一種堿性果膠酸裂解酶PelA及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種堿性果膠酸裂解酶PelA及其編碼基因和應(yīng)用，所述堿性果膠酸裂解酶PelA的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本發(fā)明的堿性果膠酸裂解酶PelA是從食用菌草菇中克隆得到的新的果膠裂解酶酶，其最適溫度為60℃，最適pH為10.0，具有良好的溫度和pH穩(wěn)定性，并且在無外源鈣離子條件下仍具有高催化性能，因此其在工業(yè)化應(yīng)用中具有良好的應(yīng)用前景。另外其來源為食用菌因此安全性可靠，可廣泛應(yīng)用于食品，飼料以及醫(yī)藥等行業(yè)。
【專利說明】一種堿性果膠酸裂解酶PeIA及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種堿性果膠酸裂解酶PelA及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]果膠(Pectin)分子是由不同酯化度的半乳糖醒酸以α-1,4糖苷鍵聚合而成的多糖鏈。果膠的結(jié)構(gòu)因植物的種類、組織部位、生長(zhǎng)條件等的不同而不同，主要分為三種類型，它們分別為聚半乳糖醒酸(Homogalacturonan, HGA)、鼠李糖半乳糖醒酸聚糖I(Rhamnogalacturonan I，RG-1)和鼠李糖半乳糖醒酸聚糖 II (Rhamnogalacturonan II，RG-1I)。果膠質(zhì)廣泛存在高等植物中，是植物細(xì)胞間的胞間層和初生壁的重要組分。果膠質(zhì)在植物的細(xì)胞組織中起著“粘合”作用，一旦植物組織中的果膠質(zhì)分解便引起細(xì)胞的離散。果膠質(zhì)主要是由D-半乳糖醛酸以α_1，4糖苷鍵連接形成的直鏈狀的聚合物。棉花外面的保護(hù)層為細(xì)胞壁，其中含有以果膠質(zhì)為主的各種雜質(zhì)，對(duì)棉纖維起到一定的保護(hù)作用，但同時(shí)這也給棉織物的加工帶來了一定的困難。在棉織物的進(jìn)行精煉的工藝中，果膠質(zhì)及其他一些雜質(zhì)是主要的處理對(duì)象。
[0003]一般工業(yè)會(huì)采取堿處理去除果膠雜質(zhì)，堿殘液具有很高的pH，需要加入硫酸或二氧化碳進(jìn)行中和，二者都會(huì)增加排除廢水的鹽濃度，使生產(chǎn)排出的廢水具有較高C0D/B0D。對(duì)于生產(chǎn)而言，還將耗費(fèi)大量的時(shí)間及工藝用水，而且中和堿形成的鹽類物質(zhì)會(huì)對(duì)織物的色澤產(chǎn)生影響。更為重要的是，上述處理方式對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的負(fù)面影響更應(yīng)該引起我們的重視。利用酶法進(jìn)行生物精煉 是實(shí)現(xiàn)綠色紡織品生產(chǎn)的趨勢(shì)之一。利用生物酶處理方法可大大改善棉紡織預(yù)處理工藝對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量及環(huán)境的影響。例如，可節(jié)約大量工藝用水、生產(chǎn)時(shí)間、能耗、原料及對(duì)廢水的處理費(fèi)用，減少對(duì)環(huán)境排放水中的鹽含量及COD等。
[0004]果膠酸裂解酶(Pectate lyase, Pel)又叫聚半乳糖醒酸裂解酶(Polygalacturonase lyase, PGL),它是通過反式消去作用裂解果膠聚合體的一種果膠酶，在C-4位置上斷開糖苷鍵，同時(shí)從C-5處消去一個(gè)H原子從而產(chǎn)生一個(gè)不飽和產(chǎn)物。
[0005]堿性果膠酸裂解酶對(duì)于亞麻纖維的前處理和棉紡織物的生物酶煮練有很大的應(yīng)用前景。亞麻纖維具有許多其它纖維無法比擬的優(yōu)點(diǎn)，是很有發(fā)展?jié)摿Φ墓δ苄原h(huán)保紡織原料。但由于亞麻韌皮的單細(xì)胞間存在果膠物質(zhì)，其主要成分是果膠酸的衍生物，且大部分以鈣、鎂鹽和甲酯的形式存在，通過化學(xué)鍵的形式與亞麻纖維中的半纖維素和含氮的物質(zhì)結(jié)合，在亞麻慪麻的過程中很難去除。并且果膠物質(zhì)對(duì)亞麻纖維的潤(rùn)濕性、可滲透性都有影響，所以在亞麻纖維使用前必須去除果膠物質(zhì)。果膠酸裂解酶能夠裂解果膠物質(zhì)變成半乳糖醛酸等小分子物質(zhì)進(jìn)而溶于水，將其去除。
