類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測引物和檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測類鼻疽伯克霍爾德菌的引物及檢測方法。本發(fā)明提供的類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測引物，包括一對內(nèi)引物、一對外引物和一條環(huán)引物。其中，所述的一對內(nèi)引物的序列如SEQ?ID?NO1和SEQ?ID?NO2所示，所述的一對外引物的序列如SEQ?ID?NO3和SEQ?ID?NO4所示，所述的一條環(huán)引物的序列如SEQ?ID?NO5所示。利用本發(fā)明對類鼻疽伯克霍爾德菌進(jìn)行檢測具有敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測快速、操作簡便、不需要特殊設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】類鼻疸伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測引物和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物細(xì)菌的檢測技術(shù)范圍，具體涉及類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測引物和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification,簡稱LAMP)是針對靶序列上6個(gè)特異性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)2對特殊的引物，及I條加快反應(yīng)速度的環(huán)引物，并通過具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增DNA的新技術(shù)。擴(kuò)增產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜樣結(jié)構(gòu)的DNA片段的混合物?，F(xiàn)已有技術(shù)將LAMP應(yīng)用于巨細(xì)胞病毒，分枝桿菌，沙門菌，巴西副球孢子菌，非洲錐體蟲等的檢測。其特異性和高效性的關(guān)鍵在于靶基因的選擇和引物的設(shè)計(jì)。
[0003]類鼻疽伯克霍爾德菌是類鼻疽病的病原菌，常見于熱帶地區(qū)，該菌也可被利用作為生物武器。類鼻疽病因其臨床表現(xiàn)紛繁復(fù)雜，癥狀不典型而極難診斷，尤其是因其能形成膿腫樣病變易被誤診為結(jié)核病。病原學(xué)檢查是診斷類鼻疽病的關(guān)鍵，但目前類鼻疽伯克霍爾德菌的通用鑒定方法較為局限，多為培養(yǎng)后根據(jù)生化反應(yīng)鑒定，存在一定的誤檢定率，而且病原菌培養(yǎng)與鑒定需時(shí)較長，不能滿足臨床早期診斷和治療的需要。特別是當(dāng)其作為生物武器導(dǎo)致人群感染時(shí)，更需要早期識別。盡管國外已有利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測類鼻疽伯克霍爾德菌的文獻(xiàn)報(bào)道(Journal ofClinical Microbiology2008,46:568-573),但作者本人也認(rèn)為檢測的速度、敏感性和特異性都不盡滿意。該文作者采用LAMP方法從標(biāo)本中檢測類鼻疽伯克霍爾德菌的最佳條件是65°C，90分鐘，檢測敏感性是44%，特異性為98.4%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測引物和檢測方法。
[0005]本發(fā)明提供的類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測引物，包括一對內(nèi)引物、一對外引物和一條環(huán)引物，其中，所述的一對內(nèi)引物的序列如SEQ ID NOl和SEQ IDN02所示，所述的一對外引物的序列如SEQ ID N03和SEQ ID N04所示，所述的一條環(huán)引物的序列如SEQ ID N05所示。
[0006]本發(fā)明提供的類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測方法，其特征在于，對待檢測樣品經(jīng)過培養(yǎng)后提取DNA，得DNA模板，利用所述的類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，然后進(jìn)行判讀。
[0007]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中混合引物SEQ ID NOl~5各序列的摩爾比優(yōu)選為為8: 8:1:1: 4。
[0008]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的優(yōu)選反應(yīng)體系組成如下:2X反應(yīng)溶液(來自Loopamp的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒)12.5 μ 1，10 μ M的SEQ ID NOl和2混合液4 μ 1，10 μ M 的 SEQ ID Ν03 和 4 的混合液 0.5 μ I，10 μ M 的 SEQ ID Ν052 μ I, DNA 模板 2 μ I，BstDNA聚合酶I μ 1，用水補(bǔ)足至25 μ I。
[0009]能夠通過濁度或根據(jù)加入熒光目視檢測試劑鈣黃綠素后反應(yīng)的顏色進(jìn)行判讀
[0010]利用本發(fā)明對類鼻疽伯克霍爾德菌進(jìn)行檢測具有敏感性高、特異性強(qiáng)、檢測快速、操作簡便、不需要特殊設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明的檢測方法的最佳反應(yīng)溫度試驗(yàn)曲線；
