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一種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化方法

文檔序號(hào):471369閱讀:244來(lái)源:國(guó)知局
一種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化方法,將分離保存的野生菌株在血平板劃線培養(yǎng),挑單菌落于TSB培養(yǎng)基25℃振蕩培養(yǎng);步驟1:培養(yǎng)6h后接種于新TSB培養(yǎng)基25℃振蕩培養(yǎng),6h傳一代傳至20代;步驟2:取第20代培養(yǎng)物接種于新LTSB培養(yǎng)基35℃振蕩培養(yǎng),6h傳一代傳至40代;取第41代重復(fù)操作步驟1至60代;取第61代重復(fù)操作步驟2至80代;按照上述方法持續(xù)傳代,在傳代過(guò)程中對(duì)菌株的毒力進(jìn)行測(cè)定,傳代直至確定菌株毒力弱化。本發(fā)明具有簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn),應(yīng)用該方法對(duì)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌野生菌株毒力弱化獲得的弱毒株毒力弱、不易返毒,該方法為羅非魚(yú)鏈球菌病弱毒疫苗的開(kāi)發(fā)具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】—種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鏈球菌的毒力弱化方法,具體涉及羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌的毒力弱化方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鏈球菌廣泛存在于自然界、人及動(dòng)物,引起各種化膿性炎癥、猩紅熱、丹毒、新生兒敗血癥、腦膜炎、產(chǎn)褥熱以及鏈球菌變態(tài)反應(yīng)性疾病等。水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物也可感染鏈球菌發(fā)生鏈球菌病,造成大規(guī)模死亡,每年給世界水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨額經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó),每年因鏈球菌病給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成的直接經(jīng)濟(jì)損失約10億美元。羅非魚(yú)是重要的熱帶和亞熱帶水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物,也是鏈球菌感染的主要對(duì)象之一。我國(guó)是羅非魚(yú)養(yǎng)殖第一大國(guó),年產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量50%以上。2001年開(kāi)始,中國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖陸續(xù)出現(xiàn)了鏈球菌病的感染,并在個(gè)別養(yǎng)殖場(chǎng)造成了 30%~50%的高死亡率。2009~2013連續(xù)5年,鏈球菌病在中國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖大面積暴發(fā)流行,發(fā)病區(qū)域逐年擴(kuò)大、發(fā)病率和死亡率逐年遞增,易感羅非魚(yú)規(guī)格范圍逐年擴(kuò)大。按我國(guó)羅非魚(yú)年均產(chǎn)量計(jì)算,估計(jì)每年鏈球菌病給我國(guó)羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失就高達(dá)4億美元。病害的暴發(fā)與隨之帶來(lái)的產(chǎn)品安全問(wèn)題已成為制約羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。目前缺乏一套行之有效的方案預(yù)防和治療該病,藥物只能在早期起到控制病情的輔助性作用,但隨著耐藥和抗藥性的產(chǎn)生和積累,該病的現(xiàn)狀幾乎是“無(wú)藥可治可防”。
`[0003]疫苗免疫是預(yù)防和控制羅非魚(yú)等魚(yú)類鏈球菌病最具前景、安全和環(huán)保的方法之一。自1995年以色列學(xué)者Eldar A報(bào)道通過(guò)免疫接種預(yù)防羅非魚(yú)鏈球菌病(5: difficile)開(kāi)始,美國(guó)(Klesius 等,1999 ;Pridgeon 等,2011)、中國(guó)(Sun 等,2010)、日本(Dumrongphol等,2009)和韓國(guó)(Shin等,2007)等國(guó)家多個(gè)實(shí)驗(yàn)室先后開(kāi)展了羅非魚(yú)鏈球菌病滅活疫苗的研究,并在試驗(yàn)室取得很好的免疫效果。但由于滅活疫苗免疫途徑不便和免疫保護(hù)期較短等問(wèn)題,研制的羅非魚(yú)鏈球菌病滅活疫苗一直未能在生產(chǎn)上推廣使用。弱毒疫苗具有免疫劑量低、免疫效果好、保護(hù)期長(zhǎng)等特點(diǎn),弱毒疫苗的開(kāi)發(fā)對(duì)羅非魚(yú)鏈球菌病的免疫防控具有重要作用。美國(guó)Pridgeon等通過(guò)抗生素篩選方法分別獲得了海豚鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌的弱毒菌株,并證明了弱毒疫苗安全可行。