波吉卵囊藻高密度培養(yǎng)方法及藻細(xì)胞收集方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種波吉卵囊藻高密度培養(yǎng)技術(shù)和藻細(xì)胞收集方法，涉及海洋微藻養(yǎng)殖領(lǐng)域。波吉卵囊藻傳統(tǒng)培養(yǎng)基生長速度慢，產(chǎn)量低。本發(fā)明用NaNO3和尿素作氮源，添加適量的NaHCO3并補(bǔ)充了九二0植物生長刺激素、人尿、海泥抽取液、牛糞及羊糞浸出液和土壤抽出液，營養(yǎng)更均衡、全面。本發(fā)明采用家庭用礦泉水桶培養(yǎng)方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的開放水泥池培養(yǎng)，操作簡單，不易污染，易于掌控，安全可靠，四季均可生產(chǎn)，成本低，生長快，尤其適用于擴(kuò)種階段，產(chǎn)量提高180％。本發(fā)明用黃泥漿法收集波吉卵囊藻取代過去的離心法，細(xì)胞回收率高，簡單易行，花錢少，設(shè)備簡單，材料易得，對細(xì)胞無傷害，適于大規(guī)模生產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)效益高。
【專利說明】波吉卵囊藻高密度培養(yǎng)方法及藻細(xì)胞收集方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海洋微藻養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及波吉卵囊藻高密度培養(yǎng)方法及藻細(xì)胞收集方法。
【背景技術(shù)】
[0002]波吉卵囊藻Oocystis borgei是從對奸高位池分離出來,作為微藻生態(tài)調(diào)控、改善養(yǎng)殖環(huán)境、防止對奸疾病的一種微藻，隸屬于綠藻門Chlorophyta,綠藻綱Chlorophyceae,綠球藻目Chlorococcales,卵囊藻科Oocystaceae,卵囊藻屬Oocystis。由2、4、8個細(xì)胞組成群體生活，群體卵圓形；群體外有一層明顯膠質(zhì)包被，群體中細(xì)胞橢圓或略呈卵形，兩端廣圓；色素體片狀。細(xì)胞長10-19 μ m，寬9-13 μ m ;一般產(chǎn)生2、4、8或16個似親孢子，營孢子生殖。
[0003]高位池是一種對蝦高密度集約化養(yǎng)殖模式。通過生物技術(shù)調(diào)控養(yǎng)殖水域中微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能來預(yù)防疾病，是對蝦養(yǎng)殖生態(tài)防病的重要內(nèi)容。波吉卵囊藻廣泛存在于南方對蝦高位池，種群穩(wěn)定，適應(yīng)能力強(qiáng)，可調(diào)控和改善養(yǎng)殖環(huán)境并防止對蝦疾病。該藻富含蛋白質(zhì)、海藻多糖、維生素及多不飽和脂肪酸，是水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物舌鰨、黑鯛、海灣扇貝、鮑魚、紫海膽、梭子蟹、海參、泥蚶、貽貝、牡蠣、文蛤、日本對蝦等的良好餌料。生態(tài)學(xué)研究表明，波吉卵囊藻最適生長溫度是25-30°C;最適海水密度1.008-1.016，在1.004-1.020范圍均能正常生長；最適PH值范圍7.5-9.0 ;最適光照強(qiáng)度為4000-100001X，每天24小時連續(xù)光照，細(xì)胞增殖率最大；種群增長無明顯指數(shù)生長期。張浩在實(shí)驗(yàn)室中模擬多種氮源共存的蝦池水環(huán)境，利用穩(wěn)定同位素示蹤劑，研究溫度、光照、鹽度、pH、藻濃度對波吉卵囊藻氨氮吸收速率的影響，結(jié)果表明，溫度、光照和藻濃度對波吉卵囊藻氨氮吸收速率影響極顯著。當(dāng)溫度為20°C，照度為45001x，藻濃度為5.5X105/mL時，該藻對氨氮吸收速率最大。
