一株具有同步反硝化脫氮除磷功能的兼性反硝化除磷菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程、環(huán)境工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一株具有同步反硝化脫氮和除磷功能的兼性反硝化除磷菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的BacillusCereusP1K菌株已于2013年12月2日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC?NO：M2013625。該菌株在缺氧條件下可同步進(jìn)行反硝化脫氮和除磷，其反硝化能力和過量吸磷能力都較高，可以減少菌體對(duì)碳源和氧氣的消耗和利用，非常適合應(yīng)用于有機(jī)物含量較低的城市污水處理中，無需投加碳源，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉且相對(duì)安全，有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。
【專利說明】一株具有同步反硝化脫氮除磷功能的兼性反硝化除磷菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程、環(huán)境工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株具有同步反硝化脫氮除磷功能的兼性反硝化除磷菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水體中適量的氮、磷元素是合成藻類等微生物的基本元素，是形成水生生態(tài)環(huán)境重要的物質(zhì)條件，也是水環(huán)境良性循環(huán)的基礎(chǔ)。但目前我國(guó)一些水體中氮和磷的含量已超過水體容量，過量的氮磷元素會(huì)導(dǎo)致水體藻類等生物異常增殖，引起水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象和水質(zhì)惡化。從水體生態(tài)系統(tǒng)全面健康發(fā)展的角度來看，當(dāng)前我國(guó)環(huán)境問題的主要矛盾已經(jīng)開始由COD逐漸轉(zhuǎn)向氮、磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的去除上來；同時(shí)，受納水體的嚴(yán)重污染也已危及到人體的健康。因此，如何控制水體中氮磷元素的污染及對(duì)含氮磷廢水的治理，已成為目前我國(guó)水污染防治中的重大問題。目前，我國(guó)已開始執(zhí)行《城市污水處理廠污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB18918-2002)—級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)(氨氮< 5mg/L，總氮< 15mg/L，總磷< lmg/L)，城市污水處理的重點(diǎn)目標(biāo)已經(jīng)轉(zhuǎn)向氮磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的去除。同時(shí)，根據(jù)最新修改的《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定:排入重點(diǎn)流域的城鎮(zhèn)污水處理廠出水水質(zhì)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)由原有的一級(jí)B標(biāo)準(zhǔn)提升到一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)，這對(duì)我國(guó)新建和已建的污水處理廠都提出了對(duì)污水進(jìn)行深度脫氮除磷技術(shù)的需求。因此，研究開發(fā)高效經(jīng)濟(jì)的脫氮除磷的方法和技術(shù)已成為當(dāng)前水污染控制領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。
