一種單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法
【專利摘要】單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法。涉及一種核酸適體篩選技術(shù)，建立快速、高效的單克隆表面展示核酸適體篩選新方法。所述方法包括如下步驟：（1）將氨基修飾的正向引物通過NHS-氨基反應(yīng)偶聯(lián)到NHS修飾的微球表面；（2）將寡核苷酸文庫通過液滴單分子微乳PCR以單克隆的形式擴增到偶聯(lián)有正向引物的微球表面，每個微球上僅展示一種核酸序列；（3）通過單克隆微球庫與靶標(biāo)相關(guān)作用，可視化地考察表面展示序列與靶標(biāo)的結(jié)合程度；（4）直接挑選獲得能和靶標(biāo)分子結(jié)合的單克隆微球，獲取微球上的DNA序列，即可獲得高質(zhì)量核酸適體。該方法快速、高效、經(jīng)濟，實現(xiàn)了分子識別可視化監(jiān)測，并可在無需克隆、測序、合成的條件下實現(xiàn)了富集庫中核酸適體的快速篩選，獲得選擇性好、親和力強的核酸適體。
【專利說明】一種單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本 發(fā)明涉及一種針對多種靶標(biāo)的單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，屬于核酸適體篩選技術(shù)開發(fā)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]核酸適體作為一類新型的分析、診斷分子，自出現(xiàn)以來，受到科研工作者的廣泛關(guān)注。因其優(yōu)于傳統(tǒng)蛋白單克隆抗體的諸多特性，核酸適體已成為新興的研究領(lǐng)域，在科研、疾病診斷和治療試劑等方面逐步取代傳統(tǒng)的抗體類診斷和生物技術(shù)產(chǎn) 品° (1.G.Mayer, The chemical biology of aptamers, Angew Chem Int EdEngl [J].2009,48,2672-2689;2.M.Mascini, 1.Palchetti, S.Tombelli, Nucleic acid andpeptide aptamers: fundamentals and bioanalytical aspects, Angew Chem Int EdEngl [J].2012，51，1316-1332.)核酸適體是指從人工合成的單鏈DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高特異性地和高親和力地與靶標(biāo)分子結(jié)合的單鏈寡核苷酸。核酸適體借助氫鍵、范德華力、疏水作用等分子間弱作用力形成特殊的三維結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)、G-四聚體等，從而特異地識別靶物質(zhì)甚至影響其生物活性。核酸適體本身特有的生化特性使其在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域具有諸多優(yōu)勢，如靶分子范圍廣、親和力與特異性強、合成修飾方便快速、分子量較小、良好的生物兼容性、無毒、體外穩(wěn)定性好等。
[0003]目前人們研究和報道的絕大多數(shù)核酸適體都是通過SELEX技術(shù)獲得的。SELEX技術(shù)即配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment)，主要是基于達爾文的進化論思想:變異、選擇、復(fù)制，在試管里模擬自然環(huán)境中的進化過程，在很短的時間內(nèi)篩選出符合特定要求的核酸適配體。該方法最早由 Larry Gold、Jack Szostak 及 Gerald Joyce 于 1990 年提出。(3.C.Tuerk, L.Gold, Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands tobacteriophage T4DNA polymerase, Science[J].1990, 249, 505-510;4.A.D.Ellington, J.ff.Szostak, Invitro Selection of RNA Molecules That Bind Specific Ligands, Nature[J].1990，346，818-822.)