一種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種微生物的篩選方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的篩選方法。其根據(jù)七葉靈(6,7-二羥基-香豆素-β-D-葡萄糖苷)在β-葡萄糖苷酶的作用下能生成葡萄糖和七葉苷原(6,7-二羥基-香豆素)，七葉苷原能和Fe3+作用呈現(xiàn)棕黑色來辨別產(chǎn)糖苷酶菌株的96孔板顯色技術(shù)，能同時對大量菌株進(jìn)行高效快速的篩選，同時根據(jù)顏色深淺能靈敏精確判斷菌株產(chǎn)酶高低，還可以減少篩選培養(yǎng)基的用量。一種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的篩選方法，所述的篩選方法包括以下操作步驟：(1)培養(yǎng)基的配制；(2)非釀酒酵母菌的純化，得單菌落；(3)單菌落的活化；(4)在96孔板中添加培養(yǎng)基和活化后的單菌落；(5)通過顏色篩選高產(chǎn)糖苷酶菌株。
【專利說明】一種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的篩選方法
[0001] 一、【技術(shù)領(lǐng)域】： 本發(fā)明涉及一種微生物的篩選方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高產(chǎn)β -葡萄糖苷酶酵母 菌株的篩選方法。
[0002] 二、【背景技術(shù)】： β-葡萄糖苷酶（EC3. 2. 1. 21)，其英文名是β-glucosidas，是纖維素分解酶系中 重要組成成分之一，屬于水解酶類，它的特性是可水解結(jié)合于未端、非還原性的β-D-糖苷 鍵，同時釋放β-D-葡萄糖和相應(yīng)的配基；此外還能微弱地水解對硝基苯β-D-半乳糖和 β-D-木糖苷。β-葡萄糖苷酶的應(yīng)用非常廣泛，被用來增香、分解纖維質(zhì)產(chǎn)酒精、改善發(fā)酵 制品的風(fēng)味等方面。β_葡萄糖苷酶在很多行業(yè)內(nèi)廣泛應(yīng)用，具有巨大的商業(yè)價值。特別 是對于葡萄酒的增香作用更是顯著?，F(xiàn)今用于釀酒的絕大多數(shù)歐亞種（Vitis vinifera) 葡萄栽培品種的成熟果實聞起來沒有明顯的特征香氣，但是所釀酒都有各品種獨特的香氣 特征。原因是大多數(shù)釀酒葡萄品種果實含有的是香氣成分的糖苷結(jié)合體，人體嗅覺器官無 法感知這些不揮發(fā)的香氣成分糖苷，釀酒過程促進(jìn)這些香氣前體物質(zhì)的釋放水解，揮發(fā)出 游離香氣成分。葡萄酒香氣糖苷是香氣成分的預(yù)備庫。比它們對應(yīng)的游離態(tài)成分多好幾倍， 甚至幾十倍。葡萄果粒和釀酒酵母是釀造過程中酶促反應(yīng)主要酶的來源，但是典型的葡萄 酒生產(chǎn)條件，高含糖量高酒精度低PH值和高濃度多酚物質(zhì)等，限制了葡萄與釀酒酵母中糖 苷酶的活性。所以，從自然界中直接篩選在葡萄酒釀造環(huán)境中仍有高效酶活力的β-葡萄 糖苷酶的酵母菌株，成為得到高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株最直接的方法。
[0003] 由于產(chǎn)酶微生物種類豐富，數(shù)量巨大，所以通過定量測定β_葡萄糖苷酶活性來 篩選高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株工作量巨大?，F(xiàn)在研究開發(fā)了幾種能定性分析或鑒定 β -葡萄糖苷酶的顯色技術(shù)，然后在此基礎(chǔ)上進(jìn)行定量分析，就會大大減少工作量，提高篩 選效率。普遍采用的傳統(tǒng)初篩方法主要有以下幾種：①在聚丙烯酰胺凝膠電泳染色時， 將凝膠保溫在對-硝基苯基-β -D-葡萄糖苷溶液中，會在β -葡萄糖苷酶的位置處出現(xiàn) 由硝基酚引起的綠色條帶。但其準(zhǔn)確性不夠，而且由于硝基酚具有較高的擴(kuò)散性，其條帶 會很快逐漸消失。