一種豬hev總抗體elisa檢測試劑盒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法，該豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟：制備HEV包被抗原；制備HEV標(biāo)記抗原；HEV標(biāo)記抗原-HRP標(biāo)記物的制備；采用碳酸鹽緩沖液以一定比例將S抗原稀釋，100μl/孔加入到酶標(biāo)板，封裝于加有干燥劑的鋁膜袋中，包被完畢。本發(fā)明建立了一種快速高效檢測豬HEV總抗體ELISA檢測方法，本發(fā)明依據(jù)雙抗原夾心法原理，包被抗原與血清中抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，結(jié)合抗原抗體復(fù)合物與標(biāo)記抗原再次產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，兩個(gè)抗原結(jié)合不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，靈敏度高，特異性好，重復(fù)性好，為戊型肝炎病毒流行病學(xué)大規(guī)模調(diào)查提供相應(yīng)技術(shù)保障，也為更好的預(yù)防和控制豬HEV疫病的流行提供了理論依據(jù)。
【專利說明】—種豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于戊型肝炎病毒的檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]戍型肝炎(Hepatitis E)是一種由戍型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的經(jīng)消化道傳播的人畜共患傳染病。該病在青少年中容易發(fā)展為暴發(fā)性肝炎，可以導(dǎo)致孕婦流產(chǎn)，病死率高達(dá)21%。HEV分布廣泛，危害嚴(yán)重。
[0003]世界各國相繼都有豬源HEV相關(guān)的報(bào)道，與人類HEV序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者具有極高的同源性，隨后又發(fā)現(xiàn)提取的RNA病毒可以感染黑猩猩和恒河猴。隨后，相繼的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明豬戊型肝炎是一種人畜共患病，豬作為戊型肝炎病毒的主要自然宿主，HEV平均感染率最高可達(dá)83.4%，許多攜帶戊肝病毒的豬群并不表現(xiàn)發(fā)病狀態(tài)(Meng X J et al.，1997)。豬是人類重要的肉食來源，同時(shí)作為人類器官移植的主要供體，有效控制戊型肝炎就必須切斷豬-人傳播途徑。這就凸現(xiàn)了豬戊型肝炎病毒的檢測診斷的意義。
[0004]由于嗜肝病毒本身的生物學(xué)特性，目前還沒有成熟的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以大量增殖病毒粒子，加上病毒本身對外界環(huán)境抵抗力弱，至今還沒有開發(fā)出令人滿意的豬戊型肝炎診斷試劑盒和疫苗。
[0005]HEV為RNA病毒，對HEVRNA的檢測主要為采用PCR方法進(jìn)行，但是由于各地所用引物不盡相同，檢測結(jié)果不盡人意；而且由于病毒RNA在血液中存在時(shí)間較短，病毒含量低，RNA易于降解等因素，使得檢測HEV RNA存在一定的困難。因此，目前對HEV的診斷主要通過檢測血清中抗HEV IgG和抗HEV IgM來進(jìn)行診斷。
[0006]免疫學(xué)檢測方法特異性高，敏感性強(qiáng)，簡便快速等優(yōu)點(diǎn)，已成為HEV血清學(xué)檢測最常用的方法，現(xiàn)在隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，可以采用基因工程方法表達(dá)相關(guān)蛋白來建立一系列血清學(xué)檢測方法。本發(fā)明采用雙抗原夾心法建立豬戊型肝炎病毒總抗體ELISA檢測試劑盒，旨在快速準(zhǔn)確高效的對豬血清中戊型肝炎病毒總抗體進(jìn)行檢測，從而建立一種靈敏度好、特異性高的免疫學(xué)檢測方法用于檢測和評估豬群的HEV抗體水平，對于豬群戊型肝炎病毒的臨床診斷和預(yù)防控制具有重要意義。