[0003]相比于傳統(tǒng)的化學(xué)脫氮除磷技術(shù)，生物脫氮除磷技術(shù)由于其具有運(yùn)行成本小、無二次污染和處理效果好等優(yōu)勢(shì)，已成為脫氮除磷技術(shù)發(fā)展的主要趨勢(shì)。傳統(tǒng)生物脫氮除磷是將生物脫氮和生物除磷分為2個(gè)獨(dú)立的步驟進(jìn)行，其工藝和技術(shù)存在著一些弊端，如反硝化菌和除磷菌對(duì)碳源的競(jìng)爭(zhēng)、污泥產(chǎn)量高、能耗高等。同步反硝化除磷理論和技術(shù)的出現(xiàn)給我們提供了全新的思路和視角。與傳統(tǒng)專性好氧菌的除磷工藝相比，同步反硝化除磷技術(shù)能節(jié)省50%的COD和30%的耗氧量，相應(yīng)減少剩余污泥量50%。因此，同步反硝化除磷技術(shù)被視為可持續(xù)的處理工藝。
[0004]同步反硝化脫氮除磷技術(shù)利用反硝化除磷菌在缺氧條件下，以硝酸鹽為電子受體，同步完成反硝化(脫氮)和過量攝磷(除磷)過程，從而將反硝化脫氮和生物除磷這兩個(gè)原本認(rèn)為彼此獨(dú)立的過程合二為一，使氧的消耗和對(duì)碳源的需求均得到相應(yīng)節(jié)省。因此，同步反硝化除磷菌在水體脫氮除磷領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一株具有同步反硝化脫氮除磷功能的兼性反硝化除磷菌及其應(yīng)用。本發(fā)明篩選得到的反硝化除磷菌，其在兼性環(huán)境下可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)硝酸鹽或亞硝酸鹽的還原和對(duì)磷的吸收，能有效去除廢水中的氮和磷，有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:一株具有同步反硝化脫氮除磷功能的兼性反硝化除磷菌，該菌株命名為Cereus PlK,已于2013年12月2日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)，保藏單位地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為=CCTCC NO:M2013625o
[0007]上述菌株Bacillus Cereus PlK屬于芽抱桿菌屬{Bacillus sp.),寬度為1.(Tl.2 μ m,長(zhǎng)度為3.0-5.0 μ m。其生理生化鑒定結(jié)果:革蘭氏染色陽性，異染顆粒染色陽性，PHB顆粒染色陽性，淀粉水解陽性，葡萄糖氧化發(fā)酵陽性，產(chǎn)吲哚陽性，明膠液化陽性，接觸酶陽性，氧化酶陰性，M.R.陰性，V.P.陽性，檸檬酸鹽利用陽性，硝酸鹽還原陽性；菌體桿狀，內(nèi)生孢子，鞭毛側(cè)生，運(yùn)動(dòng)；在空氣中的固體培養(yǎng)基表面上生長(zhǎng)良好；最適生長(zhǎng)溫度約為30°C，在10°C以下和45°C以上不生長(zhǎng)；菌株feci77心Cereus PlK在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落形態(tài)為:白色，圓形，表面光滑，邊緣整齊，菌落較分散。
[0008]上述菌株Cereus PlK的16S rRNA基因序列特征為:16S rRNA基因序列長(zhǎng)度為1519bp，通過程序進(jìn)行同源性比較，表明與蠟樣芽孢桿菌sp.)的親緣關(guān)系最接近，具有99%的相似性，屬于芽孢桿菌屬。同時(shí)對(duì)菌株Cereus PlK進(jìn)行反硝化功能基因(亞硝酸鹽還原酶基因nirS、的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果呈陽性，從分子生物學(xué)角度確認(rèn)菌株Cereus PlK具有反硝化功能。
[0009]本發(fā)明菌株Cereus PlK在厭氧160min/好氧180min的SBR反應(yīng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明:厭氧結(jié)束時(shí)釋磷量為13mg/L左右，好氧結(jié)束時(shí)對(duì)磷酸鹽去除率可達(dá)93.8%ο菌株Cereus PlK在厭氧160min/缺氧180min的SBR反應(yīng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明:厭氧結(jié)束時(shí)釋磷量為13mg/L左右，缺氧結(jié)束時(shí)對(duì)磷酸鹽去除率可達(dá)70%，硝酸鹽去除率達(dá)90.5%。因此證明該菌株Cereus PlK能在好氧條件下以氧為電子受體進(jìn)行過量吸磷，在缺氧條件下以硝酸鹽氮為電子受體進(jìn)行過量吸磷。表明本發(fā)明菌IB— Cereus PlK為具有同步反硝化脫氮和除磷功能的兼性反硝化除磷菌，且反硝化能力和過量吸磷能力都較高。因此，本發(fā)明菌株Cereus PlK可應(yīng)用于污水生物脫氮除磷工藝，將其應(yīng)用于污水處理，可以實(shí)現(xiàn)同步反硝化脫氮和脫磷的目標(biāo)。