伴隨著功能核酸在生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、環(huán)境和疾病檢測等方面逐步擴大的影響和應(yīng)用前景，如何準確、高效、經(jīng)濟地獲得更多的功能核酸也成為人們關(guān)注的焦點。在至今的二十多年里，SELEX技術(shù)不斷被研究者革新、創(chuàng)新，篩選方式更是變得靈活多樣，篩選的靶分子也從金屬離子、有機小分子、蛋白質(zhì)等拓展到了細胞、組織等復(fù)雜靶標(biāo)，顯示了該技術(shù)強大的應(yīng)用空間。
[0004]SELEX最基本的篩選途徑是:首先，將大容量的隨機寡核苷酸序列庫(1013~1015個隨機寡核苷酸序列)與靶分子共同孵育，通過各種分離途徑將靶標(biāo)分子-寡核苷酸復(fù)合物與未結(jié)合的寡核苷酸序列分離。再通過熱變性等洗脫方式獲得與靶分子結(jié)合的寡核苷酸序列，并對這些序列進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，擴增生成次級文庫，用于下輪篩選。如此數(shù)輪反復(fù)篩選后得到富集文庫，對該富集文庫進行細菌單克隆并測序，最終獲得能夠特異性識別靶分子的寡核苷酸序列，即核酸適配體。用于篩選的隨機寡核苷酸庫的兩端通常為固定序列，與PCR擴增的引物序列匹配；中間為15~60個堿基的隨機序列，幾乎涵蓋了所有可能的立體構(gòu)象，理論上可以針對任何靶分子篩選出特異性的核酸適配體。
[0005]SELEX技術(shù)是一個相對復(fù)雜的過程，其篩選成功率受到眾多因素影響，如文庫的設(shè)計、分離技術(shù)的針對性和普適性、靶分子的結(jié)構(gòu)性質(zhì)、緩沖液的類型以及所含離子種類等。目前尚未有報道針對任意靶標(biāo)的標(biāo)準SELEX篩選方法。通常蛋白質(zhì)或小分子靶標(biāo)須進行8-12輪篩選，細胞、組織等甚至需要20輪，耗費大量人力和時間，也同時限制了核酸適體的發(fā)展。[0006]近年來，一些新的核酸適體篩選技術(shù)被不斷開發(fā)。在SELEX篩選過程中，有效地分離出能與靶分子識別的序列是最關(guān)鍵的步驟。一些新的技術(shù)例如基于毛細管電泳、流式細胞儀、微流控芯片、等的分離方法被提出，為核酸適體的篩選提供了新的發(fā)展方向。(5.S.D.Mendonsa, Μ.T.Bowser, In vitro evolution of functionalDNA using capillary electrophoresis,J Am Chem Soc[J].2004，126，20-21;6.M.S.Raddatz, A.Dolf, E.Endl, et al.Enrichment of cel 1-targeting andpopulation-specific aptamers by fluorescence-activated cell sorting,AngewChem Int Ed Engl [J].47, 28, 5190-5193; 7.X.Lou, J.Qian, Y.Xiao, et al.Micromagneticselection of aptamers in microfluidic channels,Proc Natl Acad Sci U SA[J].2009, 106，2989-2994.)這些新的技術(shù)能有效提高分離效率，減少篩選輪數(shù)。另一方面，在傳統(tǒng)的SELEX過程結(jié)束后，需將最后得到的富集庫進行細菌克隆并測序，再通過結(jié)構(gòu)分析等方式從幾十到數(shù)百條候選序列中挑出占比例最多、最具有結(jié)合潛質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)作為候選序列，帶有很強的人為主觀性。然后通過化學(xué)方法合成這些序列，單獨計算每一條序列與靶標(biāo)的親和力，最終得到最優(yōu)核酸適體。后續(xù)處理過程冗長、耗時耗力且成本較高。而這一方面的改進工作卻鮮有報道。