[0007]目前，市場上戊型肝炎病毒的檢測主要采用血清學(xué)ELISA檢測法，此產(chǎn)品主要應(yīng)用于人血清抗體的檢測，還沒有相關(guān)產(chǎn)品用于豬HEV抗體的檢測，豬作為戊型肝炎病毒的主要自然宿主，由于缺乏相關(guān)可行的檢測產(chǎn)品，暫時(shí)也沒有豬群HEV抗體水平的檢測報(bào)告。豬源HEV與人類HEV序列具有極高的同源性，且其RNA病毒還可以感染黑猩猩和恒河猴等其它動(dòng)物，為了彌補(bǔ)這一技術(shù)空白，開發(fā)了豬源HEV總抗體ELISA檢測方法，克服了現(xiàn)有試劑盒只能特異性檢測人戊型肝炎病毒的不足，該產(chǎn)品為第一個(gè)專門用于檢測動(dòng)物戊型肝炎總抗體的免疫產(chǎn)品系列。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明在于提供一種豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法，旨在解決現(xiàn)有戊型肝炎病毒的試劑盒只能特異性檢測人戊型肝炎病毒，而不能檢測豬源的戊型肝炎病毒的問題。
[0009]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法，該豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟:
[0010]第一步，HEV包被抗原的制備:
[0011]首先PCR擴(kuò)增豬源SWCH189株HEV 0RF2基因部分的兩個(gè)片段，上下游引物分別帶有BamH I和Not I酶切位點(diǎn)；
[0012]FS為S片段上游引物，帶有BamH I酶切位點(diǎn)，RS為片段下游引物，帶有Not I酶切位點(diǎn)；FP12為P12片段上游引物，帶有BamH I酶切位點(diǎn)，RP12為片段下游引物，帶有Not I酶切位點(diǎn)；
[0013]PCR片段擴(kuò)增后回收，采用BamH I和Not I雙酶切，連接到pMD18_T載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取轉(zhuǎn)化子，小提質(zhì)粒，用BamH I和Not I酶切鑒定，鑒定陽性克隆分別命名為T-S和T-P12 ; [0014]將pET32a ( + )與鑒定的克隆質(zhì)粒分別以BamH I /Not I進(jìn)行消化，進(jìn)行瓊脂糖電泳，膠回收目的片段后進(jìn)行連接，構(gòu)建可在大腸桿菌中表達(dá)的重組質(zhì)粒，命名PET-S和PET-P12，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取轉(zhuǎn)化子，小提質(zhì)粒，用BamH I和Not I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定；
[0015]陽性重組質(zhì)粒pET-S和pET-P12轉(zhuǎn)化Rossetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆菌落于氨芐西林鈉LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)10h，菌液以1:100的比例加入到IL含100 μ g/ml氨芐西林鈉的LB培養(yǎng)基37°C振蕩培養(yǎng)至0D600=0.8，加入的終濃度為0.5mmol/L的IPTG，25°C誘導(dǎo)5h，4°C 6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20mll%Triton X-100的PBS懸浮，超聲波破碎，4°C 12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，分析確定表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌的存在形式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體的形式存在。
[0016]目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，條帶與預(yù)期大小相一致，命名為S蛋白，純化的S蛋白為包被抗原；
[0017]第二步，HEV標(biāo)記抗原的制備:
[0018]將陽性克隆pET-P12于Amp+LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)10h，菌液以1:100的比例加入到IL含100 μ g/ml氨芐西林鈉的LB培養(yǎng)基37°C振蕩培養(yǎng)至0D600=0.8，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，25°C誘導(dǎo)5h，4°C 6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20mll%Triton X-100的PBS懸浮，超聲波破碎，4°C 12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，確定表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于沉淀，進(jìn)行蛋白的純化，純化得到的蛋白命名為P12蛋白，為標(biāo)記蛋白；
[0019]第三步，HEV標(biāo)記抗原-HRP標(biāo)記物的制備,具體包括:
[0020]步驟一，HEV標(biāo)記抗原和HRP的偶聯(lián)采用NaIO4氧化法，首先將純化蛋白P12于PBS溶液中4°C透析過夜；
[0021]步驟二，紫外分光光度計(jì)測定純化蛋白濃度；
[0022]步驟三，分析天平秤取HRPlOmg溶于2ml超純水中制備終濃度為5mg/ml的HRP溶液，分析天平秤取NaIO4，溶于超純水中制備終濃度為20mg/ml的NaIO4溶液備用；[0023]步驟四，緩慢滴加225 μ I NaIO4溶液于2ml HRP溶液中，室溫下避光靜置20分鐘；
[0024]步驟五，加入20 μ I乙二醇于HRP混合溶液中，之后室溫下靜置30分鐘；
[0025]步驟六,取lml2.lmg/ml的標(biāo)記蛋白P12緩慢逐滴加入到活化好的HRP溶液中；
[0026]步驟七，然后將P12蛋白-HRP結(jié)合物分別于50mM CB pH9.6的溶液中4°C避光透析2.5個(gè)小時(shí)；
[0027]步驟八，分析天平稱量NaBH4溶于水中，制備終濃度為4mg/ml的NaBH4溶液；
[0028]步驟九，將透析袋取出，加入162 μ I的NaBH4溶液；
[0029]步驟十，室溫下在搖床上輕輕震動(dòng)2個(gè)小時(shí)；
[0030]步驟^^一，標(biāo)記物在PBS溶液中4°C透析過夜；
[0031]步驟十二，透析結(jié)束后1:1比例加入甘油，-20度保存，此標(biāo)記物下文稱為HRP-PI2 ；
[0032]第四步，采用碳酸鹽緩沖液以一定比例將S抗原稀釋，100 μ I/孔加入到酶標(biāo)板,4 °C 包被過夜，次日采用 PBST (IOmM PB, 150mM NaCl, 0.05%Tween-20, pH7.4)洗滌液洗板三次，最后一次拍干，150 μ I/孔加入含30%新生牛血清，8%蔗糖，5%牛血清白蛋白，150mM NaCl的P H7.4,10mM PB封閉液，4°C封閉12小時(shí)，次日甩掉孔內(nèi)液體，拍干，置室溫20-25 °C、濕度20%-25%、有通風(fēng)設(shè)備的干燥房間內(nèi)風(fēng)干過夜，封裝于加有干燥劑的鋁膜袋中，包被完畢。
[0033]進(jìn)一步,在第一步中的蛋白純化采用Invitrogene clonetech蛋白純化柱,具體步驟如下:
[0034]步驟一，準(zhǔn)備IL表達(dá)菌體細(xì)胞，取5ml菌液12000r/min離心2min，棄去上清，加入lmmol/LPH7.4的PBS充分懸浮，4°C 6000r/min離心15min,保留沉淀,如此反復(fù)離心3次；
[0035]步驟二，沉淀于_70°C放置5min，之后取出溶化；如此反復(fù)凍融循環(huán)3~5次，以實(shí)現(xiàn)最大的裂解；
[0036]步驟三,加入100 μl 的 1 XFastBreakTM cell Lysis Reagent 溶液于沉淀中，充分懸??；
[0037]步驟四，加1 μ I的DNase 1 ,室溫下200r/min搖震30min ；
[0038]步驟五，加入30μ I的N1-Particles或者加入0.03g的NaCl固體；
[0039]步驟六,采用移液器反復(fù)吸吹混合10次后，室溫靜置孵育30min ；
[0040]步驟七，將EP管放入碳磁力架上30s，看到鎳柱被吸附到靠近磁力架的一邊，用移液器將剩余的液體吸出來；
[0041]步驟八，加入150 μ I的Bind/Wash Buffer,反復(fù)吸吹混合10次，室溫靜置孵育IOmin,之后放入磁力架30s，將剩余的液體吸出來，采用同樣的液體反復(fù)洗兩遍，最后一次的液體務(wù)必吸干凈，不要有殘留；