②Rissler利用6-溴-2-萘基β-D-葡萄糖苷為電泳凝膠的保溫溶液 并以重鹽為作用試劑，酶的降解產(chǎn)物溴萘酚在重鹽的作用下形成紅色沉淀。由于重鹽的感 光性，該技術(shù)對操作過程要求苛刻。③使用4-甲基傘形酮-D-葡萄糖苷作為底物，經(jīng) β -葡萄糖苷酶作用后分解為4-甲基傘形酮，利用4-甲基傘形酮具有強(qiáng)烈熒光的特點進(jìn) 行檢測，因而需要紫外光才能觀察，該技術(shù)操作復(fù)雜。④以對硝基苯-β -葡萄糖苷作為底 物，經(jīng)β -葡萄糖苷酶作用后分解為對硝基苯酚，然后加入碳酸鈉進(jìn)行顯色反應(yīng)，產(chǎn)酶的菌 株會呈現(xiàn)亮黃色。該方法靈敏度高，快速，但成本昂貴，而且透明圈和培養(yǎng)基的顏色相似因 此不便于分辨。上述方法同時只能處理篩選一株菌株，所以篩選產(chǎn)糖苷酶菌株工作量巨大。
[0004] 三、
【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明為了解決上述【背景技術(shù)】中的不足之處，提供一種高產(chǎn)β_葡萄糖苷酶酵母菌株 的篩選方法，其根據(jù)七葉靈（6, 7-二羥基-香豆素 -β -D-葡萄糖苷）在β -葡萄糖苷酶 的作用下能生成葡萄糖和七葉苷原（6, 7-二羥基-香豆素），七葉苷原能和Fe3+作用呈現(xiàn) 棕黑色來辨別產(chǎn)糖苷酶菌株的96孔板顯色技術(shù)，能同時對大量菌株進(jìn)行高效快速的篩選， 同時根據(jù)顏色深淺能靈敏精確判斷菌株產(chǎn)酶高低，還可以減少篩選培養(yǎng)基的用量。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株 的篩選方法，其特征在于：所述的篩選方法包括以下操作步驟：（1)培養(yǎng)基的配制；（2)非 釀酒酵母菌的純化，得單菌落；(3)單菌落的活化；(4)在96孔板中添加培養(yǎng)基和活化后 的單菌落；（5)通過顏色篩選高產(chǎn)糖苷酶菌株。
[0006] 所述的步驟（1)培養(yǎng)基的配制：將重量百分比為0. 3%的七葉苷，重量百分比為 0. 05%的檸檬酸鐵，重量百分比為0. 2%的NaCl，重量百分比為0. 05%的MgS04. 7Η20,重量百 分比為0. 1%的ΚΗ2Ρ04和重量百分比為2%的瓊脂加水混合后在121°C滅菌20min，得培養(yǎng) 基； 所述的步驟（2)非釀酒酵母菌的純化：將非釀酒酵母菌先在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng) 5天，得單菌落； 所述的步驟（3)單菌落的活化：根據(jù)單菌落顏色、菌落大小、突起、邊緣及其形態(tài)的不 同，分別挑取不同的單菌落，在添加 Yro液體培養(yǎng)基的試管中活化，每只試管添加 YH)液體 培養(yǎng)基5mL，活化兩天； 所述的步驟（4)在96孔板中添加培養(yǎng)基和活化后的單菌落：在96孔板中，每孔添加 250 μ 1培養(yǎng)基；再添加經(jīng)活化后的單菌落15 μ 1，每個活化后的單菌落添加兩個孔，與作為 對照，同時涂布均勻，記錄好每個單菌落與96孔板相對應(yīng)的編號； 所述的步驟（5)通過顏色篩選高產(chǎn)糖苷酶菌株：培養(yǎng)3天后，選擇呈現(xiàn)顏色深的棕黑 色單菌落，得膠紅酵母(保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位地址：中國、 武漢、武漢大學(xué)；保藏日期：2013年12月13日；保藏編號：CCTCC NO :Μ2013660 ;分類命 名：膠紅酵母北29 (Rhodotorula mucilaginosa北29)。）和膜璞畢赤酵母(保藏單位 名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：中國、武漢、武漢大學(xué)，保藏日期：2013年 12月13日，保藏編號：CCTCC N0:M2013659;分類命名：膜璞畢赤酵母南13 (Pichia membranifaciens南13)。），膠紅酵母(保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏 單位地址：中國、武漢、武漢大學(xué)；保藏日期：2013年12月13日；保藏編號：CCTCC N0 : M2013660;分類命名：膠紅酵母北29 (Rhodotorula mucilaginosa北29)。）