弱毒株的獲取是弱毒疫苗開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵,傳代培養(yǎng)是進(jìn)行菌株毒力弱化的重要方法,但利用溫差傳代快速培養(yǎng)法對(duì)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化獲得羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌弱毒株的方法還未見(jiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌病疫苗開(kāi)發(fā)及應(yīng)用存在的困難,本發(fā)明主要解決的問(wèn)題是提供一種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化方法,獲得羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌弱毒株,用于羅非魚(yú)鏈球菌病弱毒疫苗開(kāi)發(fā)。
[0005]本發(fā)明技術(shù)內(nèi)容為羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化方法,包括:(一)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌的溫差傳代快速培養(yǎng);(二)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌弱毒株毒力測(cè)定;(三)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌弱毒株返毒安全性測(cè)定;(四)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌弱毒株生長(zhǎng)狀態(tài)測(cè)定;(五)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌弱毒株的PCR和生化鑒定。
[0006](一)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌的溫差傳代快速培養(yǎng)
采用溫差傳代快速培養(yǎng)法。首先將分離保存的野生毒株在血平板劃線培養(yǎng),挑單菌落于胰豆蛋白胨液體培養(yǎng)基TSB培養(yǎng);步驟1:培養(yǎng)6 h后接種于新TSB培養(yǎng)基25 °C振蕩培養(yǎng),6 h傳一代傳至20代;步驟2:取第20代培養(yǎng)物接種于低營(yíng)養(yǎng)胰豆蛋白胨液體培養(yǎng)基LTSB 35 °C振蕩培養(yǎng),6 h傳一代傳至40代;取第41代重復(fù)操作步驟I直至傳代至60代;取第61代重復(fù)操作步驟2直至傳代至80代;按照上述方法持續(xù)進(jìn)行傳代,在傳代過(guò)程中對(duì)菌株的毒力進(jìn)行測(cè)定,傳代直至確定菌株毒力弱化。
[0007](二)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌弱力弱化株毒力測(cè)定
使用毒力弱化后的羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌菌株分別對(duì)試驗(yàn)羅非魚(yú)進(jìn)行腹腔注射感染和拌料投喂口服感染,均不能造成羅非魚(yú)感染發(fā)病或死亡。
[0008](三)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌弱毒株返毒安全性測(cè)定
使用弱毒株培養(yǎng)菌液感染羅非魚(yú)后將肝臟組織在研缽中勻漿,加PBS稀釋后再腹腔注射試驗(yàn)羅非魚(yú)進(jìn)行攻毒感染,如此將弱毒株在羅非魚(yú)體內(nèi)連續(xù)傳代,均不能造成羅非魚(yú)發(fā)病或死亡,表明弱毒株在羅非魚(yú)體內(nèi)不易返毒,應(yīng)用該弱毒株開(kāi)發(fā)疫苗具有較高安全性。
[0009](四)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌弱毒株的生長(zhǎng)觀察
分別將羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化前的原始野生菌株和弱毒株劃線血平板培養(yǎng),觀察弱毒株的生長(zhǎng)狀態(tài)。采用革蘭氏染色方法對(duì)野生強(qiáng)毒株和弱毒株進(jìn)行染色,使用顯微鏡比較觀察原始野生菌株和弱毒菌株的顯微形態(tài)。
[0010](五)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌弱毒株的PCR和生化鑒定
采用羅非魚(yú)鏈球菌PCR鑒定方法和API 20 Str印生化條和VITEK 2全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化前的原始野生菌株和弱毒菌株進(jìn)行鑒定。
[0011]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比其特點(diǎn)在于:
1、本發(fā)明采用溫差傳代快速培養(yǎng)對(duì)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力進(jìn)行弱化,通過(guò)毒力測(cè)定、生長(zhǎng)特性觀察、PCR和生化鑒定,證實(shí)溫差傳代快速培養(yǎng)可對(duì)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力進(jìn)行弱化。
