一種dna分子克隆方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種DNA分子克隆方法，制備在上、下游均具有5’單鏈末端的載體和目的基因；載體和目的基因的單鏈末端能互補配對，無需連接酶，即將載體和目的基因連接重組成閉合環(huán)狀DNA，然后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，在細胞內(nèi)擴增重組DNA。依賴連接酶的克隆方法簡單高效，是克隆單個基因的常用方法，但該技術(shù)也存在明顯的不足，而本發(fā)明提供的方法不受序列限制、簡便高速，而且重組準確。
【專利說明】—種DNA分子克隆方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種DNA分子克隆方法，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]DNA的限制性內(nèi)切酶酶切和酶促連接反應(yīng)，作為基因工程的基礎(chǔ)技術(shù)，是20世紀分子生物學方法的重要成就之一。在此基礎(chǔ)上，研究者利用PCR和定點突變等技術(shù)極大地拓展了重組DNA技術(shù)的應(yīng)用。
[0003]目前，分子克隆的方法多采用依賴連接酶(例如:T4 DNA連接酶、Τ7 DNA連接酶、Τ3DNA連接酶，等等)的克隆方法，此法是一種經(jīng)典的克隆方法，主要分為以下兩種類型:(1)粘性末端連接:即載體質(zhì)粒和待插入的外源片段都通過合適的限制性內(nèi)切酶切割，產(chǎn)生相互匹配的粘性末端，然后在連接酶作用下重新形成磷酸二酯鍵，從而得到環(huán)化的重組質(zhì)粒；
(2)平末端連接:平末端連接中，載體和片段均為平端，都沒有粘性末端突出。其優(yōu)點是步驟簡單，不需要多次酶切，但是克隆效率較低，而且不能實現(xiàn)定向克隆。
[0004]總的來說，依賴連接酶的克隆方法簡單高效，是克隆單個基因的常用方法。但該技術(shù)也存在明顯的不足:一方面，插入片段要經(jīng)過限制性內(nèi)切酶處理，這樣在實驗設(shè)計時就要考慮目的基因的DNA序列，不能實現(xiàn)多基因的平行操作，不適合高通量；另一方面，該過程使用連接酶，不但延長了實驗的周期，而且也會帶來載體自連的背景，增加了篩選工作量。而且，在很多情況下， 重組DNA技術(shù)的應(yīng)用都會受到基因序列中原有的酶切位點的限制，尤其是多基因片段的重組往往更容易受到限制酶酶切位點序列的限制，研究者不得不使用一些非常稀有的酶切位點，這就大大增加了 DNA重組的工作量和難度。因此，開發(fā)一種不受序列限制、簡便高速、而且重組準確的新方法，就顯得尤其必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種DNA分子克隆方法，目前依賴連接酶的克隆方法簡單高效，是克隆單個基因的常用方法，但該技術(shù)也存在明顯的不足，重組DNA技術(shù)的應(yīng)用會受到基因序列中原有的酶切位點的限制，尤其是多基因片段的重組往往更容易受到限制酶酶切位點序列的限制，因此本發(fā)明開發(fā)了一種不受序列限制、簡便高速、而且重組準確的新方法。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種用于DNA分子克隆方法的目的基因及載體，所述目的基因上游的單鏈區(qū)如SEQ IDN0.1所示，與其互補配對的載體的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.2所示，或者目的基因上游的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.2所示，與其互補配對的載體的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.1所示；目的基因下游單鏈區(qū)如SEQ ID N0.3所示，與其互補配對的載體的單鏈區(qū)為如SEQ ID N0.4所示，或者目的基因下游單鏈區(qū)如SEQ ID N0.4所示，與其互補配對的載體的單鏈區(qū)為如SEQ ID N0.3所
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[0007]—種DNA分子克隆方法，制備在上、下游均具有5’單鏈末端的載體和目的基因；載體和目的基因的單鏈末端能夠互補配對，無需連接酶，在體外將載體和目的基因混合，二者的末端互補配對，連接重組成閉合環(huán)狀DNA，然后直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，在細胞內(nèi)擴增重組DNA。
