基于埃博拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于埃博拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應(yīng)用。本發(fā)明公開的一種蛋白或該蛋白的截短體，該蛋白為如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.3所示的蛋白；（2）將SEQ?ID?No.3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明公開的抗原及其截短體能夠誘導(dǎo)較強的體液免疫反應(yīng)，具有良好的免疫原性，可應(yīng)用于埃博拉病毒疫苗的開發(fā)及中和抗體的制備。
【專利說明】基于埃博拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于埃博拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)是烈性傳染病埃博拉出血熱(EHF)的病原體，為絲狀病毒屬，非節(jié)段單股負鏈RNA病毒，有5個亞型，即Zaire Ebola (ZEBOV), SudanEbola(SEBOV), Cote d，Ivoire Ebola(CIEBOV), Bundibugyo Ebola (BEBOV)與 RestonEbola (REBOV) (Kuhn, JH, Becker et al.Arch.Virol, 2010，155，2083 - 2103)。自 1976 年首次發(fā)現(xiàn)Ebola病毒以來，EHF的爆發(fā)造成了大量人員死亡，死亡率接近90%。Ebola病毒感染后，相關(guān)疾病癥狀很快出現(xiàn)，包括頭痛、肌痛、發(fā)熱、多器官功能衰竭及休克等(KsiazekTG et al.J Disl999; 179 (Suppll): S177 - S187)。目前，沒有有效的疫苗及藥物用于埃博拉病毒感染的預(yù)防及治療。
[0003]埃博拉病毒基因組全長19kb，編碼7種蛋白質(zhì)，包括4種結(jié)構(gòu)蛋白(包膜蛋白GP、核糖核蛋白NP、基質(zhì)蛋白VP24和VP40)、2種非結(jié)構(gòu)蛋白(VP30和VP35)以及病毒RNA聚合酶L。包膜蛋白GP覆蓋于病毒顆粒表面，是EBOV唯一的宿主粘附功能蛋白，在介導(dǎo)病毒侵入宿主細胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，GP可選擇性地降低細胞表面與細胞粘附和免疫功能相關(guān)的大分子的表達，導(dǎo)致細胞的脫落死亡(Gene, 0.G et al.1nfect.Disord.DrugTargets, 2009, 9:191 - 200 ；Sullivan NJ, et al.Virol, 2005，79:547-553)。成熟的 GP 蛋白是三聚體形式，由三個GP1-GP2異源二聚體組成，其中亞基GPl的功能是將病毒錨定于宿主細胞，亞基GP2則負責病毒與細胞的融合(Kathryn Schornberg, et al.JOURNAL OFVIROLOGY, 2006, p.4174 - 4178)。
[0004]近十年來，隨著Ebola病毒致病機制的闡明，Ebola病毒疫苗的研究工作取得了巨大的進展，已研究了滅活疫苗、DNA疫苗、VEEV復(fù)制子疫苗、病毒顆粒疫苗(eVLP)、HPIV3載體疫苗、rAD5載體疫苗、rVSV載體疫苗等。上述已研究的疫苗主要是基于包膜蛋白GP抗原，其中重組腺病毒5 (rAD5)載體疫苗與重組皰疹口炎病毒(rVSV)載體疫苗，均在NHP模型中獲得了很好的保護活性(Sullivan NJ, et al.PLoS Med, 2006,3:177 ；Thomas W Geisbert et al.Vaccine，2008，26:6894-6900 ;Thomas W Geisbert et al.JViro, 2009, 80 (14): 7296-7304)。由于嵌入完整GP蛋白的病毒載體疫苗具有一定的復(fù)制能力及恢復(fù)毒性的風險，安全問題是這類疫苗不可忽視和亟待克服的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種基于埃博拉病毒包膜蛋白的抗原片段、截短體及應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的一種蛋白或該蛋白的截短體，該蛋白為如下(I)或(2)所示:
[0007](1) SEQ ID N0.3 所示的蛋白；
[0008](2)將SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)；[0009]該蛋白的截短體為如下(3) - (8)任一所示:
[0010](3) SEQ ID N0.4 所示的蛋白；
[0011](4)將SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)；
[0012](5) SEQ ID N0.5 所示的蛋白；
[0013](6)將SEQ ID N0.5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)；
[0014](7) SEQ ID N0.6 所示的蛋白；
[0015](8)將SEQ ID N0.6所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