[0010]菌株feci77i/5.Cereus PlK是從實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定運(yùn)行的厭氧/好氧/缺氧SBR反應(yīng)器中的活性污泥中分離篩選得到，具體的篩選方法為:
(I)首先，取IOmL活性污泥至裝有90mL無菌水的三角瓶中，加入無菌玻璃珠，將三角瓶放入搖床中充分振蕩，使細(xì)菌呈單細(xì)胞狀態(tài)分散于水中；然后，從三角瓶?jī)?nèi)的污泥菌懸液中取ImL懸液接入裝有9mL無菌水的試管內(nèi)，得到KT1梯度的菌懸液，繼續(xù)此步驟，依次得到10_2、10_3、10_4……10_7梯度的菌懸液，各取ImL水樣放入培養(yǎng)皿種，待富磷培養(yǎng)基快凝卻時(shí)倒入培養(yǎng)皿中，混勻，待培養(yǎng)基凝固后倒置培養(yǎng)皿于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3天后，挑選一個(gè)合適梯度的培養(yǎng)皿，然后分別選取不同形態(tài)、菌落清晰的典型菌落，標(biāo)記并挑取單個(gè)菌落在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線分離，重復(fù)3~4次至菌落特征一致的單菌落，最后挑取單一菌落，轉(zhuǎn)接到準(zhǔn)備好的試管斜面上。
[0011](2)將步驟(1)己分離出來的菌株先在缺磷培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧富集培養(yǎng)24h，以盡量耗盡菌體內(nèi)的PHB顆粒，然后將富集培養(yǎng)好的菌液離心，用無菌蒸餾水洗滌，再離心，取菌沉淀投入到富磷培養(yǎng)基中進(jìn)行吸磷試驗(yàn)，期間定時(shí)取培養(yǎng)液，檢測(cè)培養(yǎng)液中Ρ0/—-Ρ濃度的變化，初步篩選出吸磷效果好的菌株；然后將其接種到硝酸鹽還原培養(yǎng)基，進(jìn)行硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)的復(fù)篩，以考察其是否具有反硝化功能，取除磷效率高且具有硝酸鹽還原產(chǎn)氣能力的菌株，篩選得到本發(fā)明所述的反硝化除磷菌Cereus P1K。
[0012]上述缺磷培養(yǎng)基為=CH3COONa.3H20, 3.23g/L ；Na2HPO4.2H20, 23mg/L ；NH4Cl,152.8mg/L ；MgS04.7H20，81.12mg/L ；K2S04, 17.83 mg/L ；CaCl2.2H20，llmg/L ；HEPESbuffer, 7g/L ;微量元素液，2mL/L ；pH, 7.2。
[0013]上述富磷培養(yǎng)基為:CH3C00Na.3H20, 3.23g/L ；KH2PO4, 35mg/L ；NH4Cl，305.52mg/L ；MgSO4.7H20，91.26mg/L ；CaCl2.2H20, 25.68mg/L ；PIPES buffer, 8.5g/L ;微量元素液，2mL/L ； pH, 7.2。
[0014]其中微量元素液:EDTA，50g/L、FeSO4.7H20，5g/L、CuSO4.5H20，1.6g/L、MnCl2.4H20，5g/L、(NH4)6Mo7SO24.4Η20，1.lg/L、H3B03，50mg/L、KI，10mg/L、CoCl2 *6H20,50mg/
L0
[0015]上述硝酸鹽還原培養(yǎng)基:牛肉膏，3g/L ;蛋白胨，5g/L ；KN03, lg/L ;pH，7.4。
[0016]本發(fā)明篩選得到的反硝化除磷菌Cereus PlK在好氧或缺氧條件下對(duì)磷酸鹽具有降解能力，且在缺氧條件下可同步進(jìn)行反硝化脫氮和除磷，與傳統(tǒng)反硝化菌和除磷菌相比，減少了對(duì)碳源和氧氣的消耗和利用。因此，該菌株非常適合應(yīng)用于有機(jī)物含量較低的城市污水處理中，無需投加碳源，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉且相對(duì)安全，有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本發(fā)明反硝化除磷菌Cereus PlK的透射電鏡照片。