[0007]我們有理由相信，隨著SELEX技術(shù)的發(fā)展和完善，核酸適體將在臨床檢測、治療藥物及生物分離等方面擔(dān)當(dāng)更重要的角色。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]現(xiàn)有的核酸適體篩選方法復(fù)雜、繁瑣、低效、昂貴等問題，本發(fā)明的第一目的在于提供一種快速、簡單、高效、低成本的單克隆表面展示核酸適體篩選方法。
[0009]本發(fā)明的第二目的在于提供一種快速、簡單、高效、低成本地單克隆表面展示核酸適體篩選方法用于細胞核酸適體的篩選。
[0010]本發(fā)明的本發(fā)明的第三目的在于提供一種快速、簡單、高效、低成本地單克隆表面展示核酸適體篩選方法用于蛋白和小分子的核酸適體篩選。
[0011]所述單克隆表面展示核酸適體篩選方法包括如下步驟:(I)將氨基修飾的正向引物通過NHS-氨基反應(yīng)偶聯(lián)到NHS修飾的微球表面；(2)將寡核苷酸文庫通過液滴單分子微乳PCR以單克隆的形式擴增到偶聯(lián)有正向引物的微球表面，每個微球上僅展示一種核酸序列；(3)通過單克隆微球庫與靶標(biāo)相關(guān)作用，可視化地考察表面展示序列與靶標(biāo)的結(jié)合程度；(4)直接挑選獲得能和靶標(biāo)分子結(jié)合的單克隆微球，獲取微球上的DNA序列，即可獲得高質(zhì)量核酸適體。
[0012]在步驟(1)中，所述的微球為NHS修飾的瓊脂糖微球。也可利用其他偶聯(lián)化學(xué)。[0013]在步驟(2)中，所述的液滴由振蕩、攪拌或微流控芯片方式生成。單克隆微球的形成依賴于將寡核苷酸文庫稀釋至單分子水平，保證每個液滴內(nèi)僅有0.3-1條DNA。
[0014]其中，采用振蕩方式生成含有微球的油包水液滴時，優(yōu)選以篩選所需的寡核苷酸文庫為PCR擴增模板，加入偶聯(lián)有正向引物的微球和PCR所需試劑作為水相，油相的組成為40%(w/w)道康寧 5225C，30%(w/w)道康寧 749，30%(w/w)硅油 Ar20。
[0015]本發(fā)明靶標(biāo)可以為細胞、蛋白質(zhì)或小分子，如靶標(biāo)為小分子或蛋白質(zhì)時，優(yōu)選將靶標(biāo)偶聯(lián)于微球等固相載體表面以便于觀察和分離。
[0016]在步驟(3)中，優(yōu)選采用在顯微鏡下觀察單克隆微球庫與靶標(biāo)的相互作用。
[0017]在步驟(4)中，優(yōu)選直接用毛細管通過毛細作用挑出與靶標(biāo)結(jié)合的微球。
[0018]本發(fā)明的優(yōu)點在于:首先，通過微乳液滴PCR將寡核苷酸文庫中的每一條序列以成百上千的拷貝展示于單克隆微球表面，將原SELEX計時的寡核苷酸文庫轉(zhuǎn)變?yōu)槲⑶蛭膸欤黄浯?，每一條核酸序列與靶標(biāo)的親和作用通過各自的克隆微珠獨立展示出來，并且核酸序列與靶標(biāo)的相互作用可以被直接觀察；再次，通過挑選微球可直接從單克隆微球上獲得核酸適體序列；此外，通過改變洗滌力度，可以根據(jù)需要調(diào)節(jié)所獲得的核酸適體的親和能力。與傳統(tǒng)SELEX技術(shù)相比，該方法更加快速、經(jīng)濟、高效，實現(xiàn)了分子識別可視化監(jiān)測，并可在無需克隆、測序、比對、合成的條件下實現(xiàn)了富集庫中核酸適體的快速篩選，獲得選擇性好、親和力強的核酸適體，將為人工體外篩選、進化功能核酸的道路中開辟一條捷徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為NHS-瓊脂糖微球與氨基正向引物的化學(xué)偶聯(lián)(A);聯(lián)有正向引物的瓊脂糖微球通過與熒光標(biāo)記的正向引物互補DNA結(jié)合進行偶聯(lián)表征(B);瓊脂糖微球偶聯(lián)前(C)和偶聯(lián)后(D)的熒光成像及流式細胞分析結(jié)果。
[0020]圖2為EpCAM蛋白的核酸適體篩選。(A)偶聯(lián)寡核苷酸文庫的微球文庫與靶細胞KatoIII結(jié)合；(B)偶聯(lián)正向引物的微球不與靶細胞結(jié)合；(C)挑選出來的7個單克隆微球上的序列與靶蛋白的結(jié)合力均強于第五輪的富集文庫；(D)從洗去的上清溶液中取出的兩個微球上的序列與靶蛋白不結(jié)合。
