一種具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型dna聚合酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶，是在金黃色葡萄球菌DNA聚合酶I（Sau）中插入有來源于T7噬菌體DNA聚合酶中的硫氧還蛋白結合結構域（TBD）而得到的雜合DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了編碼該蛋白的基因以及該蛋白的制備方法和用途。本發(fā)明改造后的DNA聚合酶催化活力維持不變，但是持續(xù)合成能力顯著提高，并且對鹽的耐受性提高，在田間和現(xiàn)場檢測過程中能夠顯著提高重組酶介導的核酸恒溫擴增技術的DNA擴增效果，具有廣泛的應用前景。
【專利說明】一種具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學和蛋白質工程領域，涉及一種具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶。
【背景技術】
[0002]在生物學研究、醫(yī)學檢驗、法醫(yī)鑒證及農(nóng)業(yè)等相關領域，核酸的擴增都是一種非常重要的技術。目前，應用最為廣泛的核酸擴增技術是聚合酶鏈式反應(Polymerase ChainReaction, PCR)。PCR技術利用反應溫度的循環(huán)變化來實現(xiàn)目的序列的變性、復性和延伸，能夠在2-3小時之內實現(xiàn)目的序列的指數(shù)級擴增。然而，由于PCR技術依賴體積大、耗電量高、價格昂貴的PCR儀來實現(xiàn)，限制了其在現(xiàn)場及田間檢測中的廣泛應用。
[0003]近些年，在DNA、RNA合成的分子生物學領域有許多的研究進展，許多在體內核酸擴增過程中發(fā)揮重要輔助作用的蛋白被相繼發(fā)現(xiàn)。在這些研究進展的基礎上，人們開發(fā)了多種恒溫核酸擴增技術，如轉錄介導的核酸擴增技術、鏈置換核酸擴增技術、環(huán)介導核酸恒溫擴增技術，及重組酶介導的核酸擴增技術等。與傳統(tǒng)的PCR技術相比，恒溫核酸擴增技術除了脫離PCR儀，能夠在恒溫條件下進行核酸擴增的優(yōu)勢以外，有一些恒溫核酸擴增技術還對一些擴增反應的抑制因素具有更高的耐受能力。
[0004]重組酶介導的核酸擴增技術是新近開發(fā)的恒溫核酸擴增技術之一。該技術模擬生物體內DNA的復制過程,利用酵母Rad51蛋白和大腸桿菌RecA蛋白來介導模板鏈的解鏈以及實現(xiàn)模板和擴增引物之間的鏈替換；在SSB蛋白的輔助下，DNA聚合酶可以對鏈替換后的DNA實現(xiàn)特異性的延 伸。該技術由ATP供能，并由磷酸肌酸催化實現(xiàn)ATP的再生。37°C恒溫條件下，重組酶介導的核酸擴增技術能夠在20-60min之內實現(xiàn)對目的片段的指數(shù)級別擴增。該技術還能夠與SYBR green I，SYT0-13或SYT0-82等共同作用，利用肉眼可見熒光染料來對擴增結果進行判斷。這樣既可以避免反復開關反應管而造成交叉污染的問題，又無需依賴具有致癌性的核酸電泳試劑以及昂貴的凝膠成像系統(tǒng)，使得重組酶介導的核酸擴增技術的應用與傳統(tǒng)的PCR技術相比更加便捷，也更加適用于現(xiàn)場和田間檢測使用。
[0005]重組酶介導的核酸恒溫擴增技術中使用的DNA聚合酶是枯草芽孢桿菌DNA聚合酶I (Bacillus subtilis Pol I, Bsu)或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus Pol I，Sau)，這兩種DNA聚合酶均屬于DNA聚合酶I家族。DNA聚合酶I家族是負責DNA復制過程中損傷修復的聚合酶，該家族中大部分DNA聚合酶的持續(xù)合成能力都不高，也就是說該家族的聚合酶與模板結合一次能催化的聚合反應數(shù)目較少。T7噬菌體中的DNA聚合酶也屬于DNA聚合酶I家族,然而它含有一段其他I類DNA聚合酶所不含有的蛋白序列(硫氧還蛋白結合結構域，thioredoxin binding domain, TBD),該序列能夠與來源于大腸桿菌的硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)特異性的相互結合。Trx具有DNA結合作用，它與T7卩遼菌體中的DNA聚合酶的1:1結合能夠大幅提高T7噬菌體中的DNA聚合酶的持續(xù)合成能力。因此，利用TBD結構域與Trx蛋白相互結合作用的機理對其他DNA聚合酶進行改造也許能為提高DNA聚合酶的持續(xù)合成能力提供一條很好的思路。
【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的第一目的是提供一種具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶，是在金黃色葡萄球菌DNA聚合酶I (Sau)中插入有來源于T7噬菌體DNA聚合酶中的硫氧還蛋白結合結構域(TBD)而得到雜合的DNA聚合酶，力求克服DNA聚合酶I家族中大部分DNA聚合酶的持續(xù)合成能力不高的問題。
[0007]本發(fā)明的第二目的是提供編碼上述具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶的基因。