[0018]圖2是本發(fā)明反硝化除磷菌Cereus PlK的16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0019]圖3是本發(fā)明反硝化除磷菌Cereus PlK在培養(yǎng)過程中的生長(zhǎng)變化曲線。
[0020]圖4是本發(fā)明反硝化除磷菌Cereus PlK在厭氧/好氧SBR反應(yīng)器中磷變化曲線。
[0021]圖5是本發(fā)明反硝化除磷菌feci77i/5.Cereus PlK在厭氧/缺氧SBR反應(yīng)器中氮磷變化曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例1:菌株的分離、篩選和鑒定 (O菌株的分離、純化
取IOmL實(shí)驗(yàn)室穩(wěn)定運(yùn)行的厭氧/好氧/缺氧SBR反應(yīng)器中的活性污泥，將活性污泥放入裝有90mL無菌水的三角瓶中，加入無菌玻璃珠，將三角瓶放入搖床中充分振蕩，使細(xì)菌呈單細(xì)胞狀態(tài)分散于水中；然后，從三角瓶?jī)?nèi)的污泥菌懸液中取ImL懸液接入裝有9mL無菌水的試管內(nèi)，得到KT1梯度的菌懸液，繼續(xù)此步驟，依次得到10_2、10_3、10_4……10_7梯度的菌懸液，各取ImL水樣放入培養(yǎng)皿種，待富磷瓊脂培養(yǎng)基快凝卻時(shí)倒入培養(yǎng)皿中，混勻，待培養(yǎng)基凝固后倒置培養(yǎng)皿于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3天后,挑選一個(gè)合適梯度的培養(yǎng)M ;分別選取不同形態(tài)、菌落清晰的典型菌落，標(biāo)記并挑取單個(gè)菌落在平板培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線分離，重復(fù)3~4次至菌落特征一致的單菌落，最后挑取單一菌落，轉(zhuǎn)接到準(zhǔn)備好的試管斜面上以備用，所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。
[0023] (2)菌株的篩選將步驟(1)己分離出來的各菌株進(jìn)行富集培養(yǎng):將菌株在缺磷培養(yǎng)基中30°c厭氧(充氮?dú)?培養(yǎng)24h，搖床轉(zhuǎn)速為140rpm，以盡量耗盡菌體內(nèi)的PHB顆粒，然后將該菌液離心(8，OOOrpm, 8min),無菌蒸懼水洗漆，再離心(8，OOOrpm, 8min),留取菌沉淀，整個(gè)過程均需在無菌條件下進(jìn)行；
將菌沉淀投入到富磷培養(yǎng)基中進(jìn)行吸磷試驗(yàn)，搖床轉(zhuǎn)速140rpm，溫度30°C，期間定時(shí)取培養(yǎng)液，經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾后，檢測(cè)濾液中Ρ043_-Ρ濃度的變化，初步篩選出培養(yǎng)時(shí)間短，除磷效率高的菌株；
硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn):取上述初篩的菌株，接種在帶杜氏小管的硝酸鹽還原培養(yǎng)基中，每個(gè)菌株作2個(gè)平行試驗(yàn)，同時(shí)另外留2管不接種作為對(duì)照，30°C恒溫培養(yǎng)，分別在I天、3天、5天后檢測(cè)結(jié)果:檢查杜氏小管內(nèi)是否產(chǎn)氣，如有氣泡表明有氮?dú)猱a(chǎn)生；在比色瓷盤中加入少量培養(yǎng)液，滴入I~2滴格里斯試劑A液(對(duì)氨基苯磺酸，0.5g ;體積濃度為10%左右的稀醋酸，150mL)和B液(α -苯胺，0.1g ;體積濃度為10%左右的稀醋酸，150mL ；H20,20mL),在對(duì)照管中同樣加入A液和B液各I~2滴，判斷結(jié)果:若溶液變?yōu)榧t色，橙色，或棕色等，表示有亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性；如無紅色、橙色，或棕色等出現(xiàn)則可加入I~2滴二苯胺試劑(0.5g 二苯胺溶于IOOmL濃H2SO4,并加20mL蒸餾水稀釋，存于棕色瓶中)，如不呈藍(lán)色反應(yīng)，則仍為陽性反應(yīng)；若呈藍(lán)色反應(yīng)，則為陰性反應(yīng)，表明其對(duì)應(yīng)的菌株具有硝酸鹽還原產(chǎn)氣能力。取除磷效率高且具有硝酸鹽還原產(chǎn)氣能力的菌株即為篩選得到的反硝化除磷菌ifeciJJiAs Cereus P1K。 [0024]在菌株的分離和篩選過程中所用到的培養(yǎng)基有:
缺磷培養(yǎng)基:CH3C00Na.3Η20，3.23g/L ；Na2HP04.2H20，23mg/L ；NH4Cl, 152.8mg/L ；MgSO4 *7H20,81.12mg/L ；K2SO4,17.83 mg/L ；CaCl2.2Η20，llmg/L ；HEPES buffer, 7g/L ;微量元素液，2mL/L ；pH, 7.2。
[0025]富磷培養(yǎng)基:CH3COONa.3Η20，3.23g/L ;KH2P04，35mg/L ;NH4C1，305.52mg/L ;MgSO4.7H20，91.26mg/L ；CaCl2.2H20, 25.68mg/L ；PIPES buffer, 8.5g/L ;微量元素液，2mL/L ； pH, 7.2。
[0026]微量元素液:EDTA,50g/L、FeSO4.7H20, 5g/L、CuSO4.5H20,1.6g/L、MnCl2.4H20,5g/L、(NH4) 6Mo7S024.4H20,1.lg/L、H3BO3, 50mg/L、KI，10mg/L、CoCl2.6H20，50mg/L。
[0027]硝酸鹽還原培養(yǎng)基:牛肉膏，3g/L ;蛋白胨，5g/L ；KN03, lg/L ;pH，7.4。
[0028]上述培養(yǎng)基如制成瓊脂培養(yǎng)基，則添加瓊脂1.5% (w/v),使用前均在121°C下滅菌20 min0
[0029]( 3 )菌種的生理生化特征
篩選得到的反硝化除磷菌Cereus PlK屬于芽孢桿菌屬sp.),其透射電鏡照片見圖1，菌體寬度為1.0~1.211111，長(zhǎng)度為3.0~5.(^111。參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)反硝化除磷菌進(jìn)行生理生化鑒定:革蘭氏染色陽性，異染顆粒染色陽性，PHB顆粒染色陽性，淀粉水解陽性，葡萄糖氧化發(fā)酵陽性，產(chǎn)吲哚陽性，明膠液化陽性，接觸酶陽性，氧化酶陰性，M.R.陰性，V.P.陽性，檸檬酸鹽利用陽性，硝酸鹽還原陽性；菌體桿狀，內(nèi)生孢子，鞭毛側(cè)生，運(yùn)動(dòng)；在空氣中的固體培養(yǎng)基表面上生長(zhǎng)良好；最適生長(zhǎng)溫度約為30°C，在10°C以下和45°C以上不生長(zhǎng)；反硝化除磷菌在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落為白色，圓形，表面光滑，邊緣整齊，菌落較分散。[0030](4)菌株的16S rRNA序列測(cè)定及發(fā)育分析
將菌株也Cereus PlK接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h (140rpm，30°C )以獲得足夠的菌量，采用細(xì)菌基因組DNA (小量)抽提試劑盒提取細(xì)菌基因組總DNA，以細(xì)菌基因組總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。
[0031]PCR 擴(kuò)增所用引物為:BSF08 (5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和 BSR1541(5，-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’);PCR 反應(yīng)體系(25 μ L):2.5μ L 10XPCR Buffer,2μ LdNTPs(濃度為 2.5mmol/L)，2 種引物各 0.5μ L，0.5μ L DNA 模板，0.5yL rTaq DNA 聚合酶(5U/y L)，無菌去離子水18.5μ L ;PCR擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性5min ;94°C變性lmin，58°C復(fù)性30s，72°C延伸3min，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)PCR擴(kuò)增后目的DNA與pMD 18-T載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化克隆，選取陽性克隆進(jìn)行16S rRNA序列的測(cè)序。