[0006]堿性果膠酸裂解酶對(duì)棉花纖維進(jìn)行生物精煉，發(fā)現(xiàn)果膠酸裂解酶的效果和傳統(tǒng)堿處理一樣好。果膠酸裂解酶還能夠與纖維素酶協(xié)同煮練，果膠酶使初生壁層產(chǎn)生了較多的部位，可適用于纖維素酶的煮解；而纖維素酶的作用，在果膠物質(zhì)層中產(chǎn)生了較多的部位，可適用于果膠酶的煮解。這種協(xié)同作用的結(jié)果，在對(duì)苧麻纖維的處理速度和均勻度方面較為有效。
[0007]傳統(tǒng)的堿性果膠酸裂解酶需要在鈣離子存在下才具有催化活性，需要使用時(shí)添加鈣離子，增加了工藝條件的復(fù)雜性和成本，因此，堿性果膠酸裂解酶如不需要鈣離子，而且在苛性條件下，仍具有較高的活性和穩(wěn)定性將是工業(yè)化應(yīng)用的優(yōu)良酶源。
[0008]草燕(Volvariella volvacea)是生長(zhǎng)在熱帶和亞熱帶地區(qū)的大型真菌,與其它食用真菌相比，它具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，首先，它是一種高溫型擔(dān)子菌，酶穩(wěn)定性好，對(duì)其天然生長(zhǎng)底物——稻草的生物降解快速有效；其次，草菇雖為白腐菌，但它的木質(zhì)素降解能力較弱，它可以在木質(zhì)素未被充分降解的情況下有效的降解利用天然稻草中的纖維素和半纖維素，這些酶可能成為生物煉制工程中極具潛力的新酶源。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]發(fā)明目的:針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種堿性果膠酸裂解酶PelA，不需要外源性鈣離子，在堿性條件下就具有高活性和穩(wěn)定性，滿足使用需求。本發(fā)明的另一目的是提供所述堿性果膠酸裂解酶的編碼基因。本發(fā)明還有一目的是提供上述性果膠酸裂解酶PelA的應(yīng)用。
[0010]技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種堿性果膠酸裂解酶PelA，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]所述堿性果膠酸裂解酶PelA的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0012]含有所述的堿性果膠酸裂解酶PelA的編碼基因的表達(dá)體系。
[0013]所述的表達(dá)體系在表達(dá)堿性果膠酸裂解酶PelA中的應(yīng)用。
[0014]所述的堿性果膠酸裂解酶PelA在酶解聚半乳糖醛酸中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明從草菇中克隆獲得堿性果膠酸裂解酶PelA基因，并實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母中的高效異源表達(dá)并研究了其酶學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)其不需要添加外源鈣離子就具有高活性，是一種工業(yè)化應(yīng)用的優(yōu)質(zhì)酶源。
[0016]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的堿性果膠酸裂解酶是一種從食用菌草菇中克隆得到的新的果膠酸裂解酶，其最適溫度為60°C，最適pH為10.0，具有良好的溫度和pH穩(wěn)定性，并且無外源鈣離子存在下就具有高活性，因此其在工業(yè)化應(yīng)用中具有良好的應(yīng)用前景。另外其來源為食用菌因此安全性可靠，可廣泛應(yīng)用于食品，紡織和造紙等行業(yè)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是純化得到的堿性果膠酸裂解酶PelAI的12% SDS-PAGE電泳圖；圖中，M:Marker ；I:PelA ；2:PelA(+EndoH)
圖2是堿性果膠酸裂解酶PelA最適pH測(cè)定結(jié)果圖；
圖3是堿性果膠酸裂解酶PelA pH耐受性測(cè)定結(jié)果圖；
圖4是堿性果膠酸裂解酶PelA最適溫度測(cè)定結(jié)果圖；
圖5是堿性果膠酸裂解酶PelA溫度耐受性測(cè)定結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。[0019]以下實(shí)施例所使用的材料和試劑如下:
菌株及載體:草燕菌種KoJrariWJa volvacea V14由香港中文大學(xué)國際菌物服務(wù)中心提供，巴斯德畢赤酵母(/7ZcAia pastor is KM71H)及表達(dá)載體pPicz α B購自Invitrogen公司，大腸桿菌DH5 α及基因操作質(zhì)粒pGEM-T購自Promega公司。
[0020]酶類及其它生化試劑:限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、連接酶和dNTP購自TaKaRa公司；燕麥木聚糖、樺木木聚糖和山毛櫸木聚糖購自Sigma公司；其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。
[0021]LB 培養(yǎng)基:Peptone 10g, Yeast extract 5g, NaCl IOg,加蒸懼水至 1000mL,pH自然(約為7)。固體培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上加2.0% (w/v)瓊脂。
[0022]YPD 培養(yǎng)基:10g Yeast Extract, 20g peptone,溶于 900mL 水，高溫高壓滅菌,加A IOOmL滅過菌的IOXD (20%的葡萄糖)。
[0023]BMGY 培養(yǎng)基:10g Yeast Extract, 20g peptone 溶于 700mL 水，高溫高壓滅菌，冷卻到室溫后加入IOOmL pH=6的IM的磷酸鉀緩沖液(溫高壓滅菌)，IOOmL 10XYNB (濾膜滅菌)，2mL 500XB (20mg biotin 溶于 IOOmL 的水，濾膜滅菌)，IOOmL 10XGY (IOOmL 甘油溶于900mL水高溫高壓滅菌)，混合均勻后4°C保存。
[0024]BMMY:1Og Yeast Extract, 20g peptone溶于 700mL水，高溫高壓滅菌，冷卻到室溫后加入，IOOmL pH 6的IM的磷酸鉀緩沖液(溫高壓滅菌)，IOOmL 10XYNB (濾膜滅菌)，2mL500XB (20mg biotin溶于IOOmL的水,濾膜滅菌)，IOOmL 10XM (5%的甲醇),混合均勻后
4°C保存。
[0025]以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進(jìn)行。
[0026]實(shí)施例1基因的克隆
RNA的提取及模板的制備:草菇菌種從平板接種于稻草培養(yǎng)基8天后收集菌絲，采用invitrogen的TRIZOL regent提取:液氮將收集的菌絲研磨成粉末,取適量粉末加入ImLTRIZOL regent，混合均勻后室溫靜置5min。加入氯仿，震蕩混合均勻，室溫靜置2_3 min。12000g的轉(zhuǎn)速離心15min。上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管，加入異丙醇，混合均勻后室溫靜置lOmin，用12000g的轉(zhuǎn)速離心棄上清，沉淀用75%乙醇清洗，7500g的速度離心。干燥RNA，注意RNA不能完全干燥，用TE buffer溶解RNA，55-60°C保溫IOmin。參照SMART RACE cDNAAmplification Kit (Clontech)的方法制備 5’ RACE 及 3，RACE 的模板。
[0027]取草燕cDNA文庫的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)(序列見SEQ ID N0.3)與Genebank中相關(guān)序列進(jìn)行 blastx 比 (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/Blast.cgi),發(fā)現(xiàn)其與果膠酸裂解酶具有較高的同源性，根據(jù)該EST序列設(shè)計(jì)特異性引物5’ -GCGCTTGGCGAGGGCAACAATTTCGT -3’ ，參照 SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech)的說明書，以制備的5’ RACE的模板首先進(jìn)行5’ RACE PCR0 PCR反應(yīng)參數(shù)為:94 °C變性 30sec，72°C延伸 3min，5 個(gè)循環(huán)；94 °C變性 30sec，70°C退火 30sec，72°C延伸3min，5個(gè)循環(huán)后94 °C變性30sec，68°C退火30sec，72°C延伸3min，20個(gè)循環(huán)。