帶，大小約為1.9kb，說明設(shè)計(jì)的引物可特異性的擴(kuò)增VP72基因。
[0036]實(shí)施例2:非洲豬瘟病毒VP72基因核酸疫苗的構(gòu)建
[0037]PCR擴(kuò)增ASF V的VP72基因，分別亞克隆到pCDNA3.3(+)真核表達(dá)載體上，構(gòu)建了 VP72基因的重組真核表達(dá)載體。將以上構(gòu)建的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果在轉(zhuǎn)染48h后VP72蛋白的得到了表達(dá)，間接免疫熒光為陽性，而空質(zhì)粒P⑶NA3.3(+)和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的BHK-21細(xì)胞均呈陰性反應(yīng)。體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明含VP72基因真核表達(dá)載體能在體外獲得表達(dá)，從而為下一步的動物試驗(yàn)提供了如提條件。
[0038]2.1凝膠回收
[0039]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠回收試劑盒(TaKaRa MiniBestAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver3.0,大連寶生物公司)回收純化約1944bp的目的擴(kuò)增片段，具體操作步驟如下:
[0040]將電泳后的瓊脂糖凝膠置于紫外檢測儀下，切下含目的片段的凝膠，分析天平稱膠塊的質(zhì)量，按Img = I μ L計(jì)算膠塊的體積。加入4倍體積的GM Buffer,在15°C -25°C融化lOmin，待膠塊完全融化。將離心吸附柱安置在收集管上，轉(zhuǎn)移融化后的混合液至吸附柱中，靜置2min，12000rpm，離心lmin。將離心后的濾液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，12000rpm，離心Imin,以提高DNA的回收效率。棄濾液，加入700 μ L的WB洗液，12000rpm,離心30sec，棄濾液，重復(fù)洗滌一次?？罩?，12000rpm離心lmin，然后將吸附柱安置在滅菌的Ep管上，加入30 μ L 的 Elution Buffer,室溫靜置 lmin, 12000rpm 離心 lmin,洗脫 DNA。洗脫后的 DNA 可直接用于連接轉(zhuǎn)化或者保存在_20°C冰箱。
[0041 ] 2.2連接構(gòu)建核酸疫苗
[0042]采用TOPO克隆反應(yīng)體系，室溫反應(yīng)將目的基因連接到pcDNA3.3載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體PCDNA-ASFV-VP72，即本文中提及的核酸疫苗。TOPO克隆反應(yīng)體系為:PCR凝膠回收產(chǎn)物4 μ L，Salt Solutionl μ L，pcDNA3.3T0P0載體I μ L，室溫放置5min后轉(zhuǎn)冰浴?？寺‘a(chǎn)物可直接用于轉(zhuǎn)化，或者保存在_20°C冰箱。
[0043]轉(zhuǎn)化前先在室溫預(yù)熱S.0.C.培養(yǎng)基，并在37°C預(yù)熱含氨芐青霉素(0.lg/L)的LB平板。采用化學(xué)法將TOPO克隆產(chǎn)物轉(zhuǎn)到TOPlO感受態(tài)大腸桿菌中。轉(zhuǎn)化步驟如下:[0044]I)將2 μ L TOPO克隆反應(yīng)液加到1份Τ0Ρ10感受態(tài)大腸桿菌中，輕輕拍動管壁數(shù)次，充分混勻，切忌吹打。
[0045]2)冰上放置30min，在42°C熱激30s后迅速置于冰上，勿振搖。
[0046]3)加入250 μ L S.0.C.培養(yǎng)基，蓋上蓋子后于37°C 200rpm水平振蕩培養(yǎng)lh。
[0047]4)取10-50 μ L菌液涂布在含氨芐青霉素的抗性LB平板上，將涂布后的含氨芐青霉素的LB平板，于37 °C過夜培養(yǎng)。 [0048]2.3篩選陽性克隆