和膜撲畢赤 酵母(保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：中國、武漢、武漢大學(xué)，保 藏日期：2013年12月13日，保藏編號：CCTCC NO :M2013659 ;分類命名：膜璞畢赤酵母南 13 (Pichia membranifaciens南13)。）均為高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株。
[0007] 所述的非釀酒酵母菌為美極梅奇酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母、東方伊薩酵母或假 絲酵母。
[0008] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點和效果如下： 1、本發(fā)明利用96孔板代替?zhèn)鹘y(tǒng)平板進(jìn)行篩選產(chǎn)酶菌株，能同時對大量菌株進(jìn)行篩選， 降低了菌株篩選的工作量，同時通過對比顏色深淺來定性判斷菌株產(chǎn)酶高低。
[0009] 2、本發(fā)明對96孔板進(jìn)行創(chuàng)新性應(yīng)用，96孔板原本是用于培養(yǎng)細(xì)胞的平板，在本發(fā) 明中用于篩選菌株，可以用很少的篩選培養(yǎng)基篩選大量的菌株。
[0010] 3、本發(fā)明篩選培養(yǎng)基的配制，可以使顯色反應(yīng)（棕黑色）與篩選培養(yǎng)基（透明色） 區(qū)別明顯，所以對篩選產(chǎn)糖苷酶菌株較為靈敏和準(zhǔn)確。
[0011] 四、【專利附圖】

【附圖說明】： 圖1為本發(fā)明的顯色技術(shù)流程圖。
[0012] 五、【具體實施方式】： 參見圖1 :本發(fā)明是將篩選培養(yǎng)基加入到96孔板中，然后添加活化的菌株，最終通過顯 色篩選出高產(chǎn)糖苷酶菌株。具體實施步驟如下： 所述的步驟（1)培養(yǎng)基的配制：將重量百分比為〇. 3%的七葉苷，重量百分比為0. 05% 的檸檬酸鐵，重量百分比為〇. 2%的NaCl，重量百分比為0. 05%的MgS04. 7H20,重量百分比為 0. 1%的ΚΗ2Ρ04和重量百分比為2%的瓊脂加水混合后在121°C滅菌20min，得培養(yǎng)基； 所述的步驟（2)非釀酒酵母菌的純化：為了避免不純菌株帶來干擾，得到較純的單菌 落菌株，將非釀酒酵母菌先在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，得單菌落； 所述的非釀酒酵母菌為美極梅奇酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母、東方伊薩酵母或假絲酵 母。
[0013] 所述的步驟（3)單菌落的活化：根據(jù)單菌落顏色、菌落大小、突起、邊緣及其形態(tài) 的不同，分別挑取不同的單菌落，在添加 Yro液體培養(yǎng)基的試管中活化，每只試管添加 ypd 液體培養(yǎng)基5mL，活化兩天； 所述的步驟（4)在96孔板中添加培養(yǎng)基和活化后的單菌落：在96孔板中，每孔添加 250 μ 1培養(yǎng)基；再添加經(jīng)活化后的單菌落15 μ 1，每個活化后的單菌落添加兩個孔，與作為 對照，同時涂布均勻，記錄好每個單菌落與96孔板相對應(yīng)的編號； 所述的步驟（5)通過顏色篩選高產(chǎn)糖苷酶菌株：培養(yǎng)3天后，選擇呈現(xiàn)顏色深的棕黑 色單菌落，得膠紅酵母(保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位地址：中國、 武漢、武漢大學(xué)；保藏日期：2013年12月13日；保藏編號：CCTCC NO :Μ2013660 ;分類命 名：膠紅酵母北29 (Rhodotorula mucilaginosa北29)。）