[0042]步驟九,加入100 μ I的Elution Buffer,多次混合吹打后于磁力架上作用30s后保留不同菌體蛋白的液體并分別標(biāo)號，同時(shí)將純化的蛋白和各自的鎳柱進(jìn)行蛋白電泳分析結(jié)果。
[0043]進(jìn)一步，該豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的具體使用方法為:
[0044]酶標(biāo)板中每孔加入10(^1樣品稀釋液，樣品稀釋液為？!17.4?8，1501111 NaCl，5%牛血清白蛋白，0.5%魚明膠，2%Tween-20，0.l%Triton X-100,0.1%硫柳汞，加入50 μ I待測樣品、選擇健康豬陰性血清作為陰性參照樣品、選擇HEV抗體陽性豬血清作為陽性參照樣品對照，37°C溫育30分鐘；用PBST洗滌液洗板五次，最后一次拍干，100 μ I/孔加入含有20%新生牛血清，以一定比例稀釋的HRP-P12緩沖液，37°C溫育30分鐘；用PBST洗滌液洗板五次，拍干;
[0045]每孔加入含0.5%過氧化氫尿素、4.76%三水合乙酸鈉、0.9%冰醋酸的顯色劑A及含0.32%TMB、5mM檸檬酸、0.5mMEDTA_2Na、5%甲醇、2% 二甲基甲酰胺的顯色劑B各50 μ 1，37 °C避光顯色15分鐘，每孔加50 μ 1，含2Μ硫酸的終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm波長空白孔校零后讀取OD值。
[0046]進(jìn)一步，臨界值COV計(jì)算:C0V=陰性對照平均OD值X1.5，陰性對照OD值低于0.065按0.065計(jì)算，高于0.065按實(shí)際OD值計(jì)算，待測樣品OD值≥COV為陽性，待測樣品OD值〈C0V為陰性。
[0047]進(jìn)一步，ELISA試劑盒采用雙抗原夾心法原理，S抗原采用pH9.6CB稀釋至4 μ g/ml進(jìn)行包板，之后4°C包被過夜；酶標(biāo)封閉液0.5%BSA, 20mM PB, 150mM NaCl，0.1%穩(wěn)定劑T，0.01%Proclin300加入150 μ I進(jìn)行封閉；陽性樣本的稀釋；P12_HRP標(biāo)記酶標(biāo)記過程中，HRP與P12的摩爾比為1:5，之后采用酶稀液0.5%BSA, 20mM PB, 150mM NaCl，5%新生牛血清，0.01%Proclin300稀釋2000倍后用于ELISA試劑盒的標(biāo)記。
[0048]本發(fā)明提供的豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法，根據(jù)豬源HEV 0RF2蛋白結(jié)構(gòu)信息，將豬源HEV 0RF2進(jìn)行兩個(gè)抗原片段原核表達(dá)，S結(jié)構(gòu)域蛋白和P12結(jié)構(gòu)域蛋白。ELISA試劑盒中，S蛋白純化后作為包被抗原，P12蛋白純化后進(jìn)行辣根過氧化物標(biāo)記作為標(biāo)記抗原；采用豬源swCH189株HEV毒株，根據(jù)HEV病毒蛋白結(jié)構(gòu)現(xiàn)有的研究成果，通過采用相關(guān)生物學(xué)軟件分析其衣殼蛋白結(jié)構(gòu)，并成功表達(dá)不同的衣殼蛋白片段，經(jīng)過不同實(shí)驗(yàn)方法的研究及探索，篩選出最佳實(shí)驗(yàn)方法及抗原組合，建立了一種快速高效檢測豬HEV總抗體的ELISA檢測方法；本發(fā)明的靈敏度高，特異性好，重復(fù)性好，為戊型肝炎病毒流行病學(xué)大規(guī)模調(diào)查提供一定的技術(shù)保障，也為更好的預(yù)防和控制HEV疫病的流行提供技術(shù)支撐；采用雙抗原夾心法原理，包被抗原與血清中抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合，結(jié)合抗原抗體復(fù)合物與標(biāo)記抗原再次產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng)，兩個(gè)抗原結(jié)合不同的抗原結(jié)合位點(diǎn)，特異性好，靈敏度聞。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法流程圖；
[0050]圖2是本發(fā)明實(shí)施例提供的S基因的PCR擴(kuò)增示意圖；
[0051]圖中:M:DL2000marker;1: S 基因擴(kuò)增片段；