[0016]上述蛋白或該蛋白的截短體的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0017]上述編碼基因中，所述蛋白的編碼基因為如下I)-3)任一所示:
[0018]I) SEQ ID N0.1中自5’末端起第1177位至第1668位核苷酸所示的DNA分子；
[0019]2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1中(I)或(2)所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0020]3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1中(I)或
(2)所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0021]所述截短體的編碼基因為如下4) -12)任一所示:
[0022]4) SEQ ID N0.1中自5’末端起第1177位至第1437位核苷酸所示的DNA分子；
[0023]5)在嚴格條件下與4)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1中(3)或(4)所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0024]6)與4)或5)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1中(3)或
(4)所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0025]7) SEQ ID N0.1中自5’末端起第1306位至第1557位核苷酸所示的DNA分子；
[0026]8)在嚴格條件下與7)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1中(5)或(6)所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0027]9)與7)或8)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1中(5)或
(6)所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0028]10) SEQ ID N0.1中自5’末端起第1438位至第1668位核苷酸所示的DNA分子；
[0029]11)在嚴格條件下與10)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1中(7)或(8)所述蛋白質(zhì)的DNA分子；
[0030]12)與10)或11)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1中(7)或(8)所述蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0031]含有上述編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0032]所述重組載體是將SEQ ID N0.1中自5’末端起第1177位至第1668位核苷酸所示的DNA分子、SEQ ID N0.1中自5’末端起第1177位至第1437位核苷酸所示的DNA分子、SEQ ID N0.1中自5’末端起第1306位至第1557位核苷酸所示的DNA分子、SEQ ID N0.1中自5’末端起第1438位至第1668位核苷酸所示的DNA分子分別插入pVAXl的EcoRI與XhoI位點間得到的。
[0033]上述蛋白或該蛋白的截短體、上述基因或上述重組載體在制備免疫原和/或抗原中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0034]所述免疫原或抗原是針對埃博拉病毒或埃博拉病毒包膜蛋白GP的。
[0035]上述蛋白或該蛋白的截短體、上述基因或上述重組載體作為抗原在制備針對埃博拉病毒的抗體中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0036]上述蛋白或該蛋白的截短體、上述基因或上述重組載體在制備預(yù)防和/或治療埃博拉病毒引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍；
[0037]所述埃博拉病毒具體為Zaire亞型埃博拉病毒。[0038]GP蛋白的生物學(xué)功能主要是通過GPl亞基吸附細胞膜、GP2亞基發(fā)揮融合功能，從而使得埃博拉病毒進入宿主細胞。
[0039]暴露于GP蛋白表面的中部區(qū)域(aa393_556)在GP蛋白功能的發(fā)揮中具有關(guān)鍵作用，且該區(qū)域含有豐富的GP蛋白抗原表位。本發(fā)明提供的抗原片段是來自埃博拉病毒(Zaire)包膜蛋白GP的一段序列(aa393_556)以及該序列的截短體。本發(fā)明提供的抗原片段L具有作為GP蛋白相似的抗原潛力，免疫產(chǎn)生的中和抗體能夠有效抑制病毒的感染。與完整的GP蛋白抗原相比，該抗原片段不具有GP蛋白的生物學(xué)功能(不具有GPl亞基與GP2亞基的功能，在病毒進入過程中只發(fā)揮輔助功能)，因此不能使病毒進入宿主細胞，該片段用于病毒載體疫苗的構(gòu)建時具有更好的安全性，也更方便用于多價疫苗制備?？乖蜭進一步截短后也能夠誘導(dǎo)較強的體液免疫反應(yīng)，具有良好的免疫原性，可應(yīng)用于埃博拉病毒疫苗的開發(fā)及中和抗體的制備。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1 為 1% 瓊脂糖凝膠分析 pVAXl-GP，pVAXl-L，pVAXl-LA，pVAXl-LM，pVAXl-LB 的電泳圖。