[0008]其包括T4 DNA polymerase 反應(yīng)液體系:回收產(chǎn)物 0.2pmol, IOX T4 DNApolymerase buffer 5 μ I, IOOmM dTTP 1.5μ 1,0.1% BSA 5 μ 1，(1(1!120補足至5(^ I ；70°C保溫5min,降溫到37?,加入Τ4 DNA polymerase I μ I,用移液器吸頭攪動混合,不可劇烈振動；37°C保溫IOmin，使用漩渦震蕩器震蕩，使酶滅活。
[0009]其無連接酶的連接反應(yīng)體系為載體3μ1，插入片段6μ1，步驟為混勻載體和插入片段，22°C保溫5min，再加入25mM EDTA 3 μ 1，22°C保溫5min，攪動混勻，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上。
[0010]優(yōu)選地，當所述目的基因上游的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.1所示，與其互補配對的載體的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.2所示時，目的基因與載體的密碼子框架對齊，如果載體是蛋白表達載體，則不影響蛋白表達；如SEQ ID N0.1所示的單鏈區(qū)用到了 GGC、CGC、GAA、CAG這4種密碼子，在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉等常見宿主菌中，它們均不是稀有密碼子；前文所述4段單鏈區(qū)的長度適中，結(jié)合能力強。
[0011]上述4種密碼子在常見宿主菌中的出現(xiàn)頻率(每千個密碼子中出現(xiàn)頻數(shù)):
e.coli kl2 (大腸桿菌):
GGC 33.4
CGC 26.0
GAA 43.7
CAG 27.7
Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168 (枯草芽抱桿菌):
GGC 11.7
GGC 11.7
GAA 46.9
CAG 15.6
Aspergillus niger (黑曲霉):
GGC 22.5
CGC 15.9
GAA 24.8
CAG 24.2
上述統(tǒng)計數(shù)據(jù)來自于:Codon Usage Database。
[0012]SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 的結(jié)合區(qū) GC:AT=11:15，大于 73% ；SEQ ID N0.3 和SEQ ID N0.4 的結(jié)合區(qū) GC:AT=10:14，大于 71%。
[0013]使用RNAstructure軟件,分別分析前文所述4個單鏈區(qū)的DNA分子的最穩(wěn)定分子內(nèi)二級結(jié)構(gòu):SEQ ID N0.1，僅有2個連續(xù)堿基形成分子內(nèi)配對，結(jié)合能為-0.8，結(jié)構(gòu)圖見圖5;SEQ ID N0.2，僅有3個堿基形成分子內(nèi)配對，其中連續(xù)堿基2個，結(jié)合能為-4.1，結(jié)構(gòu)圖見圖6;SEQ ID N0.3，單鏈區(qū)為直線型，無二級結(jié)構(gòu)，沒有堿基形成分子內(nèi)配對，結(jié)合能為O;SEQ ID N0.4，僅有I個堿基形成分子內(nèi)配對，結(jié)合能為-1，結(jié)構(gòu)圖見圖7。[0014]所有單鏈區(qū)的堿基序列，都經(jīng)過優(yōu)化優(yōu)選設(shè)計，在保證單鏈區(qū)高GC:AT比例的情況下，又盡可能避免分子內(nèi)堿基配對，避免形成單鏈區(qū)分子內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)。
[0015]單鏈區(qū)最穩(wěn)定的分子內(nèi)二級結(jié)構(gòu)，沒有出現(xiàn)大于或等于3個的連續(xù)GC配對?？梢员ＷC在連接反應(yīng)時，單鏈區(qū)以線性形式存在。繼而確保載體和目的基因分子間的高效連接。
[0016]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