[0049]隨機(jī)挑取單菌落10個(gè)以上，分別接種于ImL含0.lg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，250rpm，37°C振蕩培養(yǎng)4~5h。待菌液出現(xiàn)云霧狀沉淀時(shí)，分別用VP72基因的引物對、VP72基因的上游引物和載體下游引物，取菌液作PCR鑒定。
[0050]PCR 反應(yīng)體系為 25μ L:10XBuffer2.5μ L，25mM dNTP Mix0.5 μ L,25mMMgCl2l.5 μ L，上下游引物各0.5 μ L, Taq酶0.5 μ L，菌液模板0.5 μ L，用滅菌的雙蒸水補(bǔ)充至25 μ L0
[0051]反應(yīng)程序:940C 2min ；94 °C 30sec，56 °C 30sec，72 °C 1.5min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 10min,4°C 2h。
[0052]PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，若出現(xiàn)兩條特異性擴(kuò)增條帶，大小分別為1944bp和2098bp，說明目的基因已經(jīng)正向插入到pcDNA3.3中。
[0053]對于正向插入的菌液樣品可擴(kuò)大培養(yǎng)，取10 μ L菌液接種到50mL含0.lg/L氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中，250rpm，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。
[0054]2.4小量制備重組質(zhì)粒核酸疫苗
[0055]利用質(zhì)粒小量提取試劑盒(PureLinkHiPure Plasmid DNA MidiprepPurification Kit, Invitrogen公司)對過夜培養(yǎng)的菌液提取質(zhì)粒DNA,質(zhì)粒提取步驟如下:
[0056]I)平衡:在HiPure Midi吸附柱中加入IOmL平衡緩沖液，室溫靜置，讓緩沖液在重力作用下自然過柱。
[0057]2)菌液收集:將2.3中過夜培養(yǎng)的菌液取20mL在無菌操作臺中加入到50mL的離心管中，常溫下4000 Xg,離心10min,棄上清,收集細(xì)菌。
[0058]3)重懸菌體:加入4mL重懸緩沖液于細(xì)菌沉淀中，反復(fù)振搖，直至看不到細(xì)菌團(tuán)塊，細(xì)菌全部重懸于緩沖液中。
[0059]4)裂解:加入4mL裂解緩沖液到上述菌體重懸液中，溫和顛倒五次，室溫靜置5min。
[0060]5)沉淀:加入4mL沉淀緩沖液到上述混合液中，立即顛倒數(shù)次，直至混勻，室溫12000 Xg,離心 IOmin0
[0061]6)結(jié)合:將上清液加入到平衡后的吸附柱中，讓上清液在重力作用下自然過柱。
[0062]7)洗滌:加入IOmL的洗滌緩沖液到吸附柱中，重力作用下過柱，棄洗液。用該洗滌緩沖液重復(fù)洗滌一次。
[0063]8)洗脫:在吸附柱下放置新的滅菌15mL離心管，向吸附柱中加入5mL洗脫液，重力作用下過柱，收集洗脫液。
[0064]9)沉淀和洗滌:向洗脫液中加入3.5mL的異丙醇，混勻，4°C 12000 X g，離心30min，棄上清。加入3mL70%的乙醇重懸沉淀，4°C 12000 X g,離心5min,棄上清。
[0065]10)重懸:沉淀自然干燥IOmin后，加入200 μ L的TE緩沖液重懸，將所制備的質(zhì)粒DNA保存于_20°C。
[0066]實(shí)施例3:重組質(zhì)粒pcDNA-ASFV-VP72的鑒定
[0067]3.1 重組質(zhì)粒 pcDNA-ASFV-VP72 的 PCR 鑒定
[0068]對上述提取的質(zhì)粒用滅菌水稀釋100倍后，用PCR進(jìn)行鑒定。
[0069]PCR 反應(yīng)體系為 25μ L:10XBuffer2.5μ L，25mM dNTP Mix0.5 μ L,25mMMgCl2l.5 μ L，上下游引物各0.5 μ L, Taq酶0.5 μ L，菌液模板0.5 μ L，用滅菌的雙蒸水補(bǔ)充至25 μ L0