[0041 ] 圖2為重組蛋白GP的表達及純化后SDS-PAGE電泳分析圖。
[0042]圖3為重組蛋白L的表達及純化后SDS-PAGE電泳分析圖。
[0043]圖4為重組質(zhì)粒免疫小鼠血清的ELISA分析圖。
[0044]圖5為GP蛋白和L蛋白免疫小鼠血清的ELISA分析圖。
[0045]圖6為Concanavalin A (ConA)或GP蛋白刺激后GP免疫組與L免疫組的淋巴細胞刺激指數(shù)分析。
[0046]圖7為GP蛋白和L蛋白及片段免疫血清對假病毒感染靶細胞的中和活性分析圖?！揪唧w實施方式】
[0047]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0048]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0049]下述實施例中所用的酶，除特殊說明外，均購自TAKARA公司。
[0050]下述實施例中所用的細胞培養(yǎng)基及血清，除特殊說明外，均購自Gibco公司。
[0051]PVAXl 購自 Invitrogen 公司。
[0052]pCAGGS-GP購自上海捷瑞生物工程有限公司，GP基因GenBank號為U28077.1。[0053]6周齡Balb/C雌性小鼠購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號=SCXK-(軍)2012-0004。
[0054]HRP標記的Goat ant1-mouse IgG抗體購自北京康為世紀生物科技有限公司。
[0055]達優(yōu)小鼠淋巴細胞分離液購自達科為生物技術(shù)公司，產(chǎn)品目錄號為DKW33-R0100。
[0056]Cell Counting Kit_8 (CCK_8Kit)購自日本同仁化學(xué)研究所，產(chǎn)品目錄號為CK04。
[0057]293FT 細胞購自 ATCC。
[0058]pNL4_3.1uc.RE 質(zhì)粒在文獻 “L.Du et al., Development of a safe andconvenient neutralization assay for rapid screening of influenza HA-specificneutralizing monoclonal antibodies,Biochemical and Biophysical ResearchCommunications, 2010, 397:580 - 585”中公開過，公眾可從中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所獲得。
[0059]Bright-Glo? Luciferase Assay System 購自 Promega 公司，產(chǎn)品目錄號為E2610。
[0060]實施例1、抗原及其片段的免疫原性分析
[0061]一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0062]同時構(gòu)建pVAXl-GP，pVAXl-L重組質(zhì)粒以及L截短體LA、LB、LM的重組質(zhì)粒pVAXl-LA, P VAX 1-LM 和 pVAXl-LB。
`[0063]具體步驟如下:
[0064](一)設(shè)計并合成如下引物:
[0065]GPF:5’ -GAATTCGCCACCATGGGTGTTACAGGAATATTG-3’
[0066]GPR:5，-CCGCTCGAGTTAAAAGACAAATTTGCATAT-3，
[0067]LF/LAF: 5，-GAATTCGCCACCATGGTGTATAAACTTGACATCTCTG-3，
[0068]LR/LBR: 5，-CCGCTCGAGTTAACAGATTAAACCATCTTG-3 ’
[0069]LAR: 5，-CCGCTCGAGTTATAGCTTCCCGCTGCTGGC-3，
[0070]LMF:5，-GGAATTCGCCACCATGAACACGAGCAAGGGTAC-3，
[0071 ] LMR: 5 ’ -CCGCTCGAGTTAAGTCCAGTAATGTAAATT-3，
[0072]LBF:5，-GGAATTCGCCACCATGGGCTTAATTACCAATACT-3’
[0073](二)GP基因擴增
[0074]以pCAGGS-GP為模板，以GPF和GPR為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物I。
[0075]PCR 反應(yīng)體系:pCAGGS-GP 為模板 I μ 1，2XPrime STAR GC buffer (Mg2+，plus)25 μ l,dNTP mix (2.5mM each)4 μ 1，上游引物 GPFl μ 1，下游引物 GPRl μ l，PrimeSTAR DNApolymerase0.5 μ I,補加滅菌水至 50 μ I。
[0076]PCR程序:94°C預(yù)變性4分鐘；94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸2分鐘，30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，4°C保溫。