[0004]海泥抽出液含有藻類生長所必需的各種微量元素和溶解有機(jī)物質(zhì)及某些輔助生長物質(zhì)，具有絡(luò)合劑的作用。在培養(yǎng)液中加入海泥抽出液，實(shí)際是解決了微量元素供應(yīng)的問題。碳水化合物是海泥的有機(jī)組成成分，可以補(bǔ)充碳源。陳振奮認(rèn)為，海泥抽取液對牟氏角毛藻生長的促進(jìn)作用強(qiáng)于維生素。我的研究表明，添加適量海泥抽取液對波吉卵囊藻生長有較好促進(jìn)作用。人尿中95%是水，5%是可溶性無機(jī)鹽，其中約2%是尿素。在藻細(xì)胞的氮代謝中，氮必須以NH4+的形式與細(xì)胞內(nèi)的碳水化合物衍生的酮酸作用生成氨基酸，再合成蛋白質(zhì)。孫凌毅指出，波吉卵囊藻對銨鹽和尿素的利用強(qiáng)于硝酸鹽。張貴杰等研究表明，培養(yǎng)波吉卵囊藻以尿素效果最好，硝酸鈉次之，氯化銨最差。張青田等認(rèn)為以尿素為氮源培養(yǎng)隱藻效果強(qiáng)于氯化銨。本人研究證實(shí)每升培養(yǎng)液中添加1-3毫升的尿液對波吉卵囊藻生長有較好促進(jìn)作用。
[0005]目前，波吉 卵囊藻規(guī)?；囵B(yǎng)存在的主要問題是藻細(xì)胞生長緩慢、倍增時間長、產(chǎn)量低、易污染。合適的培養(yǎng)基是實(shí)現(xiàn)波吉卵囊藻高密度養(yǎng)殖的基礎(chǔ)。波吉卵囊藻的培養(yǎng)傳統(tǒng)上使用f/2培養(yǎng)基，其中不含碳酸氫鈉和九二 O植物生長刺激素，但我的實(shí)驗(yàn)研究表明，波吉卵囊藻除了能利用空氣中游離的CO2，還能有效地利用培養(yǎng)液中的HC03_作為碳源，波吉卵囊藻培養(yǎng)基中添加適量的NaHCO3、九二 O植物生長刺激素、海泥抽取液、牛糞和羊糞浸出液、土壤抽出液及復(fù)合維生素等不僅縮短了波吉卵囊藻倍增時間，而且延長了生長時間，大大提聞了生長速度，操廣量能提聞180%。
[0006]傳統(tǒng)上，波吉卵囊藻采用開放水泥池培養(yǎng)，培養(yǎng)規(guī)模大，產(chǎn)量高，但缺點(diǎn)也十分明顯:易污染，占地面積大，受天氣影響大，不易掌控，一次性投資大，單產(chǎn)低，見效慢，經(jīng)濟(jì)效益低，不適用于擴(kuò)種階段。我采用家庭用的礦泉水桶培養(yǎng)方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的開放水泥池培養(yǎng)，不僅操作簡單，不易污染，易于掌控，規(guī)?？纱罂尚?，靈活多樣，塑料桶不易劃破，安全可靠，透光性好，可重復(fù)使用，而且一年四季均可生產(chǎn)，成本低，生長快，尤其適用于擴(kuò)種階段，產(chǎn)量大大提聞。
[0007]關(guān)于波吉卵囊藻細(xì)胞收集方法，過去最常用的方法是離心機(jī)離心，無污染，離心較徹底，但缺點(diǎn)太明顯:離心設(shè)備昂貴，即使一臺簡易的大型離心機(jī)也需要40萬-50萬元人民幣，不僅耗電量大，運(yùn)行費(fèi)用高，而且會打碎藻細(xì)胞，降低產(chǎn)量。也有人采用明礬和石灰水沉淀法收集藻細(xì)胞，回收效率較高，但明礬和石灰對藻細(xì)胞有污染及傷害作用，而且費(fèi)用很高。