[0032]本發(fā)明反硝化除磷菌Cereus PlK的16S rRNA序列長(zhǎng)度為1519bp,與Bacillus sp.的親緣關(guān)系最接近，具有99%以上的相似性，采用MEGA程序?qū)υ摼M(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示。
[0033]該菌株已于2013年12月2日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)，地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，分類命名為Bacillus Cereus P1K，保藏編號(hào)為=CCTCC NO:M2013625。
[0034](5)菌 株的反 硝化功能基因序列測(cè)定及發(fā)育分析
反硝化功能基因flirS基因PCR擴(kuò)增:以細(xì)菌基因組總DNA為模板，所使用PCR引物為:cd3aF (GT (C/G) AACGT (C/G) AAG GA(A/G)AC(C/G)GG)和
R3cd (GA(C/G)TTCGG(A/G)TG(C/G)GTCTTGA)。PCR 擴(kuò)增程序:95°C預(yù)變性 3min ；94°C變性30s，57°C復(fù)性30s，72°C延伸40s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸14min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。經(jīng)PCR擴(kuò)增后目的DNA與pMD 18-T載體進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化克隆，選取陽性克隆進(jìn)行nirS序列的測(cè)序。
[0035]對(duì)測(cè)得的nirS功能基因序列利用MEGA程序?qū)⑵渑c已報(bào)道的flirS基因片段進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，結(jié)果證明菌株也ci77w5.Cereus PlK中的確存在著亞硝酸鹽還原酶基因(即反硝化功能基因基因)，它催化了反硝化反應(yīng)的進(jìn)行，這進(jìn)一步從分子生物學(xué)角度確認(rèn)菌株Cereus PlK具有反硝化功能。
[0036]菌株Cereus PlK的flirS基因序列如序列表SEQ ID No:1所不。
[0037]實(shí)施例2
測(cè)定菌株也<^'77心Cereus PlK的生長(zhǎng)曲線:將菌株Cereus PlK在缺憐培養(yǎng)基中厭氧(充氮?dú)?培養(yǎng)24h (搖床140rpm,30°C);將富集的菌液離心(8，OOOrpm,8min),無菌蒸餾水洗滌，再離心(8，OOOrpm，8min)，取菌沉淀投入到富磷培養(yǎng)基中(整個(gè)過程均在無菌條件下進(jìn)行)測(cè)定其生長(zhǎng)曲線。培養(yǎng)期間每隔2h取培養(yǎng)液，采用光電比濁法測(cè)定菌液的OD600,然后經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾后測(cè)濾液中Ρ043_-Ρ含量。菌株Cereus PlK的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。從圖中可以看出，該菌的生長(zhǎng)曲線較典型，潛伏期較短，為2h左右，菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期約為14~16h，18h以后開始進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期，吸磷主要發(fā)生在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，吸磷量隨著對(duì)數(shù)期菌株的生長(zhǎng)而增多，吸磷率在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期末達(dá)到最大。
