一種用于檢測人kras基因突變的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測人KRAS基因突變的試劑盒及其檢測方法，包括2對擴增引物和2條測序引物，本發(fā)明公開的檢測KRAS基因突變的試劑盒完全基于一種新的實驗方法設(shè)計，結(jié)構(gòu)設(shè)計簡單合理、使用方便；在檢測KRAS基因突變時具有敏感性高、特異性強、耗時短等優(yōu)點。
【專利說明】—種用于檢測人KRAS基因突變的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測人KRAS基因突變的試劑盒及其檢測方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]1)KRAS基因突變在結(jié)直腸癌中的臨床意義
[0003]近年來，隨著人民生活水平的不斷提高，飲食習(xí)慣和飲食結(jié)構(gòu)的改變以及人口老齡化，我國結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢。其中，結(jié)腸癌的發(fā)病率上升尤為顯著。大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬于中晚期。結(jié)直腸癌發(fā)病率22.1萬，死亡率11萬，5年生存率63.7%。
[0004]KRAS是EGFR (表皮生長因子受體)信號傳導(dǎo)通路中的一個關(guān)鍵的下游調(diào)節(jié)因子，參與細胞生長的調(diào)節(jié)，在癌變發(fā)生過程中起著重要作用。KRAS基因產(chǎn)物參與了控制基因轉(zhuǎn)錄的激酶信號傳導(dǎo)路徑，從而能調(diào)節(jié)細胞的生長與分化。KRAS基因的改變使KRAS蛋白發(fā)生變化，其結(jié)果KRAS蛋白不再具有裂解GTP分子和釋放GTP分子的能力。這樣的改變導(dǎo)致這條信號傳導(dǎo)路徑始終處于“開”通的狀態(tài)。這種“開”的信號導(dǎo)致細胞的生長和增生。因此KRAS的過度表達與擴增導(dǎo)致持續(xù)的細胞增殖，這是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵一步。
[0005]西妥昔單抗和帕尼單抗是作用于EGFR的單克隆抗體，可以抑制下游的信號通路傳導(dǎo)。2008年6月，美國臨床腫瘤學(xué)會(ASCO)年會上CRYSTAL、OPUS等研究了西妥昔單抗聯(lián)合F0LFIRI和FOLFOX作為轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的初始治療作用，結(jié)論為:KRAS野生型患者在加用西妥昔單抗治療后PFS得到了顯著改善。若KRAS有突變，則無論單藥或聯(lián)合均不應(yīng)使用西妥昔單抗或帕尼單抗，因為不僅`無效，還增加副反應(yīng)，浪費金錢。
[0006]2008年10月，KRAS基因檢測被寫入《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)結(jié)直腸癌臨床實踐指南》，專家組強烈推薦所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進行KRAS基因型檢測，原發(fā)灶或繼發(fā)灶組織均可，對于KRAS野生型的患者可考慮進一步檢測BRAF分型。
[0007]2010年版中國《結(jié)直腸癌診療規(guī)范》指出:完整的病理報告內(nèi)容應(yīng)該包括K-ras基因狀態(tài)的檢測，同時晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌靶向藥物治療前應(yīng)檢測KRAS。
[0008]2) KRAS基因突變在非小細胞肺癌NSCLC的臨床意義
[0009]原發(fā)性肺癌(以下簡稱肺癌)是我國最常見的惡性腫瘤之一。2012年WHO統(tǒng)計顯示，肺癌是我國目前發(fā)病率和死亡率第I位的惡性腫瘤?；诜伟┑纳飳W(xué)特性、治療和預(yù)后，WHO將其分為兩大類:非小細胞肺癌NSCLC和小細胞肺癌SCLC。其中NSCLC占肺癌的85%以上。雖然治療肺癌技術(shù)有了很大的提高，但5年生存率沒有明顯改善，而且大多數(shù)肺癌患者死于無法控制的遠處轉(zhuǎn)移，傳統(tǒng)的化療和放療由于缺乏特異性，取得療效的同時也往往給患者帶來較大的副作用。因此，選擇肺癌細胞特異的分子靶點，應(yīng)用針對該靶點的藥物進行治療，在取得明顯療效的同時又避免對正常細胞的傷害的治療模式，已經(jīng)被腫瘤學(xué)術(shù)界和廣大患者所認同和采用。
[0010]EGFR (epidermal growth factor receptor,表皮生長因子受體)是目前用于NSCLC分子靶向治療的最主要靶點。EGFR受體抑制劑TKI小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor),通過阻斷細胞受體的ATP結(jié)合位點，阻止下游信號傳遞而產(chǎn)生抑制腫瘤作用。
