牛體外受精胚胎培養(yǎng)液和培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種專用于牛體外受精胚胎的培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液中含NaCl109.0-110mM、KCl2.9-3.1mM、NaHCO326.0-26.5mM、MgCl2·6H2O0.5-1.0mM、KH2PO31.0-1.3mM、丙酮酸鈉0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸鈣5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺1mM、2v/v%必需氨基酸、1v/v%非必須氨基酸和谷胱甘肽1-10mM。將牛體外受精胚胎置于上述培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示明顯優(yōu)于未添加GSH的對(duì)照組，提高了囊胚發(fā)育率及胚胎質(zhì)量，降低體外生產(chǎn)胚胎的成本，為牛IVF技術(shù)應(yīng)用于實(shí)踐提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，可大大加速遺傳育種進(jìn)程。
【專利說(shuō)明】牛體外受精胚胎培養(yǎng)液和培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)-畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種牛體外受精胚胎培養(yǎng)液和培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技的發(fā)展，為了更充分利用良種母牛的繁殖潛力，加速遺傳育種進(jìn)程，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)用高效的繁殖新技術(shù)成為必然?；铙w采卵(Ovum pick UP,0PU)和體外受精技術(shù)(In Vitro Fertilization, IVF)是二十世紀(jì)八十年代快速發(fā)展起來(lái)的胚胎工程新技術(shù)，二者相結(jié)合可獲得大量遺傳系譜明確的胚胎，從而縮短世代間隔。目前，這兩種技術(shù)已經(jīng)成為歐美和大洋洲等畜牧業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家的農(nóng)場(chǎng)主為擴(kuò)大良種母牛群而采用的重要繁殖技術(shù)。然而，采用常規(guī)的牛胚胎培養(yǎng)體系(CRlaa和SOF液)，牛體外受精的囊胚發(fā)育率較低，而且胚胎質(zhì)量也遠(yuǎn)不及體內(nèi)胚胎，導(dǎo)致胚胎移植受體后的妊娠率低，因此如何提高囊胚發(fā)育率及胚胎質(zhì)量成為體外受精胚胎生產(chǎn)的重點(diǎn)和研究的焦點(diǎn)。
[0003]早在1878年，德國(guó)人Scnenk就以家兔和豚鼠為材料，開始探索哺乳動(dòng)物的體外受精技術(shù)。但直到1951年，美籍華人張民覺和Austin分別發(fā)現(xiàn)精子體外獲能現(xiàn)象后，體外受精技術(shù)才獲得了突破性進(jìn)展。牛體外受精技術(shù)受到卵母細(xì)胞的體外成熟、精子的體外獲能、受精卵的體外培養(yǎng)環(huán)境等多個(gè)方面的影響。
[0004]胚胎的體外培養(yǎng)是IVF技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，亦是卵母細(xì)胞體外成熟和體外受精技術(shù)最終效果的體現(xiàn)和檢驗(yàn)。在體外受精后，受精卵在向囊胚發(fā)育過(guò)程中將需經(jīng)歷一系列重要的變化，包括合子的形成 、第一次卵裂、胚胎基因組的激活、致密化以及形成囊胚。這一過(guò)程中，外界環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)發(fā)生改變，從而影響胚胎的正常發(fā)育及質(zhì)量。目前，哺乳動(dòng)物早期胚胎的體外培養(yǎng)研究主要集中在改善培養(yǎng)液成分以滿足不同發(fā)育階段的胚胎營(yíng)養(yǎng)需求。基于Rosenkrans等(1991年)開發(fā)的Charles Rosenkransl (CRl)培養(yǎng)液和Tervit等(1972年)開發(fā)的合成輸卵管液(SyntheticOviductal Fluid, S0F),經(jīng)多年不斷改進(jìn)逐步形成了兩種培養(yǎng)體系。據(jù)Hakan Sagirkaya等(2007年)和Somfai等(2010年)研究成果表明，CRlaa培養(yǎng)液用于牛胚胎培養(yǎng)有較好的效果，可以廣泛應(yīng)用于牛的胚胎培養(yǎng)Thompson, J.G.等(2000年)和Jean M.Feugang等(2009年)的研究結(jié)果顯示，SOF培養(yǎng)液也是一種適合于牛胚胎培養(yǎng)的培養(yǎng)體系。張志平等(2006年)和桑國(guó)俊等(2008年)研究結(jié)果也顯示，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的CRlaa和SOF培養(yǎng)液均適合于牛的體外胚胎培養(yǎng)，均取得良好的培養(yǎng)效果。哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育是一個(gè)高度協(xié)調(diào)且精確調(diào)節(jié)的過(guò)程。在進(jìn)化過(guò)程中，配子細(xì)胞逐步形成了一系列的分子級(jí)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，以保證胚胎發(fā)育周期系統(tǒng)地進(jìn)行。在發(fā)育過(guò)程中，胚胎的內(nèi)外活性氧自由基(Reactive Oxygen Species, R0S)與抗氧化劑的平衡對(duì)早期胚胎發(fā)育起著決定性作用。
[0005]大多生化反應(yīng)均產(chǎn)生R0S，其在細(xì)胞內(nèi)、外均有著重要的作用，一部分ROS起著信號(hào)分子的作用，但是大多數(shù)ROS對(duì)機(jī)體是有害的。Brooker，R.J.等(2011年)報(bào)道，ROS可以引起細(xì)胞DNA損傷、不飽和脂肪酸的氧化、蛋白質(zhì)中氨基酸的氧化甚至可以導(dǎo)致某些酶的失活。一般來(lái)說(shuō)，ROS以四種形式存在，其中H2O2氧化作用較強(qiáng)，是引起氧化傷害的最主要因素。
[0006] 大量研究表明，谷胱甘肽(GSH)是以非蛋白質(zhì)形式存在的一種抗氧化劑，能夠清除多種自由基:超氧陰離子自由基、羥基自由基、過(guò)氧化氫、次氯酸和脂氧自由基，并且能夠維持細(xì)胞內(nèi)外氧化還原平衡。細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境GSH和ROS水平是影響受精卵發(fā)育過(guò)程中的兩個(gè)重要因素。早在2000年，de Matos等曾通過(guò)在體外胚胎培養(yǎng)過(guò)程中添加β-巰基乙醇、半胱氨酸和胱氨酸來(lái)提高囊胚率。
[0007]盡管體外受精技術(shù)能成功應(yīng)用于許多哺乳動(dòng)物，但由于體外受精的囊胚率低而導(dǎo)致體外受精胚胎的生產(chǎn)成本高、效率低，限制了該技術(shù)在牛快速擴(kuò)繁實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用。因此，如何能夠降低成本并提高牛IVF胚胎生產(chǎn)效率和胚胎質(zhì)量成為亟待解決的問(wèn)題。
[0008]目前，牛體外受精的技術(shù)體系中主要以CRlaa和SOF液為胚胎體外培養(yǎng)液，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，囊胚發(fā)育率均有不同程度的提高，囊胚發(fā)育率平均為30%-40%。對(duì)于囊胚質(zhì)量,可以通過(guò)囊胚細(xì)胞總數(shù)、ICM細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)比例、細(xì)胞凋亡率來(lái)評(píng)估。囊胚細(xì)胞總數(shù)根據(jù)囊胚所處階段的不同而不同，S.1wasaki等(1990年)獲得的牛早期囊胚總細(xì)胞數(shù)平均為44，ICM細(xì)胞數(shù)/囊胚總細(xì)胞數(shù)比例為15.8%左右；Andrew J.Watson等(2000年)統(tǒng)計(jì)牛囊胚細(xì)胞凋亡率約為7.7%-13%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明旨在提高牛IVF胚胎生產(chǎn)效率和胚胎質(zhì)量，提供一種專用于牛體外受精胚胎的培養(yǎng)液和培養(yǎng)方法。
[0010]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)液配方為=NaCl 109.0-1lOmM, KC12.9-3.1mM, NaHC0326.0-26.5mM、MgCl2.6Η200.5-1.0mM、KH2PO3L 0-1.3mM、丙酮酸鈉0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸鈣5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺lmM、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必須氨基酸和谷胱甘肽l_10mM，以水配制。
[0011]所述培養(yǎng)液配方優(yōu)選為:NaC1109.0M、KC13.1M、NaHC0326.2M、MgCl2.6H200.8mM、KH2PO3L 19M、丙酮酸鈉0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸鈣5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺lmM、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必須氨基酸和谷胱甘肽1-lOmM。
