一種具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的構(gòu)建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的構(gòu)建，屬于酶工程領(lǐng)域。通過(guò)把釀酒酵母TDH3啟動(dòng)子序列、酵母分泌信號(hào)肽編碼序列、柚苷酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個(gè)氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列按順序合成，在兩端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，通過(guò)酶切構(gòu)建到pPIC9K質(zhì)粒中，再將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中得到具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株，其生產(chǎn)柚苷酶的回收率達(dá)到92%，發(fā)酵后柚苷酶的酶活達(dá)到5.0U/g濕酵母。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了柚苷酶生產(chǎn)和同步濃縮回收的一步完成，降低了能源消耗，降低了成本，具有較強(qiáng)的實(shí)用性。
【專利說(shuō)明】一種具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的構(gòu)建
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的構(gòu)建。
【背景技術(shù)】
[0003]中國(guó)柑桔的產(chǎn)量?jī)H僅比美國(guó)和巴西低，柑桔的產(chǎn)量排列在世界第三位。利用柑桔生產(chǎn)的果汁飲料具有含糖量高，風(fēng)味清香醇和等特點(diǎn)。而且柑桔果汁具有易于榨取等便于工業(yè)化生產(chǎn)和加工的特點(diǎn)，可以用來(lái)生產(chǎn)果酒等高附加值的產(chǎn)品。但是柑桔果汁常常具有很濃烈的苦味，該苦味大大限制了果汁的利用和產(chǎn)品的推廣。去除苦味的柑桔果汁，才能有更廣闊的市場(chǎng)和利用空間。
[0004]利用柚苷酶可以把果汁中的苦味有效地去除掉。柚苷酶的生產(chǎn)有固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種方法。固體發(fā)酵雖然酶的濃度高，但是其傳質(zhì)和傳熱阻力非常大。傳質(zhì)和傳熱阻力大的固體發(fā)酵，非常不利于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)，因?yàn)槠錅囟群退岫鹊仍诠I(yè)化規(guī)模中不容易控制。
[0005]液體發(fā)酵具有發(fā)酵體積大，易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制等特點(diǎn)，因而液體發(fā)酵在許多產(chǎn)品的生產(chǎn)上體現(xiàn)出巨大優(yōu)勢(shì)。特別是在現(xiàn)在勞動(dòng)力成本上升，國(guó)際大力推進(jìn)機(jī)械化和自動(dòng)化背景下，液體發(fā)酵具有 更廣闊的空間。柚苷酶的生產(chǎn)也有越來(lái)越傾向于液體發(fā)酵。但是液體發(fā)酵生產(chǎn)的酶類產(chǎn)品濃度低。生產(chǎn)的柚苷酶等都游離在發(fā)酵醪液中，為得到高濃度的柚苷酶的固體粉末，需要對(duì)發(fā)酵醪液進(jìn)行濃縮。為純化濃縮纖維素酶往往需要通過(guò)真空蒸發(fā)或噴霧干燥等工藝來(lái)濃縮纖維素酶。在纖維素蒸發(fā)濃縮或噴霧干燥的過(guò)程中，柚苷酶的活性喪失一部分，而且濃縮工藝大幅度提高了纖維素酶的生產(chǎn)成本。在蒸發(fā)或噴霧干燥的過(guò)程中，消耗大量的能源如電或燃?xì)獾取Ｒ虼私档蜐饪s成本，成為降低液體發(fā)酵生產(chǎn)柚苷酶生產(chǎn)成本的必然選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株。
[0007]本發(fā)明的另一目的在于提供用于構(gòu)建上述酵母菌株的DNA片段。
[0008]本發(fā)明的再一目的在于提供用于構(gòu)建上述酵母菌株的質(zhì)粒。
[0009]本發(fā)明的目的還在于提供上述酵母菌株的構(gòu)建方法。
[0010]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
用于構(gòu)建具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段，包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動(dòng)子序列、釀酒酵母分泌信號(hào)肽編碼序列、柚苷酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個(gè)氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列；上述序列分別如SEQID N0.1~5所示。
[0011]優(yōu)選的，所述的用于構(gòu)建具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ ID N0.6所示。
[0012]用于構(gòu)建具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的質(zhì)粒為包含上述DNA片段的真核表達(dá)質(zhì)粒。所述的真核表達(dá)質(zhì)粒優(yōu)選為pPIC9K質(zhì)粒。