[0070]反應(yīng)程序:940C 2min ；94 °C 30sec，56 °C 30sec，72 °C 1.5min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 10min,4°C 2h。
[0071]PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測觀察結(jié)果。
[0072]3.2重組質(zhì)粒pcDNA-ASFV-VP72中目的基因的測序鑒定
[0073]對篩選鑒定為VP72正向插入的pcDNA3.3-ASFV-VP72質(zhì)粒送大連寶生物有限公司進(jìn)行測序鑒定，測序結(jié)果采用Clustal X軟件進(jìn)行DNA及氨基酸同源性分析，確定插入的VP72基因序列正確、無突變。
[0074]將測序正確的pcDNA3.3_ASFV_VP72質(zhì)粒標(biāo)記后于_20°C保存，并將相應(yīng)的陽性菌液也同時(shí)保存，保存方法是加終濃度20%左右的滅菌甘油保存于_80°C。
[0075]實(shí)施例4:脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞
[0076]4.1重組質(zhì)粒pcDNA-ASFV-VP72的線性化
[0077]采用PvuI內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒進(jìn)行線性化。酶切體系為:10XKBuffer20y L,0.1%BSA20 μ L, PvuI 內(nèi)切酶 10μ L，質(zhì)粒 DNA15y L (≤ 10 μ g)，用滅菌的雙蒸水補(bǔ)充至200 μ L0將酶切反應(yīng)液混勻后，37°C作用30min。
[0078]純化:待酶切完畢后，在上述反應(yīng)液中加入IOyL NaAc (pH5.2)和500yL無水乙醇，室溫沉淀90min ；12000rpm離心15min,棄上清，加入2mL70%乙醇，室溫作用2h ；12000rpm離心5min,棄上清，自然干燥后,加入20 μ L滅菌的雙蒸水。線性化后的質(zhì)粒直接用于轉(zhuǎn)染或-20 V保存?zhèn)溆谩?br> [0079]4.2 轉(zhuǎn)染
[0080]采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)空質(zhì)粒對照組(pcDNA3.3)，具體操作如下:
[0081]I)取對數(shù)生長狀態(tài)的BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前一天按每孔8X IO6細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)液用無雙抗的生長液，培養(yǎng)液總體積為每孔2mL。
[0082]2)準(zhǔn)備以下反應(yīng)管:A管:取一支無菌離心管加入10 μ L質(zhì)粒(5 μ g)和300 μ L的Opt1-MEMI培養(yǎng)基。B管:取一支無菌離心管加入7.5μ L的lipofectamine2000到150μ L的Opt1-MEMI培養(yǎng)基中。C管:取一支無菌離心管加入10μ L的lipofectamine2000到150 μ L的Opt1-MEMI培養(yǎng)基中。將B管和C管輕輕混勻，室溫下放置5min。
[0083]3)將A管平均分成兩份，分別與B管和C管混合液混勻，室溫放置20min后，將其加入細(xì)胞懸液中輕輕混勻，在37°C、5% 二氧化碳培養(yǎng)中培養(yǎng)48-72h。轉(zhuǎn)染4_6h后更換含1%雙抗的生長液。[0084]4)待細(xì)胞長滿六孔板，轉(zhuǎn)移到25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)后，開始加入G418 (遺傳霉素)進(jìn)行加壓篩選，遺傳霉素的終濃度為400 μ g/mL，去除未轉(zhuǎn)入PCDNA-ASFV-VP72的正常細(xì)胞。
[0085]實(shí)施例5:重組質(zhì)粒pcDNA-ASFV-VP72在BHK-21細(xì)胞中的表達(dá)