[0011]三種EGFR-TKI (吉非替尼/易瑞沙，厄羅替尼/特羅凱，和凱美鈉)是目前用于NSCLC分子靶向治療的主要藥物，但在不同的病人中EGFR-TKI的療效差異很大。大量臨床實驗發(fā)現(xiàn)，除了 EGFR突變，KRAS突變能幫助NSCLC病人更好的預(yù)測吉非替尼療效；KRAS突變的NSCLC病人用厄洛替尼聯(lián)合處理后臨床預(yù)后較差。
[0012]2012年《美國國立癌癥綜合網(wǎng)絡(luò)(NCCN)非小細胞肺癌臨床實踐指南》病理評估原則中明確=KRAS突變和內(nèi)源性TKI耐藥有關(guān)，確定KRAS基因狀態(tài)有助于選擇適合TKI治療的病人。同時指出，KRAS基因狀態(tài)是NSCLC生存的預(yù)后指標，也是EGFR-TKI藥物的療效預(yù)測指標。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]KRAS基因最常見的突變位點見于12、13、61密碼子，這些突變可發(fā)生在許多人類腫瘤中。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題提供一種用于檢測人KRAS基因突變的試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明采用基于實時序列檢測的焦磷酸測序(Pyro Mark KRAS v2.0)技術(shù)對上述突變進行檢測和定量，本試劑盒在檢測KRAS基因突變時具有敏感性高、特異性強、耗時短等優(yōu)點。
[0014]本試劑盒包含2套PCR引物。一套能夠擴增KARS基因外顯子I，包含12、13密碼子在內(nèi)的片段，另一套能夠擴增KARS基因外顯子2，包含61密碼子在內(nèi)的片段。每套PCR引物中均有一條引物標記了生物素的引物，它能保證在測序反應(yīng)中正確分離出待測DNA鏈。同時，該試劑盒還含有2條不同的測序引物，一條用于12、13密碼子，另一條用于61密碼子，它們用于后續(xù)的焦 磷酸序列分析中檢測最常見的3個密碼子突變(正常樣品的分析序列如圖1、2所示)。
[0015]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:一種用于檢測人KRAS基因突變的試劑盒，包括如下擴增引物和測序引物:
[0016]I)擴增引物:
[0017]KARS 密碼子 12、13F:5' -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3' (SEQ IDN0.1)；
[0018]KARS 密碼 12、13R: 5' -GTTGGATCATATTCGTCCACAAA-3' (SEQ ID N0.2)，5'端生物素標記；
[0019]KARS 密碼 6IF: 5' -CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAGGATT-3' (SEQ IDN0.3 )；
[0020]KARS 密碼 6IR: 5' -AAGAAAGCCCTCCCCAGTCC-3' (SEQ ID N0.4)，5'端生物素標記；
[0021]2)測序引物:
[0022]KARS 密碼子 12、13:5' -AAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3' (SEQ ID N0.5)，檢測密碼子12和13 ；
[0023]KARS 密碼 61:5' -TTGGATATTCTCGACACAGCAGGT-3' (SEQ ID N0.6)，檢測密碼子61。
[0024]其中，F(xiàn):正向引物，R:反向引物。[0025]試劑盒中的其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規(guī)試劑。
[0026]本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用上述的試劑盒檢測人KRAS基因突變的方法，包括:
[0027]I)提取樣本DNA (使用天根公司基因組DNA提取試劑盒，貨號DP331)；
[0028]2) PCR 擴增:
[0029]配制50 μ I PCR 反應(yīng)體系，包含:ddH2021 y l、2XTaq mix25 μ I (novoprotein 公司，產(chǎn)品貨號:E005)、樣本DNA2y 1、濃度為10 μ M的EGFR基因一對引物混合物2 μ 1，按照下面的循環(huán)參數(shù)設(shè)置循環(huán)儀:95°C
[0030]5min預(yù)變性；然后依次在95°C 30s,61°C 30s,72°C 30s，35個循環(huán)；再在72°C保持IOmin,最終保持在4°C，得到擴增產(chǎn)物；
[0031]其中，2XTaq mix包含:Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2以及反應(yīng)緩沖液。
[0032]其中KRAS基因引物混合物含有正向引物和反向引物各I μ I ;
[0033]3)制備單鏈DNA模板；
[0034]4)利用Qiagen公司的焦磷酸測序儀Pyro Mark Q96ID對分離的模板進行序列分析。
[0035]本發(fā)明的有益效果是:
[0036]本發(fā)明公開的檢測KRAS基因突變的試劑盒完全基于一種新的實驗方法設(shè)計，結(jié)構(gòu)設(shè)計簡單合理、使用方便、分區(qū)設(shè)計使得檢測過程不易受污染；
`[0037]本試劑盒在檢測KRAS基因突變時具有敏感性高、特異性強、耗時短等優(yōu)點；
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1為本發(fā)明基因KARS12-13密碼子正向測序原理圖；
[0039]圖2為本發(fā)明基因KARS61密碼子正向測序原理圖，密碼子是CAA ；
[0040]圖3為向Pyro Mark Q96ID的試劑槽中加入核苷酸、酶和底物的加樣位置圖；
[0041]圖4為本發(fā)明基因KARS密碼子12的位置2突變(GGT)，密碼子13正常的焦磷酸測序結(jié)果圖；
[0042]圖5為本發(fā)明基因KARS密碼子13的位置2突變(GGC)，密碼子12正常的焦磷酸測序結(jié)果圖；
[0043]圖6為本發(fā)明基因KARS密碼子12、13正常對照的焦磷酸測序結(jié)果圖；
[0044]圖7為本發(fā)明基因KARS密碼子61正常對照的焦磷酸測序結(jié)果圖；
[0045]附圖中，各標號所代表的部件列表如下:
[0046]FP:正向引物；FPB:生物素標記的正向引物；RP:反向引物；RPB:生物素標記的反向引物；Seq:測序引物。
[0047]G:dGTP, C:dCTP, T:dTTP, S:Substrate Mixture (底物)，A:dATPaS, EiEnzymeMixture (酶)。
【具體實施方式】
[0048]以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0049]實施例1[0050]I)擴增引物:
[0051]KARS 密碼子 12、13F:5' -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3' (SEQ IDN0.1)；
[0052]KARS 密碼子 12、13R:5' -GTTGGATCATATTCGTCCACAAA-3' (SEQ IDN0.2),5/ 端生物素標記；
[0053]KARS 密碼子 6IF:5' -CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAGGATT-3' (SEQ IDN0.3)；
[0054]KARS 密碼子 6IR: 5' -AAGAAAGCCCTCCCCAGTCC-3' (SEQ ID N0.4)，5'端生物素標記；
[0055]2)測序引物:
[0056]KARS 密碼子 12、13:5' -AAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3' (SEQ ID N0.5)；
[0057]KARS 密碼子 61:5' -TTGGATATTCTCGACACAGCAGGT-3' (SEQ ID N0.6)。
[0058]一、提取樣本DNA:
[0059]1.樣本處理
[0060]a.石臘切片:取石臘切片(5-10 μ m厚，I X lcm2大小)5-8張。
[0061]b.石蠟塊:手術(shù)刀刮取約30mg的組織樣本(盡量去除多余的石蠟)。
[0062]注意:如果樣品表面暴露于空氣中，最初刮取的2-3片棄掉不用。
[0063]c.福爾馬林等固定液中的樣本:取30mg樣本，用手術(shù)刀切為數(shù)塊，置于1.5ml離心管中，`
[0064]加入500 μ I PBS(10mM,pH7.4)渦旋振蕩混勻，12，OOOrpm (~13，400 Xg)室溫離心lmin，重復(fù)2次，然后從步驟7開始操作。
[0065]2.將石蠟切片或石蠟塊樣本裝于1.5ml無菌離心管中，加入1ml 二甲苯，劇烈渦旋IOsec0
[0066]3.12，OOOrpm (~13，400 Xg)室溫離心2min，棄上清。注意:不要倒掉沉淀。
[0067]4.在上述管中加入1ml無水乙醇，渦旋混勻lOsec。
[0068]5.12, OOOrpm (~13，400 Xg)室溫離心2min,棄上清。注意:不要倒掉沉淀。
[0069]6.室溫放置5-10min,充分揮發(fā)乙醇。
[0070]7.加入200 μ I緩沖液GA和20 μ I Proteinase K，充分混勻，56°C孵育Ih直至樣本完全裂解。
[0071]8.置于 90°C孵育 Ih。
[0072]9.(可選步驟)如果要去除RNA，可以將樣品中加入2μ I RNase A (100mg/ml)，室溫孵2min后,進行下一步操作。
[0073]10.在上管中加入220 μ I緩沖液GB渦旋混勻，再加入250 μ I無水乙醇，渦旋震蕩充分混勻，短暫離心使管壁上的溶液收集到管底。
[0074]11.將上一步所得的混合液加入一個吸附柱CR2中8，OOOrpm (~6，OOOXg)室溫離心2min，倒掉廢液，重新將吸附柱放回收集管中。注意:吸附柱最大容量為700 μ 1，可將剩余液體重復(fù)上述步驟上柱。
[0075]12.向吸附柱CR2中加入500μ I緩沖液⑶，8，OOOrpm (~6，OOOXg)室溫離心60sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放回收集管中。
