一種含有malat1基因3’utr序列和雙熒光素酶報告基因的質(zhì)粒及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種含有MALAT1基因3’UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質(zhì)粒及其應用。具體地，根據(jù)生物信息學數(shù)據(jù)庫預測has-mir-619-5p與MALAT1基因3’UTR區(qū)結(jié)合的位點，將其中包含該結(jié)合位點的序列擴增出來，插入雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒pmirGLOvector，成功構(gòu)建了MALAT1基因3’UTR區(qū)雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒。該質(zhì)?？勺鳛楹唵我仔械墓ぞ?，用于檢測調(diào)控MALAT1表達的microRNA的表達量、篩選調(diào)控MALAT1表達的microRNA，以及評估m(xù)icroRNA對MALAT1表達的調(diào)控作用，為通過檢測microRNA表達情況了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了重要手段。
【專利說明】—種含有MALAT1基因3’ UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質(zhì)粒及其應用
[0001]【【技術領域】】
本發(fā)明涉及分子生物學【技術領域】，具體地說，是一種含有MALATl基因3’ UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質(zhì)粒及其應用。
[0002]【【背景技術】】 長鏈非編碼RNA (long noncoding RNA, IncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200nt的RNA，它們本身并不編碼蛋白，而是以RNA的形式在多種層面上調(diào)控基因的表達水平。IncRNA-MALATlCMetastasis Associated in Lung Adenocarcinoma Transcript I)于2003年被首次發(fā)現(xiàn)，其在非小細胞癌患者組織中顯著高表達，隨后在其他很多腫瘤如肝癌、胰腺癌、前列腺癌、腸癌、乳癌等癌組織中也發(fā)現(xiàn)MALATl過表達。許多研究都提示MALATl基因跟多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關，而目前針對該基因進行的表達調(diào)控研究還比較少。
[0003]微小RNA (microRNA，miRNA)作為一類內(nèi)源性的長度約為22個核苷酸的非編碼小分子RNA,能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)mRNA表達。相當一部分microRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用，或是癌基因，又或是抑癌基因。絕大多數(shù)microRNA是通過與靶基因的3’UTR區(qū)發(fā)生作用，或抑制靶基因的翻譯，也或是降解靶基因，最終降低靶基因的表達水平，影響基因發(fā)揮應有的功能。因此microRNA對靶基因的調(diào)控研究是非常值得關注的領域。
[0004]目前對于長鏈非編碼RNA調(diào)控的研究報道并不多，既然micix)RNA能夠?qū)τ蟹g能力的靶基因發(fā)揮調(diào)控作用，其對長鏈非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄后水平也應該存在一定的調(diào)節(jié)作用。為了研究microRNA對MALATl基因的調(diào)控作用，針對MALATl基因的3’UTR設計相應的篩選和檢測方法是非常值得研究的，這將對進一步研究MALATl基因調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力有著重要的意義。
[0005]【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種含有MALATl基因3’UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質(zhì)粒。
[0006]本發(fā)明的再一的目的是，提供上述質(zhì)粒的制備方法。
[0007]本發(fā)明的另一的目的是，提供上述質(zhì)粒的用途。
[0008]為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:
一種含有MALATl基因3’ UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質(zhì)粒，所述的質(zhì)粒是在pmirGLO vector的多克隆位點內(nèi)插入SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0009]優(yōu)選地,所述的SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列插入在pmirGLO vector的Pme I和Xba I酶切位點之間。
[0010]所述的質(zhì)粒是通過以下方法構(gòu)建的:
a)獲取序列如SEQID N0.2所示的has-mir-619_5p與MALATl基因結(jié)合的靶點；
b)設計序列如SEQID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物，以人基因組為模板克隆獲得N0.1所示的核苷酸序列并測序驗證；
c)將步驟b)得到的N0.1所示的核苷酸序列連接到pmirGLO vector的Pme I和XbaI酶切位點之間。
[0011]為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:
如上所述的含有MALATl基因3’UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質(zhì)粒的制備方法，包括以下步驟:
a)獲取序列如SEQID N0.2所示的has-mir-619_5p與MALATl基因結(jié)合的靶點，確定所要克隆的目的片段；
b)設計序列如SEQID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物，以人基因組為模板克隆獲得N0.1所示的核苷酸序列并測序驗證；
c)將步驟b)得到的N0.1所示的核苷酸序列連接到pmirGLO vector的Pme I和XbaI酶切位點之間。
[0012]為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術方案是:
如上所述的含有MALATl基因3’ UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質(zhì)粒的用途，用于檢測調(diào)控MALATl表達的microRNA的表達量，或篩選調(diào)控MALATl表達的microRNA，或評估m(xù)icroRNA對MALATl表達的調(diào)控作用。
[0013]所述的調(diào)控MALATl 表達的 microRNA 是 has-mir-619-5p。
[0014]本發(fā)明優(yōu)點在 于:
本發(fā)明根據(jù)生物信息學數(shù)據(jù)庫成功預測了 has-mir-619-5p與MALATl基因3’ UTR區(qū)結(jié)合的位點，將其中包含該結(jié)合位點的序列擴增出來并適當?shù)谋M可能延長靶點兩側(cè)的序列(片段短了就可能會失去很多microRNA的結(jié)合位點(包括has-mir-619_5p),從而不能對MALATl起調(diào)控作用；太長的片段則不太容易PCR擴增，且可能會影響載體中熒光素酶的活性)，插入雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒pmirGLO vector，成功構(gòu)建了 MALATl基因3’ UTR區(qū)雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒。該質(zhì)?？勺鳛闄z測調(diào)控MALATl表達的microRNA的表達量、篩選調(diào)控MALATl表達的microRNA，以及評估m(xù)icroRNA對MALATl表達的調(diào)控作用的簡單易行的工具，為通過檢測miCToRNA表達情況了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了很重要的手段。
[0015]【【專利附圖】

【附圖說明】】
圖1是has-mir-619-5p與MALAT1-3-UTR結(jié)合靶點的序列。
[0016]圖2是PCR擴增獲得的含has-mir-619-5p結(jié)合靶點的MALAT1-3-UTR基因片段。其中，I為Marker，2和3為400bp大小的擴增片段。
[0017]圖3是PCR擴增MALAT1-3-UTR片段基因測序后與NCBI數(shù)據(jù)庫比對的結(jié)果。
[0018]圖4是MALAT1-3-UTR基因片段克隆進pmirGLO vector載體后PCR鑒定重組克隆的電泳圖。其中I為Marker，2和4是經(jīng)PCR鑒定正確重組的克隆。
[0019]圖5是pmirGLO-MALATl-3-UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。
[0020]圖6是pmirGLO-MALATl-3-UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒用于檢測has-mir-619_5p對MALATl調(diào)控作用的活性檢測結(jié)果。其中，No insert是空載體pmirGLO-vector組，MALAT1-3-UTR 是 pmirGLO-MALATl-3-UTR 組，MALATl-3-UTR-mut 是 has-mir-619_5p 結(jié)合位點進行堿基突變的報告質(zhì)粒組，MALAT1-3-UTR + has-mir-619_5p是pmirGLO-MALATl-3-UTR+has-mir-619-5p 模擬物組，MALATl-3-UTR-mut + has-mir-619-5p 是pmirGL0-MALATl-3-UTR-mut +has-mir-619-5p 模擬物組。
[0021]圖7是has-mir-619-5p模擬物作用于pmirGLO-MALATl-3-UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒的工作原理圖。
[0022]圖8是pmirGLO-MALATl-3-UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒用于進一步鑒定前期基因芯片或軟件預測獲得的對MALAT1-3-UTR有調(diào)控作用的microRNA。其中，Control組即為pmirGLO-MALATl-3-UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒組，未添加模擬物，I為has-mir-619_5p模擬物，2 為 hsa-miR-5585-3p 模擬物，3 為 hsaiiR-5096 模擬物，4 為 hsa-miR-574_5p 模擬物，5 為 hsa-miR-1273g-3p 模擬物，6 為 hsa-miR-1972 模擬物。
[0023]【【具體實施方式】】
下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0024]實施例1 pmirGLO-MALATl-3-UTR雙熒光素酶報告質(zhì)粒的構(gòu)建
(I)結(jié)合生物信息學數(shù)據(jù)庫miRDB (http://mirdb.0rg/miRDB/)和NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncb1.nlm.nih.gov)獲取 has-mir-619-5p (SEQ ID N0.2)與 MALATl 結(jié)合的靶點，其位于MALATl基因的3’ UTR區(qū)，結(jié)合位點序列如圖1。
[0025](2)采用primer 5軟件設計MALATl的3-UTR區(qū)擴增引物，并加入酶切位點Pme I和Xba I。以人基因組DNA為模板，擴增大小為400bp的片段(SEQ ID N0.1，圖2)。弓丨物序列如下:Sense (SEQ ID N0.3):GGGTTTAAACGATTGGAAAGCTCTC, Antisense (SEQ ID N0.4):TGCTCTAGAGATTAAAGGAAAATG。
[0026]PCR 擴增條件:95 °C，5min ；95 °C，30s, 60 °C，30s, 72 °C，30s, 35 個循環(huán)；72 °C，IOmin0
[0027]PCR反應體系:
【權利要求】
1.一種含有MALATl基因3’UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質(zhì)粒，其特征在于，所述的質(zhì)粒是在pmirGLO vector的多克隆位點內(nèi)插入SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的質(zhì)粒，其特征在于，所述的SEQID N0.1所示的核苷酸序列插入在pmirGLO vector的Pme I和Xba I酶切位點之間。
3.根據(jù)權利要求2所述的質(zhì)粒，其特征在于，所述的質(zhì)粒是通過以下方法構(gòu)建的: a)獲取序列如SEQID N0.2所示的has-mir-619_5p與MALATl基因結(jié)合的靶點； b)設計序列如SEQID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物，以人基因組為模板克隆獲得N0.1所示的核苷酸序列并測序驗證； c)將步驟b)得到的N0.1所示的核苷酸序列連接到pmirGLO vector的Pme I和XbaI酶切位點之間。
4.權利要求1所述的含有MALATl基因3’UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質(zhì)粒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: a)獲取序列如SEQID N0.2所示的has-mir-619_5p與MALATl基因結(jié)合的靶點，確定所要克隆的目的片段； b)設計序列如SEQID N0.3和SEQ ID N0.4所示的引物，以人基因組為模板克隆獲得N0.1所示的核苷酸序列并測序驗證； c)將步驟b)得到的N0.1所示的核苷酸序列連接到pmirGLO vector的Pme I和XbaI酶切位點之間。
5.權利要求1所述的含有MALATl基因3’UTR序列和雙熒光素酶報告基因的質(zhì)粒的用途，其特征在于，用于檢測 調(diào)控MALATl表達的microRNA的表達量，或篩選調(diào)控MALATl表達的microRNA,或評估m(xù)icroRNA對MALATl表達的調(diào)控作用。
6.根據(jù)權利要求5所述的用途，其特征在于，所述的調(diào)控MALATl表達的microRNA是has-mir-619_5p0
【文檔編號】C12Q1/68GK103898137SQ201410075529
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權日:2014年3月4日
【發(fā)明者】任建琳, 季青, 李琦, 侯風剛, 隋華, 劉宣, 周利紅, 陳文婷 申請人:上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院, 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院