和膜璞畢赤酵母(保藏單位 名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：中國、武漢、武漢大學(xué)，保藏日期：2013年 12月13日，保藏編號：CCTCC N0:M2013659 ;分類命名：膜璞畢赤酵母南13 (Pichia membranifaciens南13)。），膠紅酵母(保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏 單位地址：中國、武漢、武漢大學(xué)；保藏日期：2013年12月13日；保藏編號：CCTCC N0: M2013660;分類命名：膠紅酵母北29 (Rhodotorula mucilaginosa北29)。）和膜撲畢赤 酵母均為高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株。
[0014] 膠紅酵母(保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保藏單位地址：中國、武漢、 武漢大學(xué)；保藏日期：2013年12月13日；保藏編號：CCTCC NO :Μ2013660 ;分類命名：膠紅 酵母北29(Rhodotorula mucilaginosa北29)。）和膜璞畢赤酵母(保藏單位名稱：中國典 型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：中國、武漢、武漢大學(xué)，保藏日期：2013年12月13日，保 藏編號：CCTCC NO :M2013659 ;分類命名：膜璞畢赤酵母南 13 (Pichia membranifaciens 南13)。）是高產(chǎn)糖苷酶菌株，可用于混合發(fā)酵或產(chǎn)糖苷酶增加葡萄酒香氣。經(jīng)定量方法分 析：膠紅酵母產(chǎn)酶活性為42. lU/ml X 10_3 ;膜璞畢赤酵母42. 51U/ml X 10_3。
[0015] 所述的步驟（6)定量驗證高產(chǎn)糖苷酶菌株活性： a 提取粗酶液：將篩選的膠紅酵母(保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心；保 藏單位地址：中國、武漢、武漢大學(xué)；保藏日期：2013年12月13日；保藏編號：CCTCC N0 : M2013660;分類命名：膠紅酵母北29 (Rhodotorula mucilaginosa北29)。）和膜撲畢赤 酵母(保藏單位名稱：中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位地址：中國、武漢、武漢大學(xué)，保 藏日期：2013年12月13日，保藏編號：CCTCC NO :M2013659 ;分類命名：膜璞畢赤酵母南 13 (Pichia membranifaciens南13)。）按10%的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基（300mL三角瓶 裝20ml培養(yǎng)基，121°C滅活20min)，溫度為30°C，搖床150rpm/min條件下培養(yǎng)72h，取出發(fā) 酵液1. 0ml于1. 5ml離心管中，8000rpm/min離心lOmin除菌，收集上清液，即為β -葡萄糖 苷酶粗酶液。
[0016] b波長選擇：0. 1、0. 3、0. 5 mmol/L的對硝基苯酚溶液，分別取5ml，用分光光度計 掃描最大吸收峰波長，掃描條件：吸光度范圍為〇. 00-3. 00,波長范圍為390-415nm。選擇最 大吸收波長。
[0017] β -葡萄糖苷酶酶活的測定：（1)對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制稱取0. 0209g對硝 基苯酚，用蒸饋水溶解，轉(zhuǎn)移到l〇〇ml的容量瓶中，定容，搖勻，配制成1. 5mmol/L的對硝基 苯酌溶液。分別配制成 0· 05mmol/L，0· 1 mmol/L，0· 2 mmol/L，0· 3 mmol/L, 0. 4 mmol/L, 0.5mmol/L，0.6 mmol/L，0.7 mmol/L，0.8 mmol/L 的對硝基苯酌·溶液。