[0008]本發(fā)明的第三目的是提供上述具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶的制備方法。
[0009]本發(fā)明的第四目的是提供上述具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶的用途。
[0010]本發(fā)明通過以下技術方案來實現(xiàn):
[0011]一、一種具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶，是在金黃色葡萄球菌DNA聚合酶I (Sau)中插入有來源于T7噬菌體DNA聚合酶中的硫氧還蛋白結合結構域(TBD)而得到的雜合DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0012]二、編碼上述具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0013]三、上述的具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0014](I)確定T7噬菌體DNA聚合酶TBD結構域在Sau蛋白中的對應位置，以及目標替換序列；
[0015](2)根據(jù)GenBank已經(jīng)公布的Sau基因序列以及TBD序列信息設計并合成引物，并通過Overlap PCR技術擴增得到帶有純化標簽、酶切位點的將TBD插入Sau基因序列正確位置的Sau-TBD片段；
[0016](3)將步驟(2)中得到的Sau-TBD克隆至表達載體pTrc99A中構建重組載體pTrc99A-Sau~TBD ；
[0017](4)表達載體pTrc99A_Sau_TBD轉化大腸桿菌、誘導表達得蛋白。
[0018]四、上述的具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶在常溫核酸擴增技術中的應用。
[0019]采用上述技術方案的積極效果:本發(fā)明對恒溫核酸擴增技術中DNA聚合酶進行了分子生物學改造，改造后催化活力維持不變，但是持續(xù)合成能力顯著提高，并且在重組酶介導的核酸恒溫擴增反應中對鹽的耐受性提高；在田間和現(xiàn)場進行核酸檢測時，由于采用比較簡便的DNA提取技術，因此DNA樣品模板常`不夠純，可能含有鹽離子等擴增抑制類物質；改造后的DNA聚合酶，由于對鹽具有更高的耐受能力，因此在田間和現(xiàn)場檢測過程中能夠顯著提高重組酶介導的核酸恒溫擴增技術的DNA擴增效果，具有廣泛的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】[0020]圖1是T7噬菌體DNA聚合酶和Sau蛋白三維結構預測及重疊比對結果；
[0021]圖2是TBD結構域在Sau蛋白序列中的插入位置；
[0022]圖3是pTrc99A-Sau_TBD重組質粒構建示意圖；
[0023]圖4是pTrc99A-Sau_TBD重組質粒酶切鑒定結果；
[0024]圖中，MMarker, lpTrc99A-Sau_TBD 質粒，2pTrc99A-Sau_TBD 質粒雙酶切產(chǎn)物；
[0025]圖5是Sau-TBD重組蛋白SDS-PAGE分析結果；
[0026]圖中，M Marker，I誘導前，2誘導后，3上清，4沉淀，5流穿，6目的蛋白(約73KD);
[0027]圖6是pET28a_Trx重組質粒構建示意圖；
[0028]圖7是pET28a_Trx重組質粒酶切鑒定結果；
[0029]圖中，MMarker, lpET28a_Trx 質粒,2pET28a_Trx 質粒雙酶切產(chǎn)物；
[0030]圖8是Trx蛋白SDS-PAGE分析結果；
[0031]圖中，M Marker，l誘導前，2誘導后，3上清，4沉淀，5流穿，6目的蛋白(約13KD);
[0032]圖9是Sau和Sau-TBD持續(xù)合成能力檢測的電泳峰圖；
[0033]圖中，橫 坐標表示加入的核苷酸量，縱坐標表示熒光強度；
[0034]圖10是Sau和Sau-TBD鹽耐受度比較的電泳圖。
【具體實施方式】
[0035]下面結合實施例和對比例對本發(fā)明的技術方案做進一步的說明，但不應理解為對本發(fā)明的限制:
[0036]本發(fā)明中的生物材料來源:
[0037]1、金黃色葡萄球菌CICC21600購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，大腸桿菌BL21 (DE3)購自 Novagen 公司；
[0038]2、所用引物及含有TBD基因的質粒pUC57-TBD委托中國華大基因生物科技有限公司合成；
[0039]3、所用載體 pTrc_99A 和 pET28a 購自 Novagen 公司。
[0040]實施例1
[0041]根據(jù)GenBank 公布的序列信息，在 swiss-modeI 網(wǎng)站(http: //swissmodel.expasy.0rg/)對T7噬菌體DNA聚合酶和Sau進行三維結構預測。.隨后，利用EBI網(wǎng)站上的 DaliLite 功能(http: //www.eb1.ac.uk/Tools/structure/daliIite/)對 T7 卩遼菌體 DNA聚合酶(PDB:2AJQ_A)和Sau (PDB:4DQQ_D)的三維結構進行比對，并找到Sau蛋白序列中TBD結構域的對應位置，確認替換序列(如圖1、圖2所示)。
[0042]實施例2
[0043]本實施例用于說明Sau-TBD片段的獲取。