[0012]所述必需氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為=L-鹽酸精氨酸6.32g/L、L-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/L、L-鹽酸組氨酸一水物2.lg/L、L-異亮氨酸2.625g/L、L-亮氨酸2.62g/L、L-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/L、L-蛋氨酸0.755g/L、L-苯丙氨酸1.65g/L、L-蘇氨酸2.38g/L、L_色氨酸0.51g/L、L_酪氨酸1.8g/L和L-繳氨酸 2.34g/L。
[0013]所述非必須氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為=L-丙氨酸0.89g/L、:L-天門冬酰胺一水物1.5g/L、L-天冬氨酸1.33g/L、L-谷氨酸1.47g/L、甘氨酸 0.75g/L、L-脯氨酸 1.15g/L 和 L-絲氨酸 1.05g/L。
[0014]優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽含量為lmM、3mM、5mM或7mM。
[0015]更優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽含量為3mM或5mM。
[0016]最優(yōu)選地，所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽含量為3mM。
[0017]本發(fā)明還提供一種牛體外受精胚胎的培養(yǎng)方法，將牛體外受精胚胎置于上述牛體外受精胚胎培養(yǎng)液中，在38.5°C、0.5%C02、100%濕度條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。
[0018]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0019]本發(fā)明通過(guò)在培養(yǎng)液中添加一定濃度的谷胱甘肽(Glutathione, GSH),能顯著提高體外胚胎的發(fā)育能力。同時(shí)對(duì)囊胚進(jìn)行差異染色，區(qū)分內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner CellMass, ICM)、滋養(yǎng)層細(xì)胞和凋亡細(xì)胞，比較總細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算ICM細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)比例和凋亡率，結(jié)果顯示添加GSH的試驗(yàn)組優(yōu)于對(duì)照組，提高了囊胚發(fā)育率及胚胎質(zhì)量，降低體外生產(chǎn)胚胎的成本，為牛IVF技術(shù)應(yīng)用于實(shí)踐提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，可大大加速遺傳育種進(jìn)程。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0021]實(shí)施例牛體外受精胚胎的培養(yǎng)方法
[0022]一、試劑
[0023]成熟培養(yǎng)液:含0.01IU/ml FSHUOIU/ml LH、I μ g/ml 雌二醇、100ng/ml IGF、50ng/ml EGF, lOOU/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素、10%胎牛血清的TCM-199培養(yǎng)液。
[0024]洗精液:含112.0mM NaCl,4.02mM KCl,2.25mM CaCl2.2Η20、0.52mM MgCl2.6H20、0.83mM KH2PO3,37.0mM NaHC03、L 25mM 丙酮酸鈉、10 μ g/ml 肝素、4mg/ml 牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、10mM 咖啡因、lOOU/ml 青霉素、100 μ g/ml 鏈霉素的水溶液。 [0025]受精液:含112.0mM NaCl,4.02mM KCl,2.25mM CaCl2.2Η20、0.52mM MgCl2.6H20、
0.83mM KH2PO3,37.0mM NaHC03、1.25mM丙酮酸鈉、10 μ g/ml 肝素、4mg/ml BSA、lOOU/ml 青霉素、100 μ g/ml鏈霉素的水溶液。
[0026]胚胎前期培養(yǎng)液:含109.5mM NaCl,3.1mM KCl,26.2mMNaHC03、0.8mM MgCl2.6Η20、
1.19mM ΚΗ2Ρ03、0.4mM丙酮酸鈉、1.5mM葡萄糖、5mM半乳糖酸H6mg/ml BSA>ImM L-谷氨酰胺、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必須氨基酸的水溶液。胚胎后期培養(yǎng)液:含109.5M NaCl,
3.1M KC1、26.2M NaHC03>0.8M MgCl2.6Η20、1.19ΜΚΗ2Ρ03、0.4Μ丙酮酸鈉、1.5Μ葡萄糖、5Μ半乳糖酸1丐、10v/v%胎牛血清(Fetal bovine serum, FBS)、IM L-谷氨酰胺、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必須氨基酸的水溶液。