[0012]圖2為本發(fā)明的檢測方法的敏感性試驗(yàn)曲線；
[0013]圖3為本發(fā)明的檢測方法的特異性試驗(yàn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0014]本發(fā)明關(guān)鍵在于靶基因選擇及引物設(shè)計(jì)。本發(fā)明的發(fā)明人選擇類鼻疽伯克霍爾德菌III型分泌系統(tǒng)基因序列中的TTSl的一段特殊序列orf2作為靶基因，在GenBank中查詢比對后確定其為類鼻疽伯克霍爾德菌所特有。針對此序列，采用primerexplorer V4軟件，進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。通過大量的對比分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。最終獲得以下內(nèi)、外引物各I對和環(huán)引物I條，引物序列為:
[0015]SEQ ID NOl:5’ -TGCACACCGGTCAGTATCCGTA-TCCGGAATCTGGATCACCA-3’ ；
[0016]SEQ ID N02:5’ -GGCGCGCAGTTGCAGCTT-CGGTCAAGCGGATGTCG-3’ ；
[0017]SEQ ID N03:5’ -CTGTCGAGC`AATCGGCG-3’ ；
[0018]SEQ ID N04:5’ -GCAGAAGATCGGAGGCATG-3’ ；
[0019]SEQ ID N05:5’ -ATTCCAGGGCAAGGACGG-3’。
[0020]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，使用該組引物檢測類鼻疽伯克霍爾德菌的特異性和敏感性均較好。
[0021]下面通過【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明提供的類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測方法做進(jìn)一步說明。
[0022]1.實(shí)驗(yàn)材料
[0023](I)實(shí)驗(yàn)菌株的選擇
[0024]實(shí)驗(yàn)菌株采用已知經(jīng)測序確認(rèn)的類鼻疽伯克霍爾德菌臨床菌株及經(jīng)常規(guī)鑒定的其他細(xì)菌(包括:洋蔥伯克霍爾德菌，銅綠假單胞菌，嗜麥芽窄食單胞菌，結(jié)核分枝桿菌，布魯桿菌，大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，鮑曼不動桿菌，肺炎克雷伯菌，白念珠菌)。
[0025](2)試劑采購
[0026]Loopamp環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒(由Bst DNA聚合酶以及反應(yīng)混合液構(gòu))和鈣黃綠素?zé)晒馊玖?熒光目視檢測試劑)購自日本榮研株式會社，引物的合成由生工生物工程有限公司完成。
[0027]2.DNA 提取
[0028]可以采取簡易法和試劑盒法，主要區(qū)別是試劑盒法更快捷。后面的效果說明中，如果未加特別說明，DNA提取采用試劑盒法。
[0029]簡易法:對于純菌(已知類鼻疽伯克霍爾德菌經(jīng)常規(guī)鑒定和測序確定的臨床分離菌株)，將新鮮培養(yǎng)的待檢菌用生理鹽水制成菌懸液，100°c煮沸10分鐘，提取上清液，-20°c保存留用。(注意:在生物安全柜中操作！)
[0030]試劑盒法:米用Wizard genomic DNApurification kit (promega 公司)，按照廠家的操作說明書提取DNA。
[0031]3.LAMP 步驟
[0032](I)引物配制:將新合成的所有引物先溶解并配制為100 μ M的保存液，再將SEQID NOl和2，SEQ ID Ν03和4，以及SEQ ID Ν05分別配制為10 μ M的使用液。
[0033](2)反應(yīng)體系:反應(yīng)體系總計(jì)25μ I。包括:12.5 μ I的反應(yīng)混合液，4μ 110 μ M的SEQ ID NOl 和 2 的混合液，0.5 μ 110 μ M SEQ ID N03 和 4 的混合液，2 μ IlO μ M 的 SEQ IDΝ05,1 μ I Bst DNA 聚合酶，2 μ I DNA 模板，加 3μ I Η20 至 25μ I。
[0034](3)在反應(yīng)管中加入鈣黃綠素指示劑I μ I。
[0035]⑷LAMP反應(yīng):①將內(nèi)含25 μ I反應(yīng)體系的反應(yīng)管于65°C恒溫模塊加熱30~60分鐘然后再加熱至95°C 2分鐘，將bstDNA聚合酶滅活以終止反應(yīng)。
[0036](5)結(jié)果判讀:由于LAMP反應(yīng)中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物一白色焦磷酸鎂沉淀，通過以下方法進(jìn)行結(jié)果判讀:①肉眼觀察濁度:反應(yīng)后管內(nèi)清澈透明者為陰性，管內(nèi)混濁或有白色沉淀者為陽性；②反應(yīng)管中指示劑顏色變化:顏色仍為黃色為陰性，由橙黃色變?yōu)榫G色為反應(yīng)陽性。
[0037]該方法具有以下優(yōu)點(diǎn)
[0038](I)反應(yīng)溫度恒定，所需儀器簡單:由于反應(yīng)可以在恒定的溫度條件下進(jìn)行，不需變換不同的溫度，所需儀器 設(shè)備簡單，僅需一恒溫加熱模塊或一臺恒溫水浴箱即可。如圖1所示，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)物的濁度。選取60°C，63°C，65 °C，67°C，68°C和69°C四個(gè)溫度，對類鼻疽伯克霍爾德菌進(jìn)行擴(kuò)增以確定最佳反應(yīng)溫度。當(dāng)濁度> 0.1時(shí)即能判定為擴(kuò)增反應(yīng)陽性。從實(shí)時(shí)濁度曲線圖可看出，在60°C~69°C的范圍內(nèi)，反應(yīng)都能進(jìn)行，但在63°C~68°C間，結(jié)果在25min內(nèi)可判為陽性(65°C左右為最佳反應(yīng)溫度)，而當(dāng)溫度為60°C和69°C時(shí)，結(jié)果需要在25min后才能判為陽性。