[0052]圖3是本發(fā)明實(shí)施例提供的P12基因的PCR擴(kuò)增示意圖；
[0053]圖中:Μ:λ-EcoT14 I digest marker ;1:P12 基因擴(kuò)增片段;
[0054]圖4是本發(fā)明實(shí)施例提供的S基因的酶切鑒定示意圖；
[0055]圖中:M:DL2000marker ;1: S基因酶切鑒定片段；
[0056]圖5是本發(fā)明實(shí)施例提供的P12基因的酶切鑒定示意圖；
[0057]圖中:M:DL2000marker ；1:P12基因酶切鑒定片段；
[0058]圖6是本發(fā)明實(shí)施例提供的His-S蛋白的SDS-PAGE分析示意圖；[0059]圖7是本發(fā)明實(shí)施例提供的His-S蛋白純化示意圖；
[0060]圖8是本發(fā)明實(shí)施例提供的His_P12蛋白的SDS-PAGE分析示意圖；
[0061]圖9是本發(fā)明實(shí)施例提供的His_P12蛋白純化示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0062]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0063]下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0064]如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟:
[0065]SlOl:制備HEV包被抗原； [0066]S102:制備HEV標(biāo)記抗原；
[0067]S103 =HEV標(biāo)記抗原-HRP標(biāo)記物的制備；
[0068]S104:采用碳酸鹽緩沖液以一定比例將S抗原稀釋，100 μ I/孔加入到酶標(biāo)板，封裝于加有干燥劑的鋁膜袋中，包被完畢。
[0069]結(jié)合本發(fā)明的具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明:
[0070]本發(fā)明的實(shí)施例包括以下步驟:
[0071]第一步，HEV包被抗原的制備:
[0072]首先PCR擴(kuò)增豬源SWCH189株HEV 0RF2 (蘭州獸醫(yī)研究所傳染病室保存)基因部分的兩個(gè)片段，上下游引物設(shè)計(jì)如表1和表2所示，分別帶有BamH I和Not I酶切位點(diǎn)；
[0073]表1:SWCH189株S片段設(shè)計(jì)引物為:
[0074]
【權(quán)利要求】
1.一種豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，該豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟: 第一步，HEV包被抗原的制備: 首先PCR擴(kuò)增豬源SWCH189株HEV 0RF2基因部分的兩個(gè)片段，上下游引物分別帶有BamH I和Not I酶切位點(diǎn)； FS為S片段上游引物，帶有BamH I酶切位點(diǎn)，RS為片段下游引物，帶有Not I酶切位點(diǎn)；FP12為P12片段上游引物，帶有BamH I酶切位點(diǎn)，RP12為片段下游引物，帶有Not I酶切位點(diǎn)； PCR片段擴(kuò)增后回收，采用BamH I和Not I雙酶切，連接到pMD18_T載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取轉(zhuǎn)化子，小提質(zhì)粒，用BamH I和Not I酶切鑒定，鑒定陽性克隆分別命名為T-S和T-P12; 將pET32a ( + )與鑒定的克隆質(zhì)粒分別以BamH I /Not I進(jìn)行消化，進(jìn)行瓊脂糖電泳，膠回收目的片段后進(jìn)行連接，構(gòu)建可在大腸桿菌中表達(dá)的重組質(zhì)粒，命名PET-S和PET-P12，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，挑取轉(zhuǎn)化子，小提質(zhì)粒，用BamH I和Not I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切鑒定； 陽性重組質(zhì)粒PET-S和pET-P12轉(zhuǎn)化Rossetta (DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑選單克隆菌落于氨節(jié)西林鈉LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)IOh,菌液以1:100的比例加入到IL含100 μ g/ml氨節(jié)西林鈉的LB培養(yǎng)基37°C振蕩培養(yǎng)至0D600=0.8，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG，25°C誘導(dǎo)5h，.4°C 6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20mll%TritonX-100的PBS懸浮，超聲波破碎，4°C 12000r/min離 心30分鐘，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，分析確定表達(dá)產(chǎn)物在大腸桿菌的存在形式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組蛋白以包涵體的形式存在； 目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，條帶與預(yù)期大小相一致，命名為S蛋白，純化后的S蛋白為包被抗原； 第二步，HEV標(biāo)記抗原的制備: 將陽性克隆PET-P12于Amp+LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)10h，菌液以1:100的比例加入到IL含.100 μ g/ml氨芐西林鈉的LB培養(yǎng)基37°C振蕩培養(yǎng)至0D600=0.8，加入終濃度為lmmol/L的IPTG, 25°C誘導(dǎo)5h，4°C 6000r/min離心15分鐘收集菌體，菌體采用20mll%Triton X-100的PBS懸浮，超聲波破碎，4°C 12000r/min離心30分鐘，分別取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，確定表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在于沉淀，進(jìn)行蛋白的純化，純化得到的蛋白命名為P12蛋白，為標(biāo)記蛋白； 第三步，HEV標(biāo)記抗原-HRP標(biāo)記物的制備，具體包括: 步驟一，HEV標(biāo)記抗原和HRP的偶聯(lián)采用NaIO4氧化法，首先將純化蛋白P12于PBS溶液中4°C透析過夜； 步驟二，紫外分光光度計(jì)測定純化蛋白濃度； 步驟三，分析天平秤取HRPlOmg溶于2ml超純水中制備終濃度為5mg/ml的HRP溶液，分析天平秤取NaIO4，溶于超純水中制備終濃度為20mg/ml的NaIO4溶液備用； 步驟四，緩慢滴加225 μ I NaIO4溶液于2ml HRP溶液中，室溫下避光靜置20分鐘； 步驟五，加入20 μ I乙二醇于HRP混合溶液中，之后室溫下靜置30分鐘； 步驟六，取lml2.lmg/ml的標(biāo)記蛋白P12緩慢逐滴加入到活化好的HRP溶液中；步驟七，然后將P12蛋白-HRP結(jié)合物分別于50mM CB pH9.6的溶液中4°C避光透析2.5個(gè)小時(shí)； 步驟八，分析天平稱量NaBH4溶于水中，制備終濃度為4mg/ml的NaBH4溶液； 步驟九，將透析袋取出，加入162 μ I的NaBH4溶液； 步驟十，室溫下在搖床上輕輕震動(dòng)2個(gè)小時(shí)； 步驟十一，標(biāo)記物在PBS溶液中4°C透析過夜； 步驟十二，透析結(jié)束后1:1比例加入甘油，-20度保存，此標(biāo)記物下文稱為HRP-P12 ；第四步，采用碳酸鹽緩沖液以一定比例將S抗原稀釋，100 μ I/孔加入到酶標(biāo)板，4°C包被過夜，次日采用PBST(10mM PB, 150mM NaCl,0.05%Tween_20，pH7.4)洗滌液洗板三次，最后一次拍干，150 μ I/孔加入含30%新生牛血清，8%蔗糖，5%牛血清白蛋白，150mM NaCl的P H 7.4，IOmM PB封閉液，4°C封閉12小時(shí)，次日甩掉孔內(nèi)液體，拍干，置室溫20-25°C、濕度20%-25%、有通風(fēng)設(shè)備的干燥房間內(nèi)風(fēng)干過夜，封裝于加有干燥劑的鋁膜袋中，包被完畢。