[0076]13.向吸附柱CR2中加入600 μ I漂洗液PW，8，OOOrpm (~6，OOOXg)室溫離心60sec，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。[0077]14.重復(fù)操作步驟13。
[0078]15.將吸附柱0?2放回收集管中，12，000印111(~13，400\8)離心2min，倒掉廢液。
將吸附柱開蓋置于室溫放置2-5min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。注意:乙醇殘留會抑制后續(xù)的酶反應(yīng)，所以晾干時要確保乙醇揮發(fā)干凈。但也不要干燥太長時間，以免難以洗脫DNA。
[0079]16.將吸附柱CR2轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加65°C預(yù)熱的30-100 μ I洗脫緩沖液TE或ddH20洗脫，室溫放置2_5min，12，OOOrpm(~13，400 Xg)離心2min，將收集有DNA的離心管_20°C保存。注意:洗脫緩沖液體積不應(yīng)少于30μ 1，體積過小影響回收效率。為增加基因組DNA的得率，可將離心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室溫放置2min, 12，OOOrpm (~13，400 Xg)離心2min。洗脫液的pH對于洗脫效率有很大影響。若用水做洗脫液應(yīng)保證其pH值在7.0-8.5范圍內(nèi)，pH值低于7.0會降低洗脫效率；且DNA產(chǎn)物應(yīng)保存在_20°C，以防DNA降解。
[0080]二、PCR 擴增:
[0081]若要分析KRAS基因的12、13和61密碼子突變，每個樣品必須分別作2個PCR反應(yīng)，一個用于擴增含12、13密碼子的區(qū)域，另一個用于擴增含61密碼子的區(qū)域。在后續(xù)的焦磷酸測序分析時，相應(yīng)的每個樣品也需要做2個反應(yīng)體系，一個用于分析含12、13密碼子的片段，另一個用于分析含61密碼子的區(qū)域。但上述2個體系的分析可同時在一次測序程序中實現(xiàn)。
[0082]1、操作前注意事項
[0083]1.1在專門的DNA制備或PCR產(chǎn)物分析的區(qū)制備反應(yīng)體系；
[0084]1.2使用帶有濾芯的一次性槍頭避免交叉污染；
[0085]1.3打開含PCR引物的離心管前，先進行短暫的離心使引物聚集在離心管底部；
[0086]1.4將2套PCR引物分別溶于消毒后的高純水中，IOuM濃度。
[0087]2、步驟
[0088]2.1解凍的2x Master PCR Mix，ddH20和引物(Primer)。上述試劑使用前須充分混合，避免試劑中鹽在局部沉積。
[0089]2.2按照表1配制反應(yīng)體系:
[0090]表1PCR配制反應(yīng)體系
[0091]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測人KRAS基因突變的試劑盒，其特征在于，包括如下擴增引物和測序引物: 1)擴增引物: KARS 密碼子 12、13F: 5' -AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3'； KARS 密碼子 12、13R:5' -GTTGGATCATATTCGTCCACAAA-3' ,5'端生物素標記； KARS 密碼子 6IF: 5' -CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTCAGGATT-3'； KARS 密碼子 6IR:5' -AAGAAAGCCCTCCCCAGTCC-3' ,5'端生物素標記； 2)測序引物: KARS 密碼子 12、13:5' -AAACTTGTGGTAGTTGGAGC-3'； KARS 密碼子 61:5' -TTGGATATTCTCGACACAGCAGGT-3'。
2.一種應(yīng)用如權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測人KRAS基因突變的方法，其特征在于，包括: 1)提取樣本DNA； 2)PCR擴增:
配制50 μ I PCR反應(yīng)體系，包含:ddH2021 y l、2XTaq mix25 μ 1、樣本DNA2y 1、濃度為，10 μ M的EGFR基因一對引物混合物2 μ 1，按照下面的循環(huán)參數(shù)設(shè)置循環(huán)儀:95°C 5min預(yù)變性；然后依次在95°C 30s,61°C 30s, 72°C 30s，35個循環(huán)；再在72°C保持lOmin，最終保持在，4°C，得到擴增產(chǎn)物； 其中KRAS基因引物混合物含有 正向引物和反向引物各Iy I ； 3)制備單鏈DNA模板； 4)利用焦磷酸測序設(shè)備對分離的模板進行序列分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK103882123SQ201410079592
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月16日
【發(fā)明者】王彤, 陳大方 申請人:瑞希基因科技（北京）股份有限公司