獲得基因片段，并將該片段回收后與載體PGEM-T相連，然后送南京思普金生物科技有限公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序得到的5’端序列，序列設(shè)計(jì)引物5’ - ACATGGGGAACAGTCAACAGACATCTGT -3’，進(jìn)行3’ RACE PCR擴(kuò)增得到一約IOObp片段，將該片段回收后與載體pGEM_T相連，測(cè)序，最后得到堿性果膠酸裂解酶PelA基因的全長(zhǎng)。測(cè)序結(jié)果顯示，該堿性果膠酸裂解酶PelA基因全長(zhǎng)963bp，DNA序列見SEQ ID N0.2，表達(dá)的蛋白序列見SEQ ID N0.1，其閱讀框包含321個(gè)氨基酸，其中前18個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。經(jīng)蛋白同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)其屬于多糖裂解酶家族1，理論分子量為34kDa，理論等電點(diǎn)(pi)為8.82。
[0028]實(shí)施例2 堿性果膠酸裂解酶PelA在畢赤酵母中的表達(dá)及純化
堿性果膠酸裂解酶PelA的表達(dá)采用EasySelect Pichia Expression Kit(invitrogen)。分別設(shè)計(jì)了兩條引物 5’ - TGCCGGAATTCCGATTCCGATCGAACCCTCTGAGCA -3’和 5’- GCTCTAGATTAATGATGATGATGATGATGAAATGTCAAGGTCTGGCCG _3’，利用 PCR的方法在木聚糖酶的N端和C端分別引入兩個(gè)限制性酶切位點(diǎn)EcoRI和XbaI，將其雙酶切后與同樣雙酶切的表達(dá)載體PPICZ α B利用Τ4 DNA連接酶連接，將連接好的重組質(zhì)粒pPICZ α B—PelA經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacI線性化后電擊轉(zhuǎn)入PicAia pas tor is KM71H后，利用含有IM山梨醇和100 μ g/mL Zeocin (Invitrogen)抗生素的YPD平板進(jìn)行陽性克隆的篩選。將篩選到的陽性克隆接入裝有3mL YH)和3μ L抗生素Zeocin的試管中28°C _30°C，250rpm搖床培養(yǎng)，24h后將菌液分別轉(zhuǎn)接到30mL BMGY培養(yǎng)液中28°C -30°C，250rpm搖床培養(yǎng)至其OD6tltl達(dá)到3-4后，離心收集菌體，再轉(zhuǎn)接到15mL BMMY培養(yǎng)液中28°C，250rpm搖床培養(yǎng)，每隔24h補(bǔ)加甲醇，甲醇濃度為0.8% (v/v)，連續(xù)培養(yǎng)4d后離心收集酶液。將粗酶液先裝入透析袋中，4°C在pH 8.0的磷酸緩沖液中輕微攪拌透析24h。經(jīng)透析的酶液的鹽離子濃度得到調(diào)節(jié)，便于下面的親和層析純化過程。
[0029]酶液的純化參照N1-NTA Agarose (Qiagen)的方法。將純化得到的蛋白利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，可見重組木聚糖酶在畢赤酵母中得到了表達(dá)，經(jīng)N1-NTA Agarose純化后為二條帶，分子量分別35 kDa and 37.5 kDa，實(shí)際分子量大小比理論分子量大，為糖基化引起。
[0030]實(shí)施例3堿性果膠酸裂解酶PelA的活性分析
果膠酸裂解酶活的測(cè)定方 法:將不加酶的反應(yīng)體系(990 μ L的反應(yīng)液，包含0.2%的聚半乳糖醛酸(PGA)、ρΗΙΟ.0的IOOmM Glycine-NaOH緩沖液)置于60°C恒溫水浴鍋中預(yù)熱5min,加入經(jīng)過適當(dāng)稀釋的0.1mL的純化的堿性果膠酸裂解酶PelA(約Iyg,實(shí)施例2制備)于反應(yīng)液中，反應(yīng)10min后，加入500 mM鹽酸終止液0.5mL終止反應(yīng)，離心，取上清，于235nm處測(cè)其吸光值A(chǔ)235。一個(gè)酶活單位:每分鐘產(chǎn)生I μ mo I不飽和產(chǎn)物所需的酶量。