2.如權(quán)利要求1所述的豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，在第一步中的蛋白純化采用Invitrogene clonetech蛋白純化柱,具體步驟如下: 步驟一，準(zhǔn)備IL表達(dá)菌體細(xì)胞，取5ml菌液12000r/min離心2min，棄去上清，加入lmmol/LPH7.4的PBS充分懸浮，4°C 6000r/min離心15min,保留沉淀,如此反復(fù)離心3次；步驟二，沉淀于_70°C放置5min，之后取出溶化；如此反復(fù)凍融循環(huán)3~5次，以實(shí)現(xiàn)最大的裂解； 步驟三,加入100 μ I的I XFastBreakTM cell Lysis Reagent溶液于沉淀中，充分懸浮; 步驟四，加入1μ I的DNase I ,室溫下200r/min搖震30min ； 步驟五，加入30μ I的N1-Particles或者加入0.03g的NaCl固體； 步驟六，采用移液器反復(fù)吸吹混合10次后，室溫靜置孵育30min ； 步驟七，將EP管放入碳磁力架上30s，看到鎳柱被吸附到靠近磁力架的一邊，用移液器將剩余的液體吸出來； 步驟八，加入150 μ I的Bind/Wash Buffer,反復(fù)吸吹混合10次，室溫靜置孵育lOmin，之后放入磁力架30s，將剩余的液體吸出來，采用同樣的液體反復(fù)洗兩遍，最后一次的液體務(wù)必吸干凈，不要有殘留； 步驟九，加入100 μ I的Elution Buffer,多次混合吹打后于磁力架上作用30s后保留不同菌體蛋白的液體并分別標(biāo)號，同時(shí)將純化的蛋白和各自的鎳柱進(jìn)行蛋白電泳分析結(jié)果O
3.如權(quán)利要求1所述的豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，該豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的具體使用方法為: 酶標(biāo)板中每孔加入100 μ I樣品稀釋液，樣品稀釋液為PH7.4ΡΒ, 150mM NaCl，5%牛血清白蛋白，0.5%魚明膠，2%Tween-20，0.l%TritonX-100,0.1%硫柳汞，加入50 μ I待測樣品，選擇健康豬陰性血清作為陰性參照樣品，選擇制備的HEV抗體陽性豬血清作為陽性參照樣品對照，37°C溫育30分鐘；用PBST洗滌液洗板五次，最后一次拍干，每孔加入100 μ I含有20%新生牛血清的以一定比例稀釋的HRP-P12緩沖液，37°C溫育30分鐘；用PBST洗滌液洗板五次，拍干；每孔加入含0.5%過氧化氫尿素、4.76%三水合乙酸鈉、0.9%冰醋酸的顯色劑A及含.0.32%TMB、5mM檸檬酸、0.5m MEDTA_2Na、5%甲醇、2%二甲基甲酰胺的顯色劑B各50 μ 1，37°C避光顯色15分鐘，每孔加50 μ 1，含2Μ硫酸的終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm波長空白孔校零后讀取OD值。
4.如權(quán)利要求3所述的豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，臨界值(Cut off Value (COV))計(jì)算:COV=陰性對照平均OD值X1.5，陰性對照OD值低于0.065按0.065計(jì)算，高于0.065按實(shí)際OD值計(jì)算，待測樣品OD值≥COV為陽性，待測樣品OD值〈C0V為陰性。
5.如權(quán)利要求1所述的豬HEV總抗體ELISA檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，ELISA試劑盒采用雙抗原夾心法原理，S抗原采用pH9.6CB稀釋至4 μ g/ml進(jìn)行包板，之后4°C包被過夜；酶標(biāo)封閉液 0.5%BSA, 20mM PB, 150mMNaCl,0.1% 穩(wěn)定劑 Τ，0.01%Proclin300加入150 μ I進(jìn)行封閉；陽性樣本的稀釋；P12-HRP標(biāo)記酶標(biāo)記過程中，HRP與P12的摩爾比為 1:5，之后采用酶稀液0.5%834，20禮 PB, 150mM NaCl，5% 新生牛血清，0.01%Proclin300稀釋2000倍后用于ELISA試劑盒的標(biāo)記。
【文檔編號】C12N15/70GK103837680SQ201410084515
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】蘭喜, 楊彬, 常曉依, 柳紀(jì)省, 張韻, 殷相平, 李寶玉, 李學(xué)瑞, 李志勇, 方玉萍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所