我的實(shí)驗(yàn)和研究表明，黃泥漿法收集波吉卵囊藻不僅回收率高，沉淀徹底，而且簡單易行，花錢少，設(shè)備簡單，材料易得，易于操作，對波吉卵囊藻細(xì)胞沒有任何傷害，適于大規(guī)模生產(chǎn)和推廣，經(jīng)濟(jì)效益高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種波吉卵囊藻培養(yǎng)基配方:NH4N036毫克，K2HP044 毫克，尿素 2 毫克，Na2SiO3.9H205 毫克，MgSO4.7H2012 毫克，NaHC0340 毫克，九二 O植物生長刺激素400國際單位，f/2維生素溶液I毫升，f/2微量元素溶液I毫升，人尿1.5毫升,海泥抽取液2毫升,牛糞浸出液I毫升,羊糞浸出液1.2毫升,土壤抽出液I暈升，消毒海水1000毫升。其中f/2微量元素溶液配方=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010 毫克，F(xiàn)eC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35克，純水1000毫升；f/2維生素溶液配方:維生素B120.5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H0.5毫克，純水`1000毫升。消毒海水制備方法:每I立方米海水中加入漂白液200-300毫升，使海水中有效氯含量達(dá)到10-20mg/L，空氣壓縮機(jī)充氣8_12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止。
[0009]一種波吉卵囊藻高密度培養(yǎng)方式，其特征在于包括如下步驟:
[0010]培養(yǎng)容器為家庭用的礦泉水桶，容積約20升，無色透明或帶淺天藍(lán)色，洗刷干凈，后用蒸餾水潤洗3遍，用漏斗裝入上述培養(yǎng)基12升，充分搖勻5分鐘，選擇生命力旺盛、無污染的波吉卵囊藻液進(jìn)行接種，接種密度15 X 104-20 X 104cell/mL，瓶口插入兩根干凈玻璃管，一根長58厘米，插入較深，離瓶底5厘米，用以充氣；另一根長15厘米，兩端露出瓶口即可，用以排氣。兩根玻璃管同樣粗細(xì)，直徑6毫米。最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干凈的透明膠帶封口并將兩根玻璃管固定。長的玻璃管上端露出瓶口 10-15厘米，用乳膠管或塑料管與空氣壓縮機(jī)或氣泵相連，一天24小時連續(xù)充氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可。室內(nèi)培養(yǎng)，空調(diào)控溫，最佳溫度26±2°C，日光燈照射，光照強(qiáng)度10000-120001x，光/暗周期為16L/8D，即光照16小時，黑暗8小時。培養(yǎng)至第6天，停止充氣，揭開透明膠帶，用漏斗從瓶口加入2升新鮮培養(yǎng)基，膠帶重新封口，充氣，繼續(xù)培養(yǎng)，至第10天，密度增加至800 X IO4-1OOO X IO4CelΙ/mL，停止培養(yǎng)，從瓶口倒出藻液，將礦泉水桶洗刷干凈后，加入中藥消毒液消毒10-30分鐘，后進(jìn)入下一輪培養(yǎng)。
[0011]所述中藥消毒液:由以下重量比的物質(zhì)組成:黃芩7~10份、黃秋葵粉3~5份、魚腥草3~5份、大黃5~10份、甘草5~10份；將上述藥材放入可加熱的容器中，加入3~5倍體積的純凈水，煮沸后持續(xù)煮30~50分鐘，后過濾，沉淀I~2小時，后取澄清液即可；所述黃秋葵粉是清洗干凈并烘干后的黃秋葵莖葉、花及籽粒經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎至250目，然后攪勻、滅菌所得。