[0013]所述的用于構(gòu)建具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的質(zhì)粒通過(guò)包含如下步驟的方法制備得到:合成兩端有限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)含有上述DNA片段的序列，通過(guò)限制性內(nèi)切酶連接到真核表達(dá)質(zhì)粒上。所述的真核表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K質(zhì)粒時(shí)，限制性內(nèi)切酶優(yōu)選為Aat II和Not I。
[0014]一種具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株，含有上述質(zhì)粒。所述的酵母菌株優(yōu)選為酵母菌株SMDl 168。
[0015]所述的具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的構(gòu)建方法，包括如下步驟:制備酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將上述質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)進(jìn)酵母中得到。
[0016]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果:
本發(fā)明的酵母菌株能在生產(chǎn)柚苷酶的同時(shí)，把柚苷酶吸附在菌株自身表面，通過(guò)簡(jiǎn)單過(guò)濾，就能達(dá)到濃縮柚苷酶的目的。
[0017]本發(fā)明大大簡(jiǎn)化了柚苷酶的濃縮工藝，降低了能源消耗，大幅度降低了成本，因此該發(fā)明具有較強(qiáng)的實(shí)用性。
[0018]本發(fā)明把柚苷酶基因在酵母內(nèi)表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)了柚苷酶生產(chǎn)和同步濃縮回收的一步完成，現(xiàn)有技術(shù)未有相關(guān)報(bào)道，具有較高的創(chuàng)新性。
[0019]本發(fā)明酵母菌株生產(chǎn)柚苷酶的回收率達(dá)到92%，發(fā)酵后柚苷酶的酶活達(dá)到5.0 U/g濕酵母。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0021]實(shí)施例1
(l)pPIC9K質(zhì)粒的提取
I)接1%含PPIC9K質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞于2 mL LB培養(yǎng)基。
[0022]2)37 °C振蕩培養(yǎng) 12 h。
[0023]3)取1.5 mL菌液于EP管，以4000 rpm離心3 min,棄上清液。
[0024]4)加 0.1 mL 溶液 I (1% 葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0,25 mM Tris-HCl pH 8.0)充分混合。
[0025]5)加入0.2 mL溶液II (0.2 mM NaOH, 1% SDS),輕輕翻轉(zhuǎn)混勻，置于冰浴5 min。
[0026]6)加入0.15 mL預(yù)冷溶液111(5 mol/L KAc, pH4.8),輕輕翻轉(zhuǎn)混勻,冰浴5 min。
[0027]7)以10000 rpm離心20 min，取上清液于另一新EP管中。
[0028]8)加入等體積的異戊醇，混勻后靜置10 min。
[0029]9)再以 10000 rpm 離心 20 min,棄上清。
[0030]10)用70%乙醇0.5 mL洗滌一次,抽干所有液體。[0031]11)待沉淀干燥后，溶于0.05 mL TE緩沖液中。
[0032](2)大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備
I)將大腸桿菌DH5a置于LB或其他營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基上，在37 °C下過(guò)夜培養(yǎng)。
[0033]2)高溫滅菌大的離心瓶(250~500 mL)以備第二天搖瓶用。
[0034]3)準(zhǔn)備幾瓶滅菌水(總量約1.5升)，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細(xì)胞用。
[0035]4)轉(zhuǎn)移0.2~I mL過(guò)夜培養(yǎng)物至裝有20 mL LB (或其他營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基)的100 mL搖瓶。
[0036]5)37 1:下劇烈振蕩培養(yǎng)6小時(shí)。
[0037]6)監(jiān)控0D600值(培養(yǎng)I小時(shí)后每半小時(shí)測(cè)定一次)。
[0038]7)當(dāng)0D600值達(dá)到0.5~1.0時(shí)，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻15分鐘。
[0039]8)細(xì)胞在4 V 5000g下離心15分鐘，棄上清液。
[0040]9)用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞，先用渦旋儀或吸液管重懸浮細(xì)胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水稀釋至離心管的2/3體積。
[0041]10)照上面步驟重復(fù)離心，小心棄去上清液。
[0042]11)照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細(xì)胞。
[0043]12)離心，棄上清液。
[0044]13)用20 mL滅菌的、冰冷后的10%甘油重懸浮細(xì)胞。
[0045]14)照上面步驟離心，小心棄去上清液(沉淀可能會(huì)很松散)。
[0046]15)用10%甘油重懸浮細(xì)胞至最終體積為2~3 mL。