[0077]GP基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示。
[0078](三)L、LA、LM與LB基因擴增
[0079]1、以pCAGGS-GP為模板，以LF/LAF和LR/LBR為弓丨物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物2 (L基因)。PCR擴增的退火溫度為54°C，72°C延伸30秒。
[0080]L基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1中自5’末端起第1177位至第1668位核苷酸所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0081]2、以pCAGGS-GP為模板，以LF/LAF和LAR為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物3 (LA基因)。PCR擴增的退火溫度為57°C，72°C延伸20秒。
[0082]LA基因如SEQ ID N0.1中自5’末端起第1177位至第1437位核苷酸所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.4所示。[0083]3、以pCAGGS-GP為模板，以LMF和LMR為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物4(LM基因)。PCR擴增的退火溫度為53°C，72°C延伸20秒。
[0084]LM基因如SEQ ID N0.1中自5’末端起第1306位至第1557位核苷酸所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.5所示。
[0085]4、以pCAGGS-GP為模板，以LBF和LR/LBR為弓丨物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物5 (LB基因)。PCR擴增的擴增退火溫度為54°C，72°C延伸20秒。
[0086]LB基因如SEQ ID N0.1中自5’末端起第1438位至第1668位核苷酸所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0087](四)EcoRI與XhoI分別雙酶切PCR擴增產(chǎn)物1、PCR擴增產(chǎn)物2、PCR擴增產(chǎn)物3、PCR擴增產(chǎn)物4和PCR擴增產(chǎn)物5，得到GP、L、LA、LM和LB基因；EcoRI與XhoI雙酶切載體pVAXl，得到載體大片段；將GP、L、LA、LM和LB基因分別與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒pVAXl-GP, pVAXl-L, pVAXl-LA, pVAXl-LM 和 pVAXl-LB。
[0088]1% 瓊脂糖凝膠分析重組質(zhì)粒 pVAXl-GP，pVAXl-L，pVAXl-LA，pVAXl-LM，pVAXl-LB結(jié)果如圖1所不。
[0089]將重組質(zhì)粒pVAXl-GP，pVAXl-L，pVAXl-LA，pVAXl-LM 和 pVAXl-LB 測序，結(jié)果正確。
[0090]二、重組蛋白GP和L的表達及純化
[0091 ](一)以pCAGGS-GP為模板，以24aGPF和24aGPR為弓丨物進行PCR擴增，得到GP Δ TM基因(SEQ ID N0.7) ,EcoRI 與 XhoI 雙酶切 GP Λ TM 基因，得到 GP Λ TM 片段;EcoRI 與 XhoI雙酶切pET24a ( + )載體(購自Novagen公司)，得到載體大片段；將GP Λ TM基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pET24a ( + ) -GP。
[0092]24aGPF:5’ -GGAATTCATCCCACTTGGAGTCATCCAC-3’
[0093]24aGPR:5’ -CCGCTCGAGGTCCGGAAGGGTTTTATCAAC-3’
[0094]GP Δ TM蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示。
[0095]以pCAGGS-GP為模板，以24aLF和24aLR為引物進行PCR擴增，得到L基因，EcoRI與XhoI雙酶切L基因，得到L基因片段；EcoRI與XhoI雙酶切L基因，得到L基因；EcoRI與XhoI雙酶切pET24a ( + )載體，得到載體大片段；將L基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命名為pET24a ( + )-L。
[0096]24aLF:5’ -GGAATTCGTGTATAAACTTGACATCTCTG-3’
[0097]24aLR:5’ -CCGCTCGAGCCCACAGATTAAACCATC-3’
[0098]將pET24a (+) -GP 和 pET24a (+) -L 送測序結(jié)果正確。
[0099](二)pET24a (+) -GP 與 pET24a (+) -L 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞
[0100]pET24a(+)-GP轉(zhuǎn)化Rosetta (DE3)感受態(tài)細胞(購自北京康為世紀生物科技有限公司)，pET24a(+)-L轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞(購自北京康為世紀生物科技有限公司)。各取I μ I質(zhì)粒加入相應(yīng)的感受態(tài)細胞中，冰浴30分鐘，42°C熱激90秒，再冰浴150秒，向感受態(tài)中加入900 μ I無抗性LB培養(yǎng)基，370C，150rpm復(fù)蘇45分鐘，將復(fù)蘇菌液均勻涂布在卡那霉素抗性的LB平板，37°C倒置培養(yǎng)16小時。
[0101](三)重組蛋白的誘導(dǎo)表達
[0102]挑取各重組菌的單克隆菌落，加入10πι150μ g/ml卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基，370C，220rpm培養(yǎng)12h ;按照體積比1:100接種菌液至1L50 μ g/ml卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)基，370C，220rpm培養(yǎng)至OD6tltl=0.6，大約2小時，加入IPTG至終濃度ImM，30°C誘導(dǎo)表達6小時后離心收集GP重組菌菌體和L重組菌菌體。
[0103](四)重組蛋白的純化
[0104]重組蛋白GP為包涵體形式，其純化過程如下:
[0105]NTA-ObufferC20mM Tris-HCl pH7.9,500mM NaCl，體積百分含量為 10% 的甘油)重懸GP重組菌菌體，超聲破菌(功率400W，工作5秒，間歇5秒，總時間40分鐘)，4°C，1000Orpm離心30分鐘，收集破菌上清以及包涵體；UNTA-0buffer (20mM Tris_HClpH7.9,500mMNaCl，體積百分含量為10%的甘油，8M尿素)重懸包涵體沉淀，37°C，攪拌變性30分鐘，4°C，1000Orpm離心30分鐘，收集包涵體溶解液上清，將其0.45 μ m濾膜過濾后上NTA-Ni親和柱進行純化，收集穿透液、雜蛋白洗脫液和目的蛋白洗脫液。將破菌上清、包涵體溶解液上清、穿透液、雜蛋白洗脫液和目的蛋白洗脫液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖2所示。
[0106]Macrosep超濾離心管(50K)(購自Millipore公司)超濾濃縮目的蛋白洗脫液,得到蛋白GP (SEQ ID N0.8所示)，大 小約為70kD。
[0107]重組蛋白L為可溶形式，其純化過程如下:
[0108]NTA-ObufferC20mM Tris-HCl pH7.9,500mM NaCl，體積百分含量為 10% 的甘油)重懸L重組菌菌體，超聲破菌(功率400W，工作5秒，間歇5秒，總時間40分鐘)，4°C，1000Orpm離心30分鐘，收集破菌上清，0.45 μ m濾膜過濾后上NTA-Ni親和柱進行純化，收集穿透液、雜蛋白洗脫液和目的蛋白洗脫液。將破菌上清、穿透液、NTA-50洗脫液、NTA-100洗脫液和目的蛋白洗脫液進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3所示。
[0109]Macros印超濾離心管(IOK)(購自Millipore公司)超濾濃縮目的蛋白洗脫液，得到蛋白L (SEQ ID N0.3所示)，大小約為20kD。
[0110]三、抗原免疫活性測定
[0111](一)免疫方法
[0112]分組:
[0113]動物選取6周齡Balb/C雌性小鼠，分為生理鹽水I組，pVAXl載體組，pVAXl-GP組，pVAXl-L組，pVAXl-LA組，pVAXl-LM組和pVAXl_LB5組；生理鹽水2組，GP蛋白組及L蛋白組，每組10只小鼠。
[0114]免疫方式:
[0115]生理鹽水I 組，pVAXl 載體組，pVAXl-GP 組，pVAXl-L 組，pVAXl-LA 組，pVAXl-LM組和pVAXl-LB組采取肌肉注射，不加佐劑，2周免疫一次(分別在第O天、第14天和第28天免疫)，100 μ g質(zhì)粒/只(質(zhì)粒濃度lmg/ml)，生理鹽水免疫體積為100 μ I/只，共3次。
[0116]生理鹽水2組，GP蛋白組，L蛋白組采取皮下注射，2周免疫一次(分別在第O天和第14天免疫)，35 μ g蛋白/只(蛋白濃度350 μ g/ml),生理鹽水免疫體積為100 μ I/只，共免疫2次，首次免疫采用弗氏完全佐劑(購自Sigma公司)，第二次免疫采用弗氏不完全佐劑(購自Sigma公司)，以1:1混合。
[0117]采血方式及時間:
[0118]尾靜脈米血，米血時間為免疫前米血I次，每次免疫后第10天米血I次。
[0119](二)血清中抗體滴度測定
[0120]1、所采各組小鼠的血液置于室溫凝固收縮2小時后，6000rpm離心8分鐘，收集上
清，即為血清。
[0121]2、重組蛋白GP (步驟二的(四)制備)鋪板(Nunc酶標板)，0.5 μ g/孔，4°C過夜，用PBST (含體積百分含量0.5%吐溫-20)溶液洗板4次，每次5分鐘；將板用5g/100ml的脫脂牛奶的PBST (含體積百分含量0.5%吐溫-20)溶液37°C封閉2小時，PBST (含體積百分含量0.5%吐溫-20)溶液洗板4次，每次5分鐘；加入步驟I得到的免疫血清，37°C孵育I小時，PBST (含體積百分含量0.5%吐溫-20)溶液洗板4次，每次5分鐘；加入HRP標記的Goat ant1-mouse IgG抗體，37°C孵育I小時，PBST (含體積百分含量0.5%吐溫-20)溶液洗板4次，每次5分鐘；100 μ I/孔加入TMB顯色液，室溫避光反應(yīng)15分鐘，加入2Μ硫酸終止反應(yīng)，0D450讀數(shù)(儀器為Thermo MULTI SCAN FC酶標儀)。