[0031]I)堿性果膠酸裂解酶PelA的最適pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定
酶的最適pH測(cè)定:將實(shí)施例2純化得到的酶液在60°C下，以PGA為底物，在60°C下分別測(cè)量酶在Glycine-NaOH緩沖液pH9_12和Tris-HCl緩沖液pH7_9中反應(yīng)的活力。結(jié)果如圖2所示，表明PelA的最適pH為10.0。
[0032]pH的耐受性測(cè)定:將純化好的酶液(實(shí)施例2制備)在不同的pH條件下(廣泛緩沖液pH3.0-12.0)4°C保存24小時(shí)，然后在60°C及pH 10.0下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對(duì)照。以PGA為底物，反應(yīng)10min測(cè)定堿性果膠酸裂解酶PelA的酶活。經(jīng)pH4.0-11.0的緩沖液處理24h，酶活剩余80%以上，如圖3所示。
[0033]2)堿性果膠酸裂解酶PelA的最適溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定
酶的最適溫度測(cè)定:以聚半乳糖醛酸(PGA)為底物，ρΗΙΟ.0的Glycine-NaOH為緩沖液，分別在30-70°C的條件下測(cè)活力。酶的熱穩(wěn)定性測(cè)定:將同樣酶量的酶液置于設(shè)定的溫度中(30°〇、401:、501:下)保溫0-60 min，然后放置在冰上。以PGA為底物，在最適溫度和pH下測(cè)它們的剩余活力，以未處理的酶液作為對(duì)照。結(jié)果表明=PelA的最適最適溫度為60°C(圖4)，在40 °C和放置60 min還能保持60%以上的活性(圖5)。
[0034]3)堿性果膠酸裂解酶PelA的動(dòng)力學(xué)常數(shù)的測(cè)定
重組堿性果膠酸裂解酶PelA動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定:動(dòng)力學(xué)常數(shù)(Kmax和尤)的測(cè)定在60°C,pH7.0的條件下，添加不同濃度的聚半乳糖醛酸(PGA) (0.1 -1.5 mg/mL)為底物，不添加或添加外源韓離子條件下，反應(yīng)5min,測(cè)定其活性。數(shù)據(jù)利用Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行非線性回歸分析計(jì)算該酶的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。結(jié)果表明:在60 °C，ρΗΙΟ.Ο，無外源鈣離子的條件下，PelA對(duì)聚半乳糖醒酸的Vmax、足1分別為50.71 U mg'0.681 mg mL—1,而在有外源鈣離子的條件下，二者分別為89.96 U mg—1和0.514 mg mL—1。
[0035]本發(fā)明的堿性果膠酸裂解酶PelA是一種從食用菌草菇中克隆得到的新的果膠裂解酶，其最適溫度為60°C，最適pH為11.0，具有良好的溫度和pH穩(wěn)定性，并且在無外源鈣離子存在下具有高催化活性，因此其在工業(yè)化應(yīng)用中具有良好的應(yīng)用前景。另外其來源為食用菌因此安 全性可靠，可廣泛應(yīng)用于食品，紡織以及造紙等行業(yè)。
【權(quán)利要求】
1.一種堿性果膠酸裂解酶PelA，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.權(quán)利要求1所述堿性果膠酸裂解酶PelA的編碼基因，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
3.含有權(quán)利要求1所述的堿性果膠酸裂解酶PelA的編碼基因的表達(dá)體系。
4.權(quán)利要求3所述的表達(dá)體系在表達(dá)堿性果膠酸裂解酶PelA中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的堿性果膠酸裂解酶PelA在酶解聚半乳糖醛酸中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/81GK103805586SQ201410084597
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】丁少軍, 史愛芹, 鄭斐 申請(qǐng)人:南京林業(yè)大學(xué)