[0027]所述必需氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為=L-鹽酸精氨酸6.32g/L、L-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/L、L-鹽酸組氨酸一水物2.lg/L、L-異亮氨酸2.625g/L、L-亮氨酸2.62g/L、L-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/L、L-蛋氨酸0.755g/L、L-苯丙氨酸1.65g/L、L-蘇氨酸2.38g/L、L_色氨酸0.51g/L、L_酪氨酸1.8g/L和L-繳氨酸 2.34g/L。
[0028]所述非必須氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為=L-丙氨酸0.89g/L、:L-天門冬酰胺一水物1.5g/L、L-天冬氨酸1.33g/L、L-谷氨酸
1.47g/L、甘氨酸 0.75g/L、L-脯氨酸 1.15g/L 和 L-絲氨酸 1.05g/L。
[0029]二、卵母細(xì)胞的采集和體外成熟
[0030]1.從屠宰場(chǎng)采集牛卵巢，置于37°C生理鹽水中，3h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。
[0031]2.使用含有青霉素和鏈霉素的溫?zé)岬纳睇}水將卵巢清洗3-5次。
[0032]3.使用真空蠕動(dòng)泵，用18號(hào)針頭抽取5-8毫米卵泡中的卵泡液。[0033]4.體視顯微鏡下挑選卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，在洗卵液中將COCs洗漆兩次，在成熟培養(yǎng)液中洗漆一次。
[0034]5.將洗干凈的COCs放入含有成熟培養(yǎng)液并覆蓋礦物油的四孔板中，每孔培養(yǎng)50枚 COCs，培養(yǎng) 22-24h。
[0035]三、體外受精
[0036]1.將COCs從成熟培養(yǎng)液中移入50 μ I受精滴中，每滴放15枚COCs。
[0037]2.38°C水浴解凍精液，使用5ml洗精液在500g條件下離心5min ;棄上清，再加入5ml洗精液離心5min，棄上清，使用洗精液調(diào)整精子濃度，使精子濃度約為2X IO7個(gè)/ml。
[0038]3.取50 μ I精液，與含有COCs的受精滴混合成為100 μ I的液滴。
[0039]4.38.50C，5%C02氣體，95%濕度條件下精卵共孵育8h。
[0040]四、胚胎體外培養(yǎng)
[0041]1.精卵共孵育8h后，取出卵母細(xì)胞，使用lmg/ml的透明質(zhì)酸酶處理3min，然后使用移液槍反復(fù)吹打，直至卵丘細(xì)胞基本脫落。
[0042]2.使用含10%FBS的TCM199終止透明質(zhì)酸酶的消化，用口吸管將疑似受精卵在胚胎前期培養(yǎng)液中洗3次后放入胚胎前期培養(yǎng)液滴中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0043]3.48h后，將卵裂至4-8細(xì)胞的胚胎移至胚胎后期培養(yǎng)液滴中，48h后半量更換胚胎后期培養(yǎng)液。
[0044]4.第7天時(shí),統(tǒng)計(jì)囊胚率。
[0045]五、GSH最適添加濃度篩選
[0046]1.配制0.5M的GSH作為儲(chǔ)液。
[0047]2.使用GSH儲(chǔ)液，按照終濃度為lmM、3mM、5mM、7mM梯度配制為試驗(yàn)組，以非添加組為對(duì)照。
[0048]3.分別于培養(yǎng)的第48h、第5天、第7天，統(tǒng)計(jì)各個(gè)組的卵裂卵與8細(xì)胞率、桑椹胚率和囊胚率。
[0049]六、胚胎差異染色
[0050]1.選取體外培養(yǎng)第7天的囊胚,使用2%多聚甲醒固定20min。
[0051 ] 2.使用含0.5%BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS-BSA)洗兩次，放入透化液(50 μ ITriton,5 μ I Tween 和 9.945ml PBS)中，室溫放置 30min。
[0052]3.使用2M鹽酸室溫處理20min，然后使用IOOmM Tris-HCl室溫處理lOmin，使
⑶X2蛋白能夠與一抗結(jié)合。
[0053]4.使用PBS-BSA清洗三次，將囊胚放入封閉液(Iml山羊血清、5μ ITween和
8.995ml PBS)中，室溫封閉lh，然后轉(zhuǎn)入4°C冰箱封閉過(guò)夜。
[0054]5.棄去封閉液,⑶X2 —抗用封閉液按1:200稀釋,室溫孵育2h,棄去一抗稀釋液，用PBS-BSA清洗3次，每次5min。
[0055]6.caspase-3一抗(購(gòu)自 Cell Signaling Technology 公司)用封閉液按 1:200 稀釋，室溫孵育2h，棄去一抗稀釋液，用PBS-BSA清洗3次，每次5min。 [0056]7.在避光條件下用封閉液按1:200稀釋⑶X2特異性二抗(購(gòu)自Sigma公司)，室溫下避光放置lh。避光條件下棄去二抗稀釋液，用PBS清洗3次，每次5min。
[0057]8.在避光條件下用封閉液按1:200稀釋caspase-3特異性二抗(購(gòu)自LifeTechnologies公司),室溫下避光放置lh。避光條件下棄去二抗稀釋液,用PBS清洗3次，每次5min。