[0122]生理鹽水I 組，pVAX I 載體組，pVAX 1-GP 組，pVAX 1-L 組，pVAX 1-LA 組，pVAX 1-LM 組和pVAXl-LB5組血清中抗體滴度結(jié)果如圖4所示。
[0123]生理鹽水2組，GP蛋白組，L蛋白組血清中抗體滴度結(jié)果如圖5所示。
`[0124]圖4和圖5表明，無論采取質(zhì)粒免疫還是重組蛋白免疫，抗原L誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)水平均與抗原GP誘導(dǎo)的抗體反應(yīng)水平相當，二者之間無顯著性差異。
[0125](三)脾淋巴細胞增殖實驗
[0126]通過分析淋巴細胞增殖水平，可以判斷細胞免疫反應(yīng)水平。
[0127]1、于最后一次免疫后，無菌條件下取GP蛋白組和L蛋白組小鼠的脾臟，按照Mouse I X Lymphocyte Separation Medium的說明，從達優(yōu)小鼠淋巴細胞分離液分離小鼠脾淋巴細胞并制備淋巴細胞懸液(重懸于RPMI1640培養(yǎng)基)，按照2.5X IO5Cell/孔鋪96孔板，按100 μ I/孔加入重組蛋白GP (步驟二的(四)制備)溶液(25 μ g/ml，溶于RPMI1640培養(yǎng)基)或Concanavalin A (ConA,購自Sigma公司)，每組細胞設(shè)置3個復(fù)孔,將96孔板置于370C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時。
[0128]2、按照CCK-8KU說明，將WST-8按10 μ I/孔加入各細胞孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，測定0D.，計算刺激指數(shù)(SI)，結(jié)果如圖6所示。
[0129]圖6表明，蛋白GP (步驟二的(四)制備)刺激時，L蛋白組SI低于GP蛋白組，表明L蛋白組特異性細胞免疫水平弱于GP蛋白組；Concanavalin A刺激時,L蛋白組SI顯著高于GP蛋白組，表明L蛋白組非特異性細胞免疫狀態(tài)更為活躍，即抗原L能在一定程度上提高機體的細胞免疫反應(yīng)水平。
[0130]蛋白GP作為特異性刺激源，可刺激淋巴細胞產(chǎn)生特異性增殖反應(yīng)，抗原GP含較多的T細胞表位，能夠誘導(dǎo)更強烈的特異性細胞免疫反應(yīng)，而抗原L含有較少的T細胞表位(無已報道的T細胞表位)，故誘導(dǎo)的特異性細胞免疫反應(yīng)弱于抗原GP ；ConA是非特異性刺激源，抗原L可能具有某種上調(diào)機體淋巴細胞絲裂原受體表達水平的功能，因此在ConA刺激時，抗原L免疫的小鼠脾淋巴細胞增殖反應(yīng)較抗原GP更為強烈。
[0131](四)假病毒感染中和實驗
[0132]采用經(jīng)典的假型病毒的感染中和實驗方法(Arnab Basu, et al.JOURNAL OFVIROLOGY,Apr.2011，p.3106 - 3119;L.Du, et al.Res.Commun.(2010)，do1:10.1016/j.bbrc.2010.05.161)驗證抗原片段L誘導(dǎo)產(chǎn)生有效中和抗體的能力，為抗原片段L應(yīng)用于疫苗或中和抗體的開發(fā)提供依據(jù)。
[0133]具體步驟如下:
[0134]1、假病毒包裝:293FT細胞以5X IO5Cell/孔鋪6孔板，37°C，5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，至90%融合度。2yg pNL4-3.1uc.RE質(zhì)粒與2yg pVAXl-GP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細胞，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000 (購自Invitrogen公司)。轉(zhuǎn)染48小時后，收集培養(yǎng)上清，
0.22 μ m濾膜過濾分裝，即為假病毒溶液。
[0135]2、假病毒感染中和實驗:于實驗前一天，按IX IO4Cell/孔將293FT細胞鋪于96孔板，待到次日生長至80%融合度。將10 μ I步驟(二)制備的生理鹽水I組(圖7中的saline), pVAXl 載體組，pVAXl-GP 組，pVAXl-L 組，pVAXl-LA 組，pVAXl-LM 組和 pVAXl-LB組免疫血清與10 μ I步驟I制備的假病毒溶液混合于Iml DMEM培養(yǎng)基中，37°C孵育2小時得到混合液。將200 μ I/孔混合液替換96孔板細胞培養(yǎng)基，每組血清設(shè)置4個復(fù)孔，將96孔板置于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后，更換新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 48 小時后，按照 Bright-Glo Luciferase Assay System 說明，使用 PerkinElmerEnSpire?2300MUltiable Reader儀器測定各組發(fā)光值，計算假病毒感染抑制率，結(jié)果如圖7所示。