[0018] 對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線取10支25ml刻度管，分別加入0. 05mmol/L，0. 1 mmol/L， 0. 2 mmol/L, 0. 3mmol/L, 0. 4 mmol/L, 0. 5mmol/L, 0. 6 mmol/L, 0· 7 mmol/L, 0· 8 mmol/L對硝 基苯酚溶液0. 4ml,再加入2. 0ml 1 mmol/L的碳酸鈉溶液和10ml的蒸饋水，室溫放置5min 后搖勻。以蒸餾水作為空白對照，在上述最大吸收波長處測定吸光值A(chǔ)。以吸光值為縱坐 標(biāo)，對硝基苯酚的濃度為橫坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0019] (2) β-葡萄糖苷酶酶活的測定相對應(yīng)pH值加入750 μ L檸檬酸-磷酸氫二鈉 緩沖液，加入200ul的粗酶提取液，加入250 yLl mmol/L的對硝基苯-β-葡萄糖苷（pNPG) 40°C處理60min，然后加入1.0 ml的lmol/L Na2C03終止反應(yīng)。在上述最大吸收波長處測 吸光度，蒸餾水為空白對照。每個樣重復(fù)兩次。β-葡萄糖苷酶酶活力單位（IU)定義為 ： 40°C下lmin內(nèi)催化生成1 μ mol對硝基苯酚所要的酶量。
【權(quán)利要求】
1. 一種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的篩選方法，其特征在于：所述的篩選方法包括 以下操作步驟：（1)培養(yǎng)基的配制；（2)非釀酒酵母菌的純化，得單菌落；（3)單菌落的活 化；(4)在96孔板中添加培養(yǎng)基和活化后的單菌落；（5)通過顏色篩選高產(chǎn)糖苷酶菌株。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的篩選方法，其特征在 于： 所述的步驟（1)培養(yǎng)基的配制：將重量百分比為〇. 3%的七葉苷，重量百分比為0. 05% 的檸檬酸鐵，重量百分比為〇. 2%的NaCl，重量百分比為0. 05%的MgS04. 7Η20,重量百分比為 0. 1%的ΚΗ2Ρ04和重量百分比為2%的瓊脂加水混合后在121°C滅菌20min，得培養(yǎng)基； 所述的步驟（2)非釀酒酵母菌的純化：將非釀酒酵母菌先在WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng) 5天，得單菌落； 所述的步驟（3)單菌落的活化：根據(jù)單菌落顏色、菌落大小、突起、邊緣及其形態(tài)的不 同，分別挑取不同的單菌落，在添加 Yro液體培養(yǎng)基的試管中活化，每只試管添加 YH)液體 培養(yǎng)基5mL，活化兩天； 所述的步驟（4)在96孔板中添加培養(yǎng)基和活化后的單菌落：在96孔板中，每孔添加 250 μ 1培養(yǎng)基；再添加經(jīng)活化后的單菌落15 μ 1，每個活化后的單菌落添加兩個孔，與作為 對照，同時涂布均勻，記錄好每個單菌落與96孔板相對應(yīng)的編號； 所述的步驟（5)通過顏色篩選高產(chǎn)糖苷酶菌株：培養(yǎng)3天后，選擇呈現(xiàn)顏色深的棕黑色 單菌落，得膠紅酵母和膜璞畢赤酵母，膠紅酵母和膜璞畢赤酵母均為高產(chǎn)β -葡萄糖苷酶 酵母菌株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株的篩選方法，其特征在于： 所述的非釀酒酵母菌為美極梅奇酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母、東方伊薩酵母或假絲酵母。
【文檔編號】C12N1/16GK104152361SQ201410075528
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】陶永勝, 彭傳濤 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)