[0012]波吉卵囊藻細(xì)胞收集方法
[0013]取新鮮黃泥巴I公斤于塑料水桶中，加入10升蒸餾水，玻璃棒充分?jǐn)嚢?5分鐘，后置于黑暗處靜置沉淀24小時，取上清液，用網(wǎng)目孔徑80-100 μ m的篩絹過濾，除去沉渣后，留下清液，用離心機(jī)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速4500r/min，取上清液，裝入棕色磨口塞試劑瓶，密封，置于4°C冰箱保存，備用。將培養(yǎng)完的藻液按每I升藻液加入250毫升黃泥巴上清液的量加入黃泥巴上清液，充分?jǐn)嚢?0分鐘，后置于黑暗處，靜置沉淀48小時，98%的藻細(xì)胞可沉淀到底部，棄上清液，即得綠色牙膏狀藻泥，110°C噴霧干燥法烘干藻泥可得綠色面粉狀藻粉，收集完成。
[0014]有益效果
[0015]波吉卵囊藻的培養(yǎng)傳統(tǒng)上使用f/2培養(yǎng)液配方，生長速度慢，產(chǎn)量低。我的新發(fā)明用NaNO3和尿素作氮源，添加適量的NaHCO3并補(bǔ)充了九二 O植物生長刺激素、f/2維生素、人尿、海泥抽取液、牛糞及羊糞浸出液和土壤抽出液，營養(yǎng)更均衡、全面，大大加快了波吉卵囊藻生長速度。波吉卵囊藻的培養(yǎng)方式，我采用家庭用的礦泉水桶培養(yǎng)方法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的開放水泥池培養(yǎng)，操作簡單，不易污染，易于掌控，規(guī)?？纱罂尚。`活多樣，塑料桶不易劃破，安全可靠，透光性好，可重復(fù)使用，一年四季均可生產(chǎn)，成本低，生長快，尤其適用于擴(kuò)種階段，產(chǎn)量提高180%。波吉卵囊藻細(xì)胞收集方法，過去常用的方法是離心機(jī)離心，該方法設(shè)備昂貴，耗電量巨大且會打碎細(xì)胞，降低產(chǎn)`量。也有人采用明礬沉淀法收集藻細(xì)胞，回收率較高，但明礬對藻細(xì)胞有污染和傷害作用且費(fèi)用很高。我發(fā)明的黃泥漿法收集波吉卵囊藻細(xì)胞不但回收率高，沉淀徹底，而且簡單易行，花錢少，設(shè)備簡單，材料易得，易于操作，對波吉卵囊藻細(xì)胞沒有任何傷害，適于大規(guī)模生產(chǎn)和推廣，經(jīng)濟(jì)效益高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖為波吉卵囊藻塑料桶高密度培養(yǎng)方式圖。
[0017]其中附圖標(biāo)記為:1礦泉水桶；2充氣管；3排氣管；4藻液。
【具體實(shí)施方式】
[0018]培養(yǎng)基配制方法
[0019]I)九二 O植物生長刺激素為白色結(jié)晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(每克用50毫升酒精或60度白酒溶解I小時以上)，再按所需濃度兌水稀釋；
[0020]2)配制培養(yǎng)基的過程中需不斷攪水，消毒海水中加完一種營養(yǎng)鹽，不停地?cái)嚢?，?分鐘，再加下一種，而且各種營養(yǎng)鹽按配方提供的順序加入，以免發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；[0021]3)各種營養(yǎng)鹽特別是f/2維生素溶液需預(yù)先配成母液，置于4°C冰箱冷藏保存，備用；