[0039](2)敏感性高:如圖2所示，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)物的濁度。將采用試劑盒法提取的類鼻疽伯克霍爾德菌的DNA模板首先進(jìn)行紫外分光光度法定量，然后進(jìn)行稀釋和等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。從該實(shí)時(shí)濁度曲線圖可以看出，按照試劑盒法提取待測菌DNA，使其在終反應(yīng)體系中具有0.1ng的DNA量即可獲得陽性檢測結(jié)果。
[0040](3)特異性強(qiáng):如圖3所示，橫坐標(biāo)為時(shí)間，縱坐標(biāo)為擴(kuò)增反應(yīng)中產(chǎn)物的濁度。將建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測包括類鼻疽伯克霍爾德菌在內(nèi)的其他常見致病菌。陽性對照為用試劑盒提取的已知濃度的類鼻疽伯克霍爾德菌DNA模板。用煮沸法提取以下待測菌的DNA模板:類鼻疽伯克霍爾德菌、洋蔥伯克霍爾德菌，銅綠假單胞菌，大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，白念珠菌，布魯桿菌，結(jié)核分枝桿菌，鮑曼不動桿菌，嗜麥芽窄食單胞菌。平行進(jìn)行擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。圖中顯示，陽性對照和煮沸法的類鼻疽伯克霍爾德菌DNA能進(jìn)行有效擴(kuò)增，均在25分鐘內(nèi)出現(xiàn)陽性，而其他菌及無菌水陰性對照的濁度值均未達(dá)到陽性判定的標(biāo)準(zhǔn)，證明本方法檢測類鼻疽伯克霍爾德菌的特異性極佳。
[0041](4)快速檢測:采用本發(fā)明的引物和實(shí)驗(yàn)方法可以在30分鐘內(nèi)獲得環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的最高擴(kuò)增反應(yīng)，自簡易法通過煮沸從純菌落提取DNA至結(jié)果判讀只需大約I小時(shí)時(shí)間，與培養(yǎng)鑒定法(至少需時(shí)24小時(shí))比較，大大縮短了明確病原菌種類的時(shí)間。
[0042]需要說明的是，①由于敏感性極高，要確保操作規(guī)范，防止污染，以避免結(jié)果發(fā)生假陽性；②從臨床標(biāo)本中直接提取DNA進(jìn)行類鼻疽伯克霍爾德菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增需要對標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理。
[0043]本發(fā)明的效果還得到了臨床病例的驗(yàn)證，下面列表說明。
[0044]LAMP擴(kuò)增法檢測的類鼻疽伯克霍爾德菌感染病例
【權(quán)利要求】
1.類鼻疽伯克霍爾德菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測引物，包括一對內(nèi)引物、一對外引物和一條環(huán)引物，其特征在于，所述的一對內(nèi)引物的序列如SEQ ID NOl和SEQ ID N02所示，所述的一對外引物的序列如SEQ ID N03和SEQ ID N04所示，所述的一條環(huán)引物的序列如SEQ ID N05所示。
2.類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測方法，其特征在于，對待檢測樣品經(jīng)過培養(yǎng)后提取DNA，得DNA模板，利用權(quán)利要求1所述的類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測引物進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，然后進(jìn)行判讀。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測方法，其特征在于，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中SEQ ID NOl~5各引物的濃度比例為8: 8:1:1: 4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測方法，其特征在于，在25 μ I的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)體系中含如下成分:來自Loopamp的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法脫氧核糖核酸擴(kuò)增試劑盒的2Χ反應(yīng)溶液12.5 μ 1，10 μ M的SEQ ID NOl和2混合液4 μ I，10 μ M 的 SEQ ID Ν03 和 4 的混合液 0.5 μ I，10 μ M 的 SEQ ID Ν052 μ I 以及 DNA 模板2μ 1，Bst DNA 聚合酶 I μ 1，3 μ I 水補(bǔ)足至 25 μ I。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的類鼻疽伯克霍爾德菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的快速檢測方法，其特征在于，通過濁度或根據(jù)加入熒光目視檢`測試劑鈣黃綠素后反應(yīng)的顏色進(jìn)行判讀。
【文檔編號】C12Q1/04GK103866014SQ201410080990
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】沈定霞, 李東冬, 王凱飛, 匡慧慧 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院