[0086]5.1G418加壓篩選、PCR檢測鑒定
[0087]用G418連續(xù)加壓篩選三代后，收集細(xì)胞轉(zhuǎn)移入滅菌的1.5mL離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。加入少量的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后取100 μ L的細(xì)胞懸液用磁珠快速提取系統(tǒng)進(jìn)行核酸抽提，用于PCR檢測，PCR檢測方法同3.1。
[0088]5.2間接免疫熒光試驗(yàn)鑒定
[0089]采用間接免疫熒光試驗(yàn)檢測ΒΗΚ-21細(xì)胞中表達(dá)的VP72蛋白，同時(shí)設(shè)pcDNA_lacZ陰性質(zhì)粒對照，具體步驟如下:
[0090]I)將轉(zhuǎn)染后72h的細(xì)胞接種24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞鋪滿24孔板后，棄上清，PBS洗 3 次，500 μ L/ 孔，5min/次。
[0091]2)加入200 μ L_20°C預(yù)冷的丙酮:乙醇(6:4)固定液,室溫固定IOmin后,棄固定液，自然揮干。此法制備的24孔板可立即使用或_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0092]3)每孔加入200 μ L1: 100稀釋的ASFV-VP72單克隆抗體，37°C濕盒內(nèi)孵育lh，棄一抗，PBS 洗 3 次，5min/次。
[0093]4)每孔加入200 μ L1: 50稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C避光作用30min，棄二抗，PBS 洗 3 次，5min/次。
[0094]5)每孔加入IOOyL含70%甘油的PBS，在倒置熒光顯微鏡下觀察，拍片記錄結(jié)果。
[0095]5.3SDS-PAGE、Western-blotting 鑒定
[0096]采用Western-blotting方法檢測BHK-21細(xì)胞中表達(dá)的VP72蛋白，具體步驟如下:
[0097]I)棄去轉(zhuǎn)染72h后的BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次。2)胰酶消化細(xì)胞，加入預(yù)冷的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，40C，3000rpm離心3min，收集細(xì)胞。
[0098]3)加入ImL預(yù)冷的PBS輕輕洗漆細(xì)胞,2000rpm離心2min,棄上清,重復(fù)洗一次。
[0099]4)加入100 μ LI X SDS加樣緩沖液重懸細(xì)胞，煮沸l(wèi)Omin，12000rpm離心2min，取上清進(jìn)行SDS-PAGE。
[0100]5)將處理好的樣品加入12%的膠中進(jìn)行電泳，20mA，30min，40mA，2h。
[0101]6)轉(zhuǎn)膜:將PAGE膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，15V，30min。
[0102]7)封閉:轉(zhuǎn)膜后，將NC膜在轉(zhuǎn)膜緩沖液內(nèi)浸泡5min，轉(zhuǎn)移到TBST洗液中浸泡3min，然后在1%BSA的TBST中，4°C過夜封閉。棄封閉液，用TBST洗膜3次，5min/次。
[0103]8)加一抗:將膜浸在1:100稀釋的ASFV-VP72單克隆抗體中，37°C孵育lh。將膜取出，用TBST洗滌3次，5min/次。
[0104]9)加二抗:將膜浸在1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG中，37°C孵育lh。將膜取出，用TBST洗滌3 次，5min/次。