[0038]實(shí)施例3通過試驗(yàn)考察反硝化除磷菌Cereus PlK在厭氧/好氧條件下進(jìn)行除磷的性能研究:首先，菌株ifeci77i/5.Cereus PlK在富磷培養(yǎng)基中好氧培養(yǎng)24h,離心(8，OOOrpm,8min),無菌蒸懼水洗漆,再離心(8，OOOrpm, 8min)。取菌沉淀再次投入到富磷培養(yǎng)基中，模擬厭氧/好氧SBR反應(yīng)器進(jìn)行試驗(yàn)。其中，厭氧(密閉容器，充氮?dú)?培養(yǎng)160min (140rpm,30°C)，結(jié)束后向其中充氧氣，好氧培養(yǎng)180min(140rpm，30°C)。期間每隔30min取培養(yǎng)液，經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾后測(cè)定濾液中P0/_-P含量。結(jié)果如圖4所示，從圖4中可知，在160min厭氧條件下，培養(yǎng)液中磷濃度由初始的8mg/L增加到21mg/L左右，說明在厭氧階段菌株Cereus PlK發(fā)生了明顯的釋磷現(xiàn)象，且釋磷較充分；好氧結(jié)束時(shí)磷濃度降至0.5mg/L左右,磷的去除率為93.8%。說明菌株Cereus PlK在好氧條件下能利用氧作為電子受體進(jìn)行吸磷，且好氧條件下的吸磷能力較強(qiáng)。
[0039]實(shí)施例4
通過試驗(yàn)考察反硝化除磷菌Cereus PlK在厭氧/缺氧條件下進(jìn)行同步反硝化脫氮除磷的性能研究:首先,菌株Cereus PlK在富磷培養(yǎng)基中好氧培養(yǎng)24h,離心(8，OOOrpm , 8min),無菌蒸懼水洗漆,再離心(8，OOOrpm, 8min)。取菌沉淀再次投入到富磷培養(yǎng)基中，模擬厭氧/缺氧SBR反應(yīng)器進(jìn)行試驗(yàn)。其中，厭氧(密閉容器，充氮?dú)?培養(yǎng)160min( 140rpm, 30°C )，結(jié)束后向其中投加KNO3溶液，使培養(yǎng)液中KNO3含量為30mg/L，再次充氮?dú)?，缺?溶液中有NO3-N,無溶解態(tài)氧)培養(yǎng)180min( 140rpm, 30°C )。期間每隔30min取培養(yǎng)液，經(jīng)0.22 μ m微孔濾膜過濾后測(cè)定濾液中Ρ043_-Ρ和Ν03_-Ν含量。結(jié)果如圖5所示，從圖5中可知，在160min厭氧條件下，培養(yǎng)液中磷濃度由初始的8mg/L增加到2lmg/L左右，說明在厭氧階段菌株Cereus PlK發(fā)生了明顯的釋磷現(xiàn)象，且釋磷較充分；在缺氧開始時(shí)向培養(yǎng)基中投加KNO3使其濃度為30mg/L，缺氧結(jié)束時(shí)Ν03__Ν濃度降至2.8mg/L左右，磷濃度降至2.4mg/L左右，氮的去除率為90.5%，磷的去除率為70%。這說明菌株Cereus PlK在缺氧時(shí)能利用Ν03__Ν作為電子受體進(jìn)行同步反硝化吸磷。
[0040]結(jié)合實(shí)施例3、4可知,菌株SaciTrAz1S Cereus PlK能在厭氧條件下釋磷,在好氧條件下以氧為電子受體進(jìn)行吸磷，在缺氧條件下能以硝酸鹽氮為電子受體進(jìn)行吸磷。由此可確認(rèn)菌株Cereus PlK為具有同步反硝化脫氮和除磷功能的兼性反硝化除磷菌，且反硝化能力和過量吸磷能力都較高，可以應(yīng)用于污水處理的生物脫氮除磷工藝，特別適合應(yīng)用于有機(jī)物含量較低的城市污水處理中，無需投加碳源，工藝簡(jiǎn)單，成本低廉且相對(duì)安全，有較強(qiáng)的實(shí)用價(jià)值。
【權(quán)利要求】
1.一株具有同步反硝化脫氮和除磷功能的兼性反硝化除磷菌，其特征在于，該菌株命名為Bacillus Cereus P1K，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為:CCTCC NO:M2013625。
2.權(quán)利要求1所述的兼性反硝化除磷菌在污水處理中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，用所述兼性反硝化除磷菌對(duì)污水進(jìn)行處理，實(shí)現(xiàn)同步反硝化脫氮和脫磷的目標(biāo)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述兼性反硝化除磷菌在有機(jī)物含量較低的城市污水處理中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/085GK103981120SQ201410084407
【公開日】2014年8月13日 申請(qǐng)日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】張倩, 李孟, 譚斌, 張斌, 庫輝, 閆愛萍 申請(qǐng)人:武漢理工大學(xué)