[0047]16)將細(xì)胞按150 μ L等份裝入微量離心管，于-80 °C保存。
[0048](3) pPIC9K-Naringinase 粒構(gòu)建
I)用限制性內(nèi)切酶Aat II ,Not I分別酶切質(zhì)粒PPIC9K。限制性內(nèi)切酶Aat I1、Not I(TAkaRA)各 1.5 μ?，提取的 pPIC9K 質(zhì)粒溶液 6 μ?, IOXK Buffer I μ? 加入到 100 μ? EP管中，在30 °C水浴鍋中酶切60 min。再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的質(zhì)粒pPIC9K，回收條帶為9.25 kb左右。
[0049]2)序列合成
合成兩端具有Aat II和Not I識(shí)別序列的序列，序列包括CCGACGTC-釀酒酵母TDH3啟動(dòng)子序列-釀酒酵母分泌信號(hào)肽編碼序列-柚苷酶編碼序列-釀酒酵母凝聚因子C端的400個(gè)氨基酸片段編碼序列-釀酒酵母TDH3終止子序列-GCGGCCGCGG，各片段及全長(zhǎng)片段如SEQ ID N0.1~6所示。
[0050]3)連接
合成的堿基序列 20 μ?, Aat I1、Not I (TAkaRA) 12 μ?, IOXK Buffer 加入到 400 μ?EP管中，在30 °C水浴鍋中酶切80 min，酶切后，取序列酶切液15μ?，酶切的pPIC9K質(zhì)粒5μ?, Τ4 DNA ligase (TAkaRa) 5μ?，IOXbuffer 5μ?, ddH20 ΙΟμ?，加入 100 μ? EP 管中，16
°C連接過(guò)夜。
[0051]4)將上述連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α，電轉(zhuǎn)化具體方法如下:
4.1)在冰上解凍大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞添加I~10 μ L連接產(chǎn)物，冰上放置約5分鐘。
[0052]4.2)轉(zhuǎn)移連接產(chǎn)物/細(xì)胞混合物至冷卻后的2mm電穿孔容器中。[0053]4.3)加載電轉(zhuǎn)化儀，準(zhǔn)備好300 yLLB*2XYT。
[0054]4.4)對(duì)電穿孔容器進(jìn)行脈沖(200歐姆，25 μ F，2.5千伏)，檢查時(shí)間常數(shù)，應(yīng)該在3以上。
[0055]4.5)立即添加300 μ L的LB或2ΧΥΤ至電轉(zhuǎn)杯中。
[0056]4.6)37 °C下培養(yǎng)細(xì)胞40分鐘至I小時(shí)以復(fù)蘇。
[0057]4.7)復(fù)蘇后離心棄掉150 μ L上清，剩余150 μ L重懸菌體涂布到含有氨芐(100Kg/mL)的LB或2XYT培養(yǎng)基的固體平板上，于37 °C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0058]5)挑去固體平板上生長(zhǎng)的單克隆，通過(guò)培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用Aat II和FspA I對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒再進(jìn)一步測(cè)序，得到質(zhì)粒pPIC9K-Naringinase。
[0059](4)酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備
1)挑一環(huán)酵母菌(SMD1168)接種于5 mL YEPD培養(yǎng)基中，30 V 250~300 rpm培養(yǎng)過(guò)夜得到一級(jí)種子。
[0060]2)取I mL—級(jí)種子分別接種于兩瓶50 mL YEPD培養(yǎng)基中，30 V 250~300 rpm培養(yǎng)約 16 ~18 h (0D600 約 1.3 ~1.5)。
[0061]3)于4 °C離心收集菌體，用25 mL冰預(yù)冷無(wú)菌水洗滌一次后，細(xì)胞用10 mL冰預(yù)冷無(wú)菌水重懸，可換成較小的離心管。
[0062]4)加入I mL pH 7.5的10XTE緩沖液，搖晃均勻，再加入I mL IOXLiAc,旋轉(zhuǎn)搖勻，于30 1:輕輕搖動(dòng)45 min。
[0063]5)再加入0.4 mL 1mol/L DTT，并同時(shí)旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，于30 °〇輕輕搖動(dòng)15 min。
[0064]6)于4 °C離心，棄上清(用槍吸)，再用25 mL冰預(yù)冷無(wú)菌水洗滌。
[0065]7) 2.5 mL冰預(yù)冷的I mol/L山梨醇洗滌，離心收集菌體，棄上清(用槍吸)。
[0066]8)每管用100 yL I mol/L山梨醇溶解，分裝于3個(gè)EP管中(80 yL/管)，于_70°C冰箱保存。
[0067](5) pPIC9K-Naringinase 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化酵母
1)向酵母感受態(tài)細(xì)胞中加入約5~10 μ g (體積小于10 μ L) pPIC9K_Naringinase質(zhì)粒，用槍吹吸均勻，轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，靜置5min。
[0068]2)擦干電轉(zhuǎn)杯，電擊，電擊參數(shù):1.5 KV，25 yF，200歐姆。
[0069]3)立即加入I mL冰預(yù)冷的I mol/L山梨醇，轉(zhuǎn)移至離心管中，于30 °C靜置lh。
[0070]4)離心，棄上清，加入I mL YEPD后，于30 °C>200 rpm培養(yǎng)2 h。
[0071]5)離心得菌體后，吸除550 μ L上清液，然后取150 μ L涂100 Pg/mL氨芐YETO板于30 °C培養(yǎng)至長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子。