[0136]圖7表明，pVA`Xl載體組的實驗結(jié)果與生理鹽水I組的實驗結(jié)果無顯著性差異?？乖璍能夠有效誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，對假病毒感染細胞的中和能力與抗原GP相當。抗原L的三個截短體LA、LB及LM也能不同程度地抑制假病毒的感染，即三個截短體也能夠產(chǎn)生不同水平的中和抗體。
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白或該蛋白的截短體，該蛋白為如下(I)或(2)所示: Cl) SEQ ID N0.3所示的蛋白； (2)將SEQID N0.3所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)； 該蛋白的截短體為如下(3)- (8)任一所示: (3)SEQ ID N0.4所示的蛋白； (4)將SEQID N0.4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)； (5)SEQ ID N0.5所示的蛋白； (6)將SEQID N0.5所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)； (7)SEQ ID N0.6所示的蛋白； (8)將SEQID N0.6所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白或該蛋白的截短體的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于:所述蛋白的編碼基因為如下中1)-3)任一所示: O SEQ ID N0.1中自5’末端起第1177位至第1668位核苷酸所示的DNA分子； 2)在嚴格條件下與I)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1中(I)或(2)所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 3)與I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1中(I)或(2)所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 所述截短體的編碼基因為如下中4) -12)任一所示:4)SEQ ID N0.1中自5’末端起第1177位至第1437位核苷酸所示的DNA分子； 5)在嚴格條件下與4)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1中(3)或(4)所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 6)與4)或5)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1中(3)或(4)所述蛋白質(zhì)的DNA分子；7)SEQ ID N0.1中自5’末端起第1306位至第1557位核苷酸所示的DNA分子； 8)在嚴格條件下與7)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1中(5)或(6)所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 9 )與7 )或8 )限定的DNA分子具有90 %以上的同一性且編碼權(quán)利要求1中(5 )或(6 )所述蛋白質(zhì)的DNA分子；10)SEQ ID N0.1中自5’末端起第1438位至第1668位核苷酸所示的DNA分子； 11)在嚴格條件下與10)限定的DNA分子雜交且編碼權(quán)利要求1中(7)或(8)所述蛋白質(zhì)的DNA分子； 12)與10)或11)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權(quán)利要求1中(7)或(8)所述蛋白質(zhì)的DNA分子 。
4.含有權(quán)利要求2或3所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌。
5.權(quán)利要求1所述的蛋白或該蛋白的截短體、權(quán)利要求2或3所述的基因或權(quán)利要求4所述的重組載體在制備免疫原和/或抗原中的應(yīng)用； 所述免疫原或抗原是針對埃博拉病毒或埃博拉病毒包膜蛋白GP的。
6.權(quán)利要求1所述的蛋白或該蛋白的截短體、權(quán)利要求2或3所述的基因或權(quán)利要求4所述的重組載體作為抗原在制備針對埃博拉病毒的抗體中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的蛋白或該蛋白的截短體、權(quán)利要求2或3所述的基因或權(quán)利要求4所述的重組載體在制備預(yù)防和/或`治療埃博拉病毒引起的疾病的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/40GK103864904SQ201410076320
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月4日
【發(fā)明者】戴秋云, 王于, 劉珠果, 張科軍, 朱翠, 余碩 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所