GC:AT值越高，意味著載體和目的基因單鏈區(qū)配對重組后的結(jié)合力越強。本專利設(shè)計的單鏈區(qū)具有70%以上的GC:AT值，高于任何已有的技術(shù)或者文獻報道。但是這個比值越高，意味著單鏈區(qū)分子內(nèi)部自身配對的概率和結(jié)合力也越大，若自身發(fā)生配對，將不會與互補鏈配對，嚴重影響連接。本專利設(shè)計的上述序列將能夠互補配對的G和C堿基在單鏈區(qū)有序地間隔開，盡可能避免單鏈區(qū)分子內(nèi)配對。同時，后續(xù)的連接反應(yīng)實驗步驟，也能有利于分子間(載體和目的基因)的配對，而不是分子內(nèi)配對。
[0017]如果載體是蛋白表達載體，那么，目的基因上游單鏈區(qū)起到連接目的基因和載體表達框架的作用，單鏈區(qū)DNA序列也會最終翻譯成蛋白序列中的一段短肽。當目的基因上游的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.1所示，與其互補配對的載體的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.2所示時，單鏈區(qū)與載體表達框架對齊，這段單鏈區(qū)用到了 GGC、CGC、GAA、CAG這4種密碼子，在常見的表達宿主中，都是常見密碼子，非稀有密碼子。所翻譯的短肽，不會影響目的蛋白的活性。
[0018]使用上述互補配對的單鏈末端，在無需連接酶存在的情況下，可以實現(xiàn)目的基因和載體的連接，能夠獲得不低于80%的陽性重組克隆，市面上其它同類技術(shù)或產(chǎn)品無法達到此效果。如果載體是蛋白表達載體，則本發(fā)明能夠使插入基因?qū)?yīng)的目的蛋白順利表達。
[0019]與現(xiàn)有的連接技術(shù)相比，本發(fā)明提高了重組克隆中的陽性概率，減少了分子克隆實驗所需的時間，簡化了流程，本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比有顯著進步。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖。其中，左側(cè)泳道是DNA分子量標準，右側(cè)是PCR擴增產(chǎn)物。
[0021]圖2菌落PCR驗證電泳圖。其中左側(cè)marker泳道是DNA分子量標準，1#和2#均為平板上隨機挑取的重組子的PCR擴增產(chǎn)物。
[0022]圖3菌落PCR驗證電泳圖。最左側(cè)泳道是DNA分子量標準，其余各泳道均為隨機挑取的各個單克隆的PCR擴增產(chǎn)物。
圖4 SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達；其中I為實驗組，2為對照組，可見實驗組在蛋白marker的116KDa和97.2KDa這個區(qū)間，有一條很濃的蛋白條帶，而對照組沒有，可以判定目的蛋白成功表達。
[0023]圖5 SEQ ID N0.1 二級結(jié)構(gòu)圖。
[0024]圖6 SEQ ID N0.2 二級結(jié)構(gòu)圖。
[0025]圖7 SEQ ID N0.4 二級結(jié)構(gòu)圖。
【具體實施方式】
[0026]實施例1
以pTwinl載體(本實驗室保存，原 始來源是neb公司)為例，根據(jù)其DNA序列，設(shè)計以下2條PCR引物:
載體上游引物:5 ’ CCGAGCTCCGGGCTTCTCCTCATTGTGGCAGCTTCAATGACTGCAG 3，，
載體下游引物:5’ CCGAGCTCTGCTGTTCGCGGCCATTGTGTACAATGATGTCATTCGC 3’。
[0027]引物的5’端設(shè)計有Sac I限制性內(nèi)切酶酶切位點，如下劃線所示，并帶有保護堿基。Sac I酶切位點是優(yōu)選設(shè)計的，載體內(nèi)部沒有這個酶切位點，同時，酶切后，載體能形成3’單鏈末端,能夠讓后續(xù)的T4 DNA polymerase攻擊切除多余序列。最終形成所需的5’單鏈末端序列。
[0028]使用Toyobo公司的KOD plus neo酶進行PCR反應(yīng)。
[0029]PCR 反應(yīng)液:10X PCR buffer for KOD-plus-neo:5 μ I, 2mM dNTPs 5 μ I, 25mMMgSO4 3 μ I,引物:上下游各 1.5 μ I,模板:50ng, KOD-plus-neo (IU/ μ I):1 μ I, ddH20:upto 50 μ I。
[0030]PCR 循環(huán)條件:94°C，2min ;(98°C、10s，57°C、30s，68t:、4min)X 30 cycles ；68°C7min ；4°C End。
[0031 ] PCR擴增產(chǎn)物電泳圖見圖1。