[0044]1、根據(jù)GenBank和相關文獻報道的序列信息合成T7噬菌體DNA聚合酶TBD結構域序列(NCBI登記號為ACY75853.1)，序列如SEQ ID N0.3所示。
[0045]2、根據(jù)GenBank已經(jīng)公布的Sau基因序列(NCBI參考序列號為ΥΡ_006237943.I)以及TBD序列信息設計并合成引物:
[0046]PT1_F:5，-CATGCCATGGAACATCATCATCATCATCATTCAGCAAGCGTTGAAG-3’ (NcoI) (SEQID N0.4)[0047]PT1_R:5’ -GATACCACGA ACCAGCTGCATCATGGAT-3’ (SEQ ID N0.5)
[0048]PT2_F:5，-GTTGTGTTTAACCCTTCGTCTCCTAAGCAATTAGGTG-3’ (SEQ ID N0.6)
[0049]PT2 R:5’ -CGCGGATCCTTATTTTGCATCATACC-3’ (BamHI) (SEQ ID N0.7)
[0050]TBD_F:5，-TGCAGCTGGTTCGTGGTATCAGCCTAAAGG-3’ (SEQ ID N0.8)
[0051]TBD_R:5，-CACCTAATTGCTTAGGAGACGAAGGGTTAAACACAAC-3，(SEQ ID N0.9)
[0052]3、采用特異性引物PT1_F/PT1_I^PPT2_F/PT2_R，以金黃色葡萄球菌CICC21600的基因組DNA為模板，分別進行PCR擴增；采用特異性引物TBD_F/TBD_R，以人工合成的含有TBD基因的質粒pUC57-TBD為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系為PrimeSTAR HS(TAKARA)建議的常規(guī)擴增體系。PCR反應程序:98°C預變性2min，98°C變性10s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，循環(huán)27次，最后72°C延伸10min，4°C保存。
[0053]4、用PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒分別進行PT1、PT2和TBD片段的回收，步驟如下:
[0054]I)在紫外燈下使用手術刀片快速切下目的片段瓊脂糖凝膠，放入1.5ml離心管中。
[0055]2)按 1:3 的比例加入 Extraction Buffer。
[0056]3)在50°C恒溫水浴鍋放置lOmin，每隔2min輕柔顛倒。
[0057]4)將上一步中混合液加入Spin column中,6000Xg離心lmin,倒掉收集管液體。
`[0058]5)向 Spin column 內加 500 μ I Extraction Buffer,于 12000 X g 離心 lmin,棄去接液內液體。
[0059]6)向 Spin column 內加 750 μ I Wash Buffer,于 12000 X g 離心 lmin,棄去接液管
內液體。
[0060]7)將Spin column放回收集管內，12000Xg離心lmin。把Spin column放到無菌的1.5ml Ep管內。
[0061]8)向 Spin column 內加50μ1 Elution Buffer,并于室溫靜置 lmin。于 12000 X g離心lmin，微量離心管內溶液中含有目的DNA片段。存放_20°C。
[0062]5、以PTl和TBD片段為模板，以PT1_F和TBD_R為引物進行Overlap PCR。擴增體系為:
[0063]
【權利要求】
1.一種具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶，是在金黃色葡萄球菌DNA聚合酶I (Sau)中插入有來源于T7噬菌體DNA聚合酶中的硫氧還蛋白結合結構域(TBD)而得到的雜合DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所示的具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.權利要求1所述的具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶的制備方法，其特征在于:該方法包括以下步驟: (1)確定T7噬菌體DNA聚合酶TBD結構域在Sau蛋白中的對應位置，以及目標替換序列； (2)根據(jù)GenBank已經(jīng)公布的Sau基因序列以及TBD序列信息設計并合成引物，并通過Overlap PCR技術擴增得到帶有純化標簽、酶切位點的將TBD插入Sau基因序列正確位置的Sau-TBD片段； (3)將步驟(2)中得到的Sau-TBD克隆至表達載體pTrc99A中構建重組載體pTrc99A-Sau-TBD ； (4)表達載體pTrc99A-Sau-TBD轉化大腸桿菌、誘導表達得蛋白。
4.權利要求1所述的具有持續(xù)合成能力和鹽耐受度的新型DNA聚合酶在常溫核酸擴增技術中的應用。
【文檔編號】C12N9/12GK103881989SQ201410079508
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權日:2014年3月6日
【發(fā)明者】程奇, 翟冰, 周國輝, 李賢禎, 劉國憲 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所