[0022]4)海泥浸出液制備方法:取海灘上沙質(zhì)較少、有機(jī)質(zhì)較多而又不過分於黑的上層軟泥，清除其中的小樹枝和小石塊等雜物，以容量計(jì)算一份泥加兩份水，充分?jǐn)嚢杈鶆?，靜置10-15分鐘，待粗砂、小石下沉后，把上層泥漿倒入鋁鍋中，棄去底部粗砂、小石等雜物，按每1000毫升泥漿加入1克的量加入NaOH，煮沸20-30分鐘，煮時需不斷攪拌，煮后靜置24小時，吸取上清液，裝入棕色試劑瓶，密封，置于4°C冰箱保存，備用；
[0023]5)因檸檬酸鐵(FeC6H5O7.5H20)較難溶解，可加少量自來水在火爐上微熱至80-90°C，并不斷攪拌至全部融化；
[0024]6)人尿制備方法:取人尿1000毫升，燒瓶煮沸15分鐘后，冷卻24小時，裝入白色
透明磨口塞試劑瓶，密封，置于4°C冰箱保存，備用；
[0025]7)羊糞浸出液制備方法:取新鮮羊糞10公斤，加入麩皮1公斤，玉米面0.5公斤，自來水I升，充分?jǐn)嚢瑁b入塑料袋發(fā)酵10天，后取2公斤放入盆中，加入6升蒸餾水，充分?jǐn)嚢?5分鐘，靜置，36小時后500目篩絹過濾，取濾液加熱煮沸30分鐘，以殺死其中的病毒等微生物，冷卻，靜置72小時，取上清液，即為羊糞浸出液，裝入磨口塞試劑瓶，密封，置于
4°C冰箱保存，備用；
[0026]8)牛糞浸出液制備方法:取牛糞50公斤，加入麩皮3公斤，玉米面1公斤，自來水4升，充分?jǐn)嚢瑁殉蓤A錐狀，自然發(fā)酵15天，后攤成薄層，陽光下暴曬3天，后取3公斤放入水桶中，加入10升蒸餾水，充分?jǐn)噭颍o置，48小時后400目篩絹過濾，取濾液加熱，煮沸45分鐘，殺死其中的細(xì)菌、霉菌、病毒等，冷卻，沉淀48小時，取上清液，即得牛糞浸出液，裝入磨口塞試劑瓶，密封，置于4°C冰箱保存，備用；
[0027]9) 土壤抽出液制備方法:取草地上層有機(jī)質(zhì)較多且較松散土壤1公斤，加蒸餾水1000毫升，再加入Na0H2.5克，充分?jǐn)嚢?，煮?20分鐘，冷卻后過濾，將清液置于暗處靜置48小時，取上清液裝入棕色試劑瓶，密封，置于4°C冰箱保存，備用；
[0028]10)消毒海水制備方法:每I立方米海水中加入漂白液200-300毫升，使海水中有效氯含量達(dá)到10-20mg/L，空氣壓縮機(jī)充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止；
[0029]11)配制培養(yǎng)基所用的化學(xué)藥品純度均需分析純級別；
[0030]12)此培養(yǎng)基配方對波吉卵囊藻擴(kuò)種和大規(guī)模培養(yǎng)各階段都適用。
[0031]一種波吉卵囊藻培養(yǎng)基配方:NH4N036毫克，K2HP044毫克，尿素2毫克，Na2SiO3.9H205毫克，MgSO4.7H2012毫克，NaHC0340毫克，九二 0植物生長刺激素400國際單位，f/2維生素溶液I毫升，f/2微量元素溶液I毫升,人尿1.5毫升,海泥抽取液2毫升，牛糞浸出液I毫升，羊糞浸出液1.2毫升，土壤抽出液I毫升，消毒海水1000毫升。其中f/2微量元素溶液配方=ZnSO4.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010毫克，F(xiàn)eC6H507.5H203.9 克，Na2MoO4.2H207.3 毫克，CoCl2.6H2012 毫克，Na2EDTA4.35 克，純水1000毫升；f/2維生素溶液配方:維生素B120.5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H0.5毫克，純水1000毫升。
[0032]一種波吉卵囊藻高密度培養(yǎng)技術(shù)，參見附圖1，其特征在于包括如下步驟:
[0033]培養(yǎng)容器為家庭用的礦泉水桶，容積約20升，無色透明或帶淺天藍(lán)色，洗刷干凈，后用蒸餾水潤洗3遍，用漏斗裝入上述培養(yǎng)基12升，充分搖勻5分鐘，選擇生命力旺盛、無污染的波吉卵囊藻液進(jìn)行接種，接種密度15 X 104-20 X 104cell/mL，瓶口插入兩根干凈玻璃管，一根長58厘米，插入較深，離瓶底5厘米，用以充氣；另一根長15厘米，兩端露出瓶口即可，用以排氣。兩根玻璃管同樣粗細(xì)，直徑6毫米。最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干凈的透明膠帶封口并將兩根玻璃管固定。長的玻璃管上端露出瓶口 10-15厘米，用乳膠管或塑料管與空氣壓縮機(jī)或氣泵相連，一天24小時連續(xù)充氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可。室內(nèi)培養(yǎng)，空調(diào)控溫，最佳溫度26±2°C，日光燈照射，光照強(qiáng)度10000-120001x，光/暗周期為16L/8D，即光照16小時，黑暗8小時。培養(yǎng)至第6天，停止充氣，揭開透明膠帶，用漏斗從瓶口加入2升新鮮培養(yǎng)基，膠帶重新封口，充氣，繼續(xù)培養(yǎng)，至第10天，密度增加至800 X IO4-1OOO X IO4Cel Ι/mL，從瓶口倒出藻液，將礦泉水桶洗刷干凈后，加入中藥消毒液消毒10-30分鐘，后進(jìn)入下一輪培養(yǎng)。
[0034]所述中藥消毒液:由以下重量比的物質(zhì)組成:黃芩7~10份、黃秋葵粉3~5份、魚腥草3~5份、大黃5~10份、甘草5~10份；將上述藥材放入可加熱的容器中，加入3~5倍體積的純凈水，煮沸后持續(xù)煮30~50分鐘，后過濾，沉淀I~2小時，后取澄清液即可；所述黃秋葵粉是清洗干凈并烘干后的黃秋葵莖葉、花及籽粒經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎至250目，然后攪勻、滅菌所得。
[0035]波吉卵囊藻細(xì)胞收集方法
[0036]取新鮮黃泥巴I公斤于塑料水桶中，加入10升蒸餾水，玻璃棒充分?jǐn)嚢?5分鐘，后置于黑暗處靜置沉淀24小時，取上清液，用網(wǎng)目孔徑80-100 μ m的篩絹過濾，除去沉渣后，留下清液，用離心機(jī)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速4500r/min，取上清液，裝入棕色磨口塞試劑瓶，密封，置于4°C冰箱保存，備用。將培養(yǎng)完的藻液按每I升藻液加入250毫升黃泥巴上清液的量加入黃泥巴上清液，充分?jǐn)嚢?0分鐘，后置于黑暗處，靜置沉淀48小時，98%的藻細(xì)胞可沉淀到底部，棄上清液，即得綠色牙膏狀藻泥，110°C噴霧干燥法烘干藻泥可得綠色面粉狀藻粉，收集完成。
`[0037]最后應(yīng)說明的是:以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:其依然可以對前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種波吉卵囊藻培養(yǎng)基，其特征在于配方如下:NH4N036毫克，K2HP044毫克，尿素2毫克，Na2SiO3.9H205毫克，MgSO4.7H2012毫克，NaHC0340毫克，九二 O植物生長刺激素400國際單位，f/2維生素溶液I毫升，f/2微量兀素溶液I毫升，人尿1.5毫升,海泥抽取液2毫升，牛糞浸出液I毫升，羊糞浸出液1.2毫升，土壤抽出液I毫升，消毒海水1000毫升；其中f/2微量元素溶液配方:ZnS04.4H2023毫克，MnCl2.4H20178毫克，CuSO4.5H2010毫克，F(xiàn)eC6H5O7.5Η203.9 克，Na2MoO4.2Η207.3 毫克，CoCl2.6Η2012 毫克，Na2EDTA4.35 克，純水1000毫升；f/2維生素溶液配方:維生素B120.5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H0.5毫克，純水1000毫升。消毒海水制備方法:每I立方米海水中加入漂白液200-300毫升，使海水中有效氯含量達(dá)到10-20mg/L，空氣壓縮機(jī)充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止。