[0105]10)底物顯色:將膜浸在DAB顯色液中，室溫顯色5~30min。然后將膜取出，浸在雙蒸水中，觀察結(jié)果。結(jié)果如圖4所示，A圖為pcDNA-ASFV-VP72重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后表達(dá)蛋白的免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果，B圖為pcDNA-lacZ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞后表達(dá)蛋白的免疫熒光試驗(yàn)結(jié)果。試驗(yàn)結(jié)果表明，獲得的陽性BHK-21細(xì)胞中表達(dá)了非洲豬瘟VP72蛋白，表明研制的非洲豬瘟核酸疫苗在哺乳動物細(xì)胞中可以持續(xù)產(chǎn)生目的蛋白。
[0106]實(shí)施例6:非洲豬痕核酸疫苗的大量制備及純化
[0107]利用質(zhì)粒大量提取試劑盒(PureLinkHiPure Plasmid DNA MaxiprepPurification Kit, Invitrogen公司)對過夜培養(yǎng)的菌液提取質(zhì)粒DNA,質(zhì)粒提取步驟如下:
[0108]I)平衡:在HiPure Maxi吸附柱中加入30mL平衡緩沖液，室溫靜置，讓緩沖液在重力作用下自然過柱。
[0109]2)菌液收集:將2.3中過夜培養(yǎng)的菌液取200mL在無菌操作臺中分次加入到50mL的離心管中，常溫下4000 X g，離心10min，棄上清，收集細(xì)菌。
[0110]3)重懸菌體:加入IOmL重懸緩沖液于細(xì)菌沉淀中，反復(fù)振搖，直至看不到細(xì)菌團(tuán)塊，細(xì)菌全部重懸于緩沖液中。
[0111]4)裂解:加入IOmL裂解緩沖液到上述菌體重懸液中，溫和顛倒五次，室溫靜置5min。
[0112]5)沉淀:加入IOmL沉淀緩沖液到上述混合液中，立即顛倒數(shù)次，直至混勻，室溫12000 Xg,離心 IOmin0
[0113]6)結(jié)合:將上清液加入到平衡后的吸附柱中，讓上清液在重力作用下自然過柱。 [0114]7)洗滌:加入60mL的洗滌緩沖液到吸附柱中，重力作用下過柱，棄洗液。用該洗滌緩沖液重復(fù)洗滌一次。
[0115]8)洗脫:在吸附柱下放置新的滅菌50mL離心管，向吸附柱中加入15mL洗脫液，重力作用下過柱，收集洗脫液。
[0116]9)沉淀和洗滌:向洗脫液中加入10.5mL的異丙醇，混勻，4°C 12000Xg，離心30min,棄上清。加入5mL70%的乙醇重懸沉淀,4°C 12000 X g,離心5min,棄上清。
[0117]10)重懸:沉淀自然干燥IOmin后，加入300 μ L的TE緩沖液重懸，該重懸液中即含有所制備的質(zhì)粒DNA。
[0118]11)將質(zhì)粒適當(dāng)稀釋后，用PCR進(jìn)行鑒定。
[0119]12)用滅菌的PBS將質(zhì)粒DNA稀釋100倍后，用紫外分光光度計(jì)測定質(zhì)粒的濃度，將質(zhì)粒DNA稀釋成200 μ g/ μ L，300 μ L/管分裝，-20°c保存?zhèn)溆谩?br> [0120]實(shí)施例7:非洲豬瘟核酸疫苗的免疫原性研究
[0121]7.1接種小鼠試驗(yàn)
[0122]實(shí)驗(yàn)動物分組:健康SPF級雌性BALB/c小鼠，6-8周齡，共18只，隨機(jī)分為3組，每組6只。實(shí)驗(yàn)分組如下:A組為實(shí)驗(yàn)組；B組為pcDNA-LacZ陰性質(zhì)粒對照組；C組為PBS對照組。
[0123]接種前處理:每次免疫前24h于每只小鼠雙后肢股四頭肌注射0.75%鹽酸普魯卡因20 μ I。注射時(shí)在針頭上加套一小管使針頭只外露2-3mm，以保證每只小鼠注射時(shí)針頭刺入肌肉深度較一致。注射時(shí)需垂直進(jìn)針，緩慢注入，針頭原位保持5-lOsec。
[0124]免疫接種程序:
[0125]將已經(jīng)測好濃度的pcDNA3.3 / VP72重組質(zhì)粒和pcDNA3.3/lacZ質(zhì)粒分別免疫接種小鼠，50μ1 /次，即IOOyg/只，間隔2周免疫，共3次:[0126]⑴A組(實(shí)驗(yàn)組):每只小鼠分別在第0、2、4周經(jīng)雙后肢股四頭肌注射pcDNA3.3 / VP72 重組質(zhì)粒，50 μ I / 次。