[0021]圖3為測序獲得的核酸適體EpCAM-5與EpcAM蛋白的結(jié)合情況。流式細胞術(shù)表征結(jié)果，核酸適體EpCAM-5能特異性結(jié)合EpCAM-微珠(A)，而與參照N1-微珠(B)不結(jié)合。核酸適體EpCAM-5跟EpCAM蛋白的結(jié)合解離常數(shù)為33±3nM (C)。
[0022]圖4為核酸適體EpCAM-5與細胞的結(jié)合情況。流式細胞術(shù)表征結(jié)果，核酸適體EpCAM-5不與不表達EpCAM蛋白的細胞如HEK-293 (A)和Ramos (B)結(jié)合，而特異性地結(jié)合EpCAM高表達的細胞如T47D (C)和KatoIII (D)0 (E)熒光共聚焦表征結(jié)果，核酸適體EpCAM能特異性識別KatoIII細胞，不結(jié)合Ramos細胞。
[0023]圖5為黃曲霉素偶聯(lián)于氨基修飾微球表面的實驗流程。
[0024] 圖6為黃曲霉素的核酸適體篩選。(A)黃曲霉素的結(jié)構(gòu)式；(B)偶聯(lián)寡核苷酸文庫的微球文庫與黃曲霉素微球的結(jié)合；(C)挑選出來的3個克隆微球上的序列與祀標(biāo)黃曲霉素的結(jié)合力均強于第五輪的富集文庫；(D)核酸適體AFB1-1與黃曲霉素的結(jié)合常數(shù)(Kd)表征。【具體實施方式】
[0025]實施例1NHS-瓊脂糖微球與氨基正向引物的偶聯(lián)
[0026] NHS-瓊脂糖微球(Hi Trap NHS-activated HP)通常保存在100%異丙醇中防止水解失活，使用前需去除異丙醇并用冷HCl活化。稱量0.2g NHS-瓊脂糖微球于1.5mL離心管中，加入500mL0.1M冷HCl，振蕩混合10s，離心棄上清，重復(fù)一次。加入500mL冷超純水，振蕩混合10s，離心棄上清，重復(fù)兩次充分洗去殘留HC1。加入IM PBS緩沖液(IOX)IOOyL,50 μ M氨基正向引物(5，-NH2-AGCGTCGAATACCACTACAG-3’ ) 90 μ L,置于室溫旋轉(zhuǎn)混勻過夜Sh0離心棄上清，加入超純水反復(fù)清洗微球，除去沒有反應(yīng)的氨基正向引物正向引物。將偶聯(lián)好的正向引物-瓊脂糖微球于4°C保存在750 μ L超純水中，每μ L儲存液約含1.7 X IO4個正向引物-瓊脂糖微球。(圖1Α)
[0027]實施例2利用流式細胞儀與激光共聚焦熒光顯微鏡驗證偶聯(lián)效果
[0028]取5μ L偶聯(lián)好的正向引物-瓊脂糖微球，加入到15 μ L50 μ M熒光標(biāo)記的正向引物互補 DNA (FAM-FP-cDNA, 5’-FAM-CTGTAGTGGTATTCGACGCT-3’)水溶液中，再加入 20 μ L 結(jié)合緩沖液(PBS緩沖液，MgCl25mM, pH7.4)混勻。置于干浴器上95°C加熱5min使DNA變性，包好錫紙避光，室溫旋轉(zhuǎn)復(fù)性2h，使FAM-FP-cDNA與瓊脂糖微球上偶聯(lián)的引物互補結(jié)合。把反應(yīng)完的溶液推入自制的濾芯槍頭，過濾掉反應(yīng)液，并用100 μ L PBS清洗微球3次，以充分洗掉沒有結(jié)合的FAM-FP-cDNA。把微球推出到300 μ L PBS中，用流式細胞儀分析，記數(shù)大于3000個微球。將剩余樣品取10 μ L點在玻片上進行激光共聚焦熒光顯微鏡觀察。(圖1B-D)計算得微球上正向引物的濃度大約為300amole/微球。
[0029]實施例3油包水液滴的生成及破乳方法
[0030]可采用振蕩、攪拌或微流控芯片方式生成含有微球的油包水液滴。例如，采用手動振蕩混勻的方式生成含有瓊脂糖微球的油包水液滴。首先配制油相，準備潔凈干燥的圓底燒瓶，按比例加入40%(w/w)道康寧5225C，30%(w/w)道康寧749，30%(w/w)硅油Ar20，磁子攪拌30min。向離心管中加入150yL水溶液，加入6yL瓊脂糖微球(共約IO5個)，振蕩混勻，立即于其上覆蓋400 μ L混合硅油，在Labnet渦旋振蕩器上以中間轉(zhuǎn)速振蕩5s。振蕩好的油包水液滴呈乳白色。