[0072](6)酵母轉(zhuǎn)化子發(fā)酵
挑取的轉(zhuǎn)化子在YEro培養(yǎng)基中30 °C培養(yǎng)24 h，以10%接種量(v/v)接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(酵母浸膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，50 mM檸檬酸緩沖液，麩皮200 g/L，羥甲基纖維素20g/L，l L水)中。發(fā)酵在500 mL搖瓶中發(fā)酵，裝液量為20% (v/v)。在發(fā)酵培養(yǎng)基中培48h0
[0073](7)柚苷酶的回收
發(fā)酵液在離心機(jī)中4000 r/m離心10 min，收集上清(上清中有游離的柚苷酶，用于柚苷酶回收率的計(jì)算)，按酵母沉淀濕重與蒸餾水質(zhì)量比1:10的比例加入蒸餾水，用蒸餾水洗滌兩次，收集酵母沉淀，柚苷酶吸附在酵母表面。
[0074](8)柚苷酶酶活測(cè)定:試管中分別加入2 mL pH 4.0,0.1 M醋酸一醋酸鈉緩沖溶液，2 mL質(zhì)量濃度400 mg/L的柚皮苷溶液，40 °C下保溫5 min，加入預(yù)先稀釋的酶液I mL，保溫10 min，立即用沸水浴滅活10 min，高效液相色譜法測(cè)定剩余柚皮苷的量，通過(guò)計(jì)算可得柚皮苷的減少量。色譜條件:色譜柱為大連依利特C18 Hypersil (250 mmX4.6 mm, 5Ixm);流動(dòng)相為甲醇:5%乙酸溶液(55:45);流速I mL/min ;檢測(cè)波長(zhǎng)283 nm ;柱溫30 °C。
[0075]酶活定義為:在40 °C，pH值4.0條件下，每分鐘分解I Pg柚皮苷的酶量為I U。
[0076]柚苷酶回收率(％)=酵母沉淀吸附的酶活/(上清液的酶活+酵母沉淀吸附的酶活)X 100%O
[0077]經(jīng)過(guò)測(cè)定柚苷酶的回收率達(dá)到92%，發(fā)酵后柚苷酶的酶活達(dá)到5.0 U/g濕酵母。柚苷酶較高的回收率，說(shuō)明在發(fā)酵的時(shí)候，構(gòu)建的酵母能很好的富集濃縮柚苷酶，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵和濃縮的一步完成。
[0078]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都 包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.用于構(gòu)建具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段，其特征在于:包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動(dòng)子序列、釀酒酵母分泌信號(hào)肽編碼序列、柚苷酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個(gè)氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的序列分別如SEQID N0.1~5所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA片段，其特征在于:所述的DNA片段的序列如SEQIDN0.6所示。
4.用于構(gòu)建具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的質(zhì)粒，其特征在于:為包含權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的DNA片段的真核表達(dá)質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒,其特征在于:所述的真核表達(dá)質(zhì)粒為pPIC9K質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒，其特征在于通過(guò)包含如下步驟的方法制備得到:合成兩端有限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)含有權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的DNA片段的序列，通過(guò)限制性內(nèi)切酶連接到真核表達(dá)質(zhì)粒上。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的質(zhì)粒,其特征在于:所述的真核表達(dá)質(zhì)粒為pPIC9K質(zhì)粒時(shí)，限制性內(nèi)切酶為Aat II和Not I。
8.一種具有生產(chǎn)和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株，其特征在于:包含權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的酵母菌株，其特征在于:所述的酵母菌株為酵母菌株SMDl168。
10.權(quán)利要求8或9所述的酵母菌株的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟:制備酵母電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)所述的質(zhì)粒通過(guò)電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)進(jìn)酵母中得到。
【文檔編號(hào)】C12N1/19GK103789332SQ201410084899
【公開(kāi)日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】薛棟升, 陳茂彬, 汪江波 申請(qǐng)人:湖北工業(yè)大學(xué)