[0127]⑵B組(質(zhì)粒載體對照組):每只小鼠分別在第0、2、4周經(jīng)雙后肢股四頭肌注射pcDNA3.3/lacZ 質(zhì)粒載體，50 μ I / 次。
[0128](3)C組(PBS對照組):每只小鼠分別在第0、2、4周經(jīng)雙后肢股四頭肌注射無菌PBS，50μ I / 次。
[0129]收集血清:
[0130]分別于每次免疫前(即0、2、4周)斷尾取血，末次免疫后2周采用摘眼球法取血，置室溫自然凝固后，剝離血塊，2000 r / 11^11離心101^11，分離血清，10(^1 /管分裝，_20°C保
存?zhèn)溆谩?br> [0131]用間接ELISA方法檢測血清中ASFV-VP72蛋白抗體滴度的變化，評價(jià)pcDNA_VP72核酸疫苗在小鼠動物模型中誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫的能力。結(jié)果如圖5所示，pcDNA-VP72核酸疫苗組小鼠在第一次免疫后兩周，就可在血清中檢測到特異性的VP72抗體；第二次免疫后兩周抗體水平顯著升高，且隨著免疫次數(shù)的增加抗體滴度也隨之升高。而pcDNA-lacZ載體對照組和空白對照組小鼠的血清中未檢測到特異性VP72抗體，結(jié)果證實(shí)pcDNA-VP72核酸疫苗免疫小鼠后可在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗體應(yīng)答。
[0132]7.2接種兔試驗(yàn)
[0133]實(shí)驗(yàn)動物分組:健康新西蘭兔，隨機(jī)分為3組，每組3只。實(shí)驗(yàn)分組如下:A組為實(shí)驗(yàn)組；B組為pcDNA-LacZ陰性質(zhì)粒對照組；C組為PBS對照組。
[0134]免疫接種程序:
[0135]將已經(jīng)測好濃度的pcDNA3.3 / VP72重組質(zhì)粒和pcDNA3.3/lacZ質(zhì)粒分別免疫接種新西蘭兔，100 μ I /次，即200 μ g/只，間隔2周免疫,共3次:
[0136]⑴A組(實(shí)驗(yàn)組):每只兔分別在第0、2、4周經(jīng)腿部肌肉注射pcDNA3.3 / VP72重組質(zhì)粒，100 μ I /次。
[0137](2) B組(質(zhì)粒載體對照組):每只兔分別在第0、2、4周經(jīng)腿部肌肉注射pcDNA3.3/IacZ質(zhì)粒載體，100 μ I /次。
[0138]⑶C組(PBS對照組):每只兔分別在第O、2、4周經(jīng)腿部肌肉注射無菌PBS，100 μ I / 次。
[0139]收集血清:
[0140]分別于每次免疫前(即0、2、4周)以及末次免疫后2周耳靜脈采血，置室溫自然凝固后，剝離血塊，2000r / min離心10min，分離血清，100μ I /管分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0141]用間接ELISA方法檢測血清中ASFV-VP72蛋白抗體滴度的變化，評價(jià)pcDNA_VP72核酸疫苗在新西蘭兔動物模型中誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫的能力。結(jié)果如圖6所示，pcDNA-VP72核酸疫苗免疫組的新西蘭兔在第一次免疫后兩周，就可在血清中檢測到特異性的VP72抗體；第二次免疫后兩周抗體水平顯著升高，且隨著免疫次數(shù)的增加抗體滴度也隨之升高。而pcDNA-lacZ載體對照組和空白對照組的兔血清中未檢測到特異性VP72抗體，結(jié)果證實(shí)pcDNA-VP72核酸疫苗免疫兔后可在兔體內(nèi)產(chǎn)生特異性的抗體應(yīng)答。
[0142]實(shí)施例8:非洲豬瘟核酸疫苗接種動物后的ELISA檢測
[0143]采用商品化試劑盒內(nèi)包被有VP73蛋白的ELISA板，用于間接ELISA檢測。[0144]I)加一抗:用抗體稀釋液(0.1%BSA的PBST)將待檢血清從1:5開始做倍比稀釋，每孔加入100 μ L，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)陽性對照、陰性對照和空白對照，37°C孵育Ih，用PBST洗滌5次。