[0032]對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，對目的條帶割膠，采用上海生工SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進行DNA回收(按照試劑盒說明書操作)。
[0033]回收產(chǎn)物使用Thermo Scientific FastDigest SacI內(nèi)切酶進行酶切處理。
[0034]酶切反應(yīng)液:10XFastDigest Buffer 2μ I, DNA 回收產(chǎn)物 2 μ g, FastDigestSacI I μ I, ddH20 up to 30 μ I。
[0035]酶切步驟:混勻酶切反應(yīng)液，于37°C反應(yīng)I小時，之后置于65°C熱擊5分鐘，使酶失活。
[0036]酶切產(chǎn)物使用上海生工SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進行純化，回收產(chǎn)物(按照試劑盒說明書操作)。
[0037]酶切回收產(chǎn)物使用NEB公司快速連接試劑盒進行DNA連接，連接產(chǎn)物直接42°C熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLl-blue化學感受態(tài)細胞，并涂布于帶有氨芐抗生素的LB瓊脂平板。
[0038]上述平板在37°C過夜培養(yǎng)后，在平板上挑取大腸桿菌單菌落，使用菌落PCR驗證重組質(zhì)粒是否正確(所使用引物為T7通用上游引物和下游引物)。正確的重組子將能擴增出約900bp的DNA片段。電泳圖見圖2。
[0039]將上圖2中1#樣品，使用T7通用上游引物，Sanger法(ABI測序儀)進行DNA測序，序列如下:
【權(quán)利要求】
1.一種用于DNA分子克隆方法的目的基因及載體，其特征在于:所述目的基因上游的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.1所示，與其互補配對的載體的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.2所示，或者目的基因上游的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.2所示，與其互補配對的載體的單鏈區(qū)如SEQ ID N0.1所示；目的基因下游單鏈區(qū)如SEQ ID N0.3所示，與其互補配對的載體的單鏈區(qū)為如SEQ IDN0.4所示，或者目的基因下游單鏈區(qū)如SEQ ID N0.4所示，與其互補配對的載體的單鏈區(qū)為如 SEQ ID N0.3 所示。
2.—種DNA分子克隆方法，其特征在于:制備在上、下游均具有5’單鏈末端的載體和目的基因；載體和目的基因的單鏈末端能夠互補配對，無需連接酶，在體外將載體和目的基因混合，二者的末端互補配對，連接重組成閉合環(huán)狀DNA，然后直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，在細胞內(nèi)擴增重組DNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種DNA分子克隆方法，其特征在于:其包括T4DNApolymerase 反應(yīng)液體系:回收產(chǎn)物 0.2pmol,10X T4 DNA polymerase buffer 5 μ I, IOOmMdTTP 1.5μ 1,0.1% BSA 5 μ 1，ddH20 補足至 50 μ I ;70°C 保溫 5min,降溫到 37°C，加入 T4DNA polymerase I μ I,用移液器吸頭攪動混合,不可劇烈振動；37°C保溫IOmin ,使用鏇潤震蕩器震蕩，使酶滅活。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種DNA分子克隆方法，其特征在于:其無連接酶的連接反應(yīng)體系為載體3μ1，插入片段6 4 1，步驟為混勻載體和插入片段，221:保溫51^11，再加入25mM EDTA 3 μ 1，22°C保溫5min，攪動混勻，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于帶有氨芐青霉素抗性的LB平板上。
【文檔編號】C12N15/63GK103805600SQ201410080024
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】林峻 申請人:福州大學