[0031]混合硅油不溶于水，易溶于丙酮、異丙醇等有機試劑。通過洗滌溶劑和離心轉(zhuǎn)速的條件摸索，最終依次采用極性由低到高的丙酮、異丙醇、水清洗油包水乳液，除去油相從而重新獲得瓊脂糖微球。步驟如下:向油包水乳液中加入10倍體積的丙酮，在渦旋振蕩器上混勻，于離心機中以轉(zhuǎn)速500rpm離心4min，吸棄上層有機相，重復(fù)洗滌一次后；加入10倍體積的異丙醇并用同樣的條件洗滌兩次；最后，加入10倍體積的超純水洗去異丙醇，提高離心轉(zhuǎn)速至7000rpm。將最終得到的瓊脂糖微球保存在超純水中。
[0032]實施例4單克隆微球的形成及單分子微乳液滴PCR
[0033]核酸文庫的起始容量為1014，兩端為20個核苷酸引物，中間包括40個核苷酸的隨機序列。文庫如下:5' -AGCGTCGAATACCACTACAG-(N)4(l-CTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'。針對該核酸文庫以偶聯(lián)有EpCAM-His蛋白的Ni微珠為靶標(biāo)進行了 5輪的傳統(tǒng)篩選，將獲得的第5輪富集庫作為模板，模板量約4X IO5條，正向引物-瓊脂糖微球約IO5個，自由正向引物為微球上偶聯(lián)引物總量的萬分之一(計算約5X107)，自由反向引物為大過量，水相條件如表1所示。[0034]表1:微乳液滴的水相條件
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，將DNA文庫單克隆展示于微球表面，實現(xiàn)分子識別可視化監(jiān)測；所述方法包括如下步驟:(1)將氨基修飾的正向引物通過NHS-氨基反應(yīng)偶聯(lián)到NHS修飾的微球表面；(2)將寡核苷酸文庫通過液滴單分子微乳PCR以單克隆的形式擴增到偶聯(lián)有正向引物的微球表面，每個微球上僅展示一種核酸序列；(3)通過單克隆微球庫與靶標(biāo)相關(guān)作用，可視化地考察表面展示序列與靶標(biāo)的結(jié)合程度；(4)直接挑選獲得能和靶標(biāo)分子結(jié)合的單克隆微球，獲取微球上的DNA序列，獲得高質(zhì)量核酸適體。
2.如權(quán)利要求1和權(quán)利要求2所述單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，其特征在于:步驟(2)中，利用振蕩、攪拌或微流控芯片方式生成含有微球的油包水液滴，每個液滴中至多包含一條寡核苷酸模板。
3.如權(quán)利要求2所述單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，其特征在于:步驟(2)中，采用振蕩方式生成含有微球的油包水液滴，其以篩選所需的寡核苷酸文庫為PCR擴增模板，加入偶聯(lián)有正向引物的微球和PCR所需試劑作為水相，油相的組成為40%(w/w)道康寧 5225C，30%(w/w)道康寧 749，30%(w/w)硅油 Ar20。
4.如權(quán)利要求1所述單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，其特征在于:步驟(2)中將這些連有核酸的微球破乳、回收，并對雙鏈DNA進行變性單鏈化，最終獲得用于篩選的核酸展示單克隆微球。
5.如權(quán)利要求1所述單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，其特征在于:靶標(biāo)為細胞、蛋白質(zhì)或小分子，如靶標(biāo)為小分子或蛋白質(zhì)時，將靶標(biāo)偶聯(lián)于固相載體表面便于觀察和分離。
6.如權(quán)利要求1所述單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，其特征在于:步驟(4)中核酸展示單克隆微球與靶標(biāo)孵育，去除不結(jié)合的微球，在顯微鏡下挑出結(jié)合的微球。
7.如權(quán)利要求1所述單克隆表面展示核酸適體快速篩選方法，其特征在于:步驟(4)中挑選出來的結(jié)合微球在試管內(nèi)進行PCR擴增，獲得高親和性的核酸適體，直接進行測序，獲得序列信息。
【文檔編號】C12Q1/68GK103911432SQ201410076295
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】楊朝勇, 朱志, 宋彥齡, 李聰, 鄒遠, 朱玲, 安源 申請人:廈門大學(xué)