[0145]2)加二抗:每孔加入100 μ L1:5000用PBS稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37°C孵育lh，用PBST洗滌5次。
[0146]3)底物顯色:每孔加入100 μ L已經(jīng)配制好的TMB底物溶液，避光顯色5~15min。
[0147]4)終止反應(yīng):每孔加入50 μ L終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定并記錄各孔0D450值，計(jì)算每個(gè)樣品的平均值。
[0148]5)結(jié)果判定:陰性對照孔OD45tl值記為N，陽性對照孔OD45tl值記為P，若Ρ/Ν≥2.1，且P — N > 0.2，即判定結(jié)果為陽性。
[0149]本發(fā)明未涉及部分均與現(xiàn)有技術(shù)相同或可采用現(xiàn)有技術(shù)加以實(shí)現(xiàn)。
[0150]實(shí)施例中所涉及的試劑信息如下表:
[0151]
【權(quán)利要求】
1.一種克隆表達(dá)優(yōu)化的非洲豬瘟VP72基因引物序列，其特征在于，該引物序列如序列表中的SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所述，其中SEQ ID N0.1為非洲豬瘟病毒VP72基因上游引物，SEQ ID N0.2為非洲豬瘟病毒VP72基因下游引物。
2.一種克隆表達(dá)優(yōu)化的非洲豬瘟VP72基因，其特征在于，包括序列表中SEQ ID N0.3的基因序列。
3.一種非洲豬瘟核酸疫苗，其特征在于，該疫苗由序列表中SEQ ID N0.3的非洲豬瘟VP72基因和真核表達(dá)載體組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的非洲豬瘟核酸疫苗，其特征在于，所述的真核表達(dá)載體可為任何一種DNA疫苗載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的非洲豬瘟核酸疫苗，其特征在于，所述的真核表達(dá)載體為pcDNA3.3。
6.一種非洲豬瘟核酸疫苗的構(gòu)建方法，包括如下步驟: (1)合成ASFVVP72基因，并克隆至pUC18克隆載體中，標(biāo)記為pUC18-ASFV VP72 ； (2)根據(jù)已經(jīng)合成的ASFVVP72基因核酸序列，利用核酸引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)特異性PCR引物，并在上游引物引入G/A NN序列，引物序列分別如序列表中SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2所示；并從pUC18-ASFV VP72質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得包括NN序列和ASFV VP72全基因的序列，大小為1944bp，如序列表中SEQ ID N0.3所示； (3)將步驟(1)中擴(kuò)增獲得的ASFVVP72基因經(jīng)過凝膠電泳、回收后，克隆到pcDNA3.3真核表達(dá)載體中，得到重組質(zhì)粒pcDNA-ASFV-VP72 ； (4)用PuvI限制性內(nèi)切酶將高度純化的pcDNA-ASFV-VP72線性化后，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染到BHK-21細(xì)胞中，經(jīng)過G418持續(xù)加壓篩選、PCR檢測鑒定后，獲得陽性細(xì)胞系。
【文檔編號】C12N15/40GK103952401SQ201410073118
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】張彩虹, 呂建強(qiáng), 楊俊興, 曹琛福, 宗卉, 陶虹, 孫潔, 曾少靈, 葉奕優(yōu), 黃超華, 劉建利, 花群義 申請人:深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心