[0058]9.加入10 μ g/mL的Hochest33342染液染細(xì)胞核，室溫作用5min，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。
[0059]10.實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，每次隨機(jī)選取10個(gè)囊胚，計(jì)算凋亡率、ICM細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)估囊胚質(zhì)量。
[0060]七、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
[0061]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SAS V8中的ANOVA程序進(jìn)行分析，Duncan’ smultiple-range檢驗(yàn)方法判定處理間的差異顯著性，當(dāng)p〈0.05時(shí)認(rèn)為差異顯著。
[0062]八、胚胎后期培養(yǎng)液中添加GSH可顯著提高牛體外受精囊胚的發(fā)育率
[0063]選擇GSH添加濃度為O、1、3、5、7mM進(jìn)行篩選，通過(guò)統(tǒng)計(jì)卵裂率、4-8細(xì)胞率、桑椹胚率、囊胚率(表1 )，結(jié)果各組間的卵裂率和4-8細(xì)胞率均差異不顯著(P > 0.05);對(duì)桑葚胚發(fā)育率，3mM和5mMGSH添加組均顯著高于對(duì)照組和其他實(shí)驗(yàn)組(P < 0.05)，但這兩組間差異不顯著(P > 0.05);對(duì)囊胚率，和5mM GSH添加組均顯著高于對(duì)照組(p < 0.05),而7mM的GSH添加組與對(duì)照組間差異不顯著(p > 0.05)，可見在胚胎后期培養(yǎng)液中添加GSH均可提高牛IVF胚胎的體外發(fā)育率。
[0064]表1不同GSH濃度對(duì)牛IVF胚胎發(fā)育的影響
[0065]
【權(quán)利要求】
1.一種牛體外受精胚胎培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液配方為=NaCl 109.0-1lOmM,KCl 2.9-3.1mM, NaHC0326.0-26.5mM、MgCl2.6Η200.5-1.0mM, KH2PO3L 0-1.3mM、丙酮酸鈉0.4mM、葡萄糖1.5mM、半乳糖酸|丐5mM、10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺lmM、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必須氨基酸和谷胱甘肽1-1OmM,以水配制； 所述必需氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為:L-鹽酸精氨酸6.32g/L、L-胱氨酸二鹽酸鹽1.564g/L、L-鹽酸組氨酸一水物2.lg/L、L_異亮氨酸2.625g/L、L-亮氨酸2.62g/L、L-賴氨酸鹽酸鹽3.625g/L、L-蛋氨酸0.755g/L、L-苯丙氨酸1.65g/L、L-蘇氨酸2.38g/L、L-色氨酸0.51g/L、L_酪氨酸1.8g/L和L-繳氨酸 2.34g/L ； 所述非必須氨基酸為以下氨基酸按比例混合后配制的水溶液，其中，各氨基酸含量為:L-丙氨酸0.89g/L、:L-天門冬酰胺一水物1.5g/L、L-天冬氨酸1.33g/L、L_谷氨酸1.47g/L、甘氨酸0.75g/L、L-脯氨酸1.15g/L和L-絲氨酸1.05g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液配方為:NaC1109.5M、KC13.1M、NaHC0326.2M、MgCl2.6Η200.8mM、KH2PO3L 19M、丙酮酸鈉 0.4mM、葡萄糖 1.5mM、半乳糖酸韓5mM>10v/v%胎牛血清、L-谷氨酰胺lmM、2v/v%必需氨基酸、lv/v%非必須氨基酸和谷胱甘肽1-10禮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽含量為lmM、3mM、5mM 或 7mM。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽含量為3mM或5mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)液，其特征在于，所述培養(yǎng)液中谷胱甘肽含量為3mM。
6.牛體外受精胚胎的培養(yǎng)方法，其特征在于，將牛體外受精胚胎置于權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述培養(yǎng)液中，在38.5°C、0.5%C02、100%濕度條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)。
【文檔編號(hào)】C12N5/073GK103898046SQ201410073635
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月28日
【發(fā)明者】杜衛(wèi)華, 孫尉俊, 朱化彬 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所