2.一種波吉卵囊藻高密度培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟: 培養(yǎng)容器為家庭用的礦泉水桶，容積約20升，無色透明或帶淺天藍(lán)色，洗刷干凈，后用蒸餾水潤洗3遍，用漏斗裝入上述培養(yǎng)基12升，充分搖勻5分鐘，選擇生命力旺盛、無污染的波吉卵囊藻液進(jìn)行接種，接種密度15X 104-20X 104cell/mL，瓶口插入兩根干凈玻璃管，一根長58厘米，插入較深，離瓶底5厘米，用以充氣；另一根長15厘米，兩端露出瓶口即可，用以排氣。兩根玻璃管同樣粗細(xì)，直徑6毫米。最后用酒精棉球擦拭瓶口，用干凈的透明膠帶封口并將兩根玻璃管固定。長的玻璃管上端露出瓶口 10-15厘米，用乳膠管或塑料管與空氣壓縮機(jī)或氣泵相連，一天24小時連續(xù)充氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可。室內(nèi)培養(yǎng)，空調(diào)控溫，最佳溫度26±2°C，日光燈照射，光照強(qiáng)度10000-120001x，光/暗周期為16L/8D，即光照16小時，黑暗8小時。培養(yǎng)至第6天，停止充氣，揭開透明膠帶，用漏斗從瓶口加入2升新鮮培養(yǎng)基，膠帶重新封口，充氣，繼續(xù)培養(yǎng)，至第10天，密度增加至800 X IO4-1OOO X 104 cell/mL,停止培養(yǎng)，從瓶口倒出藻液，將礦泉水桶洗刷干凈后，加入中藥消毒液消毒10-30分鐘，后進(jìn)入下一輪培養(yǎng)。 所述中藥消毒液:由以下重量比的物質(zhì)組成:黃芩7~10份、黃秋葵粉3~5份、魚腥草3~5份、大黃5~10份、甘草5~10份；將上述藥材放入可加熱的容器中，加入3~5倍體積的純凈水，煮沸后持續(xù)煮30~50分鐘，后過濾，沉淀I~2小時，后取澄清液即可；所述黃秋葵粉是清洗干凈并烘干后的黃秋葵莖葉、花及籽粒經(jīng)超微粉碎機(jī)粉碎至250目，然后攪勻、滅菌所得。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的波吉卵囊藻細(xì)胞收集方法，其特征在于: 取新鮮黃泥巴I公斤于塑料水桶中，加入10升蒸餾水，玻璃棒充分?jǐn)嚢?5分鐘，后置于黑暗處靜置沉淀24小時，取上清液，用網(wǎng)目孔徑80-100 μ m的篩絹過濾，除去沉渣后，留下清液，用離心機(jī)離心15分鐘，轉(zhuǎn)速4500r/min，取上清液，裝入棕色磨口塞試劑瓶，密封，置于4°C冰箱保存，備用。將培養(yǎng)完的藻液按每I升藻液加入250毫升黃泥巴上清液的量加入黃泥巴上清液，充分?jǐn)嚢?0分鐘，后置于黑暗處，靜置沉淀48小時，98%的藻細(xì)胞可沉淀到底部，棄上清液，即得綠色牙膏狀藻泥，110°C噴霧干燥法烘干藻泥可得綠色面粉狀藻粉，收集完成。
【文檔編號】C12R1/89GK103820325SQ201410073501
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月3日
【發(fā)明者】王培磊 申請人:臨沂大學(xué)