[0012]2、通過(guò)本發(fā)明技術(shù),每天對(duì)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌菌株傳4代,可較快的對(duì)羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌強(qiáng)菌株毒力進(jìn)行致弱,獲得用于弱毒疫苗研發(fā)的弱毒株。
[0013]本發(fā)明在一般的實(shí)驗(yàn)室即可操作進(jìn)行,細(xì)菌培養(yǎng)6 h傳一代,具有簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn),應(yīng)用該方法對(duì)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌野生菌株毒力弱化獲得的弱毒株具有毒力弱、不易返毒等特點(diǎn),該方法為羅非魚(yú)鏈球菌病弱毒疫苗的開(kāi)發(fā)具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1:羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化前原始野生強(qiáng)毒株和致弱菌株培養(yǎng)和革蘭氏染色比較。
[0015]圖2:1 - 8泳道分別為:海 豚鏈球菌(ATCC29178)和無(wú)乳鏈球菌(ATCC27956)、海豚鏈球菌(ATCC29178)、無(wú)乳鏈球菌(ATCC27956)、停乳鏈球菌(NCTC4335S)、副乳房炎鏈球菌(MCCCA01039)、格氏乳球菌(MCCCA07812)的標(biāo)準(zhǔn)菌株,原始野生強(qiáng)毒株,致弱株;M表示DL 2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn),從上到下分子量分別為2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250bp 和 100 bp ο
[0016]圖3:羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌原始野生強(qiáng)毒株和致弱菌株生化鑒定結(jié)果比較圖,圖中方框標(biāo)注為差異生化指標(biāo)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]采用本發(fā)明建立的毒力弱化方法對(duì)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌野生型強(qiáng)毒株HN016進(jìn)行毒力弱化為例,詳細(xì)說(shuō)明羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌的毒力弱化方法,具體實(shí)施時(shí)不受實(shí)施例限制。本方法中所使用技術(shù)術(shù)語(yǔ),除非另有說(shuō)明,一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可理解含義。
[0018]實(shí)施例1本發(fā)明使用的培養(yǎng)基
胰豆蛋白胨液體培養(yǎng)基(TSB):胰蛋白胨17.0 g/L,大豆蛋白胨5.0 g/L, NaCl 5.0 g/L,葡萄糖 2.5 g/L,蒸懼水 1000 mL,調(diào) pH 7.2-7.4,121。(!'高壓滅菌 20 min。
[0019]低營(yíng)養(yǎng)胰豆蛋白胨液體培養(yǎng)基(LTSB):胰蛋白胨9.0 g/L,大豆蛋白胨2.5 g/L,NaCl 5.0 g/L,葡萄糖 2.5 g/L,蒸餾水 1000 mL,調(diào) pH 7.2-7.4,121 1:高壓滅菌 20 min。
[0020]實(shí)施例2羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌野生強(qiáng)毒株HN016的溫差傳代快速培養(yǎng)
羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌野生毒株分離:使用細(xì)菌接種環(huán)對(duì)大規(guī)模發(fā)病養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病羅非魚(yú)腦、肝、腎、脾或鰭部進(jìn)行細(xì)菌血平板劃接種分離,28°C培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于TSB液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)24 h,鏡檢無(wú)污染后,進(jìn)行毒力測(cè)定及PCR診斷。確定為無(wú)乳鏈球菌后將菌液和甘油按4:1比例(V/V)充分混勻,_80°C冷凍保存。
`[0021]將_80°C保存的野生強(qiáng)毒株HN016 (LD50=7.08X IO3 CFU/尾)在血平板劃線培養(yǎng),挑單菌落于裝有20 mL TSB培養(yǎng)基的50 mL培養(yǎng)管25 °C振蕩培養(yǎng)。步驟1:培養(yǎng)6 h后取
0.25 mL接種于一個(gè)新的裝有20 mL TSB培養(yǎng)基的50 mL培養(yǎng)管25 °C振蕩培養(yǎng),6 h傳一代,重復(fù)操作步驟I直至傳代至20代;步驟2:取第20代培養(yǎng)物0.25 mL接種于一個(gè)新的裝有20 mL LTSB培養(yǎng)基的50 mL培養(yǎng)管35 °C振蕩培養(yǎng),6 h傳一代,重復(fù)操作步驟2直至傳代至40代;取第41代重復(fù)操作步驟I直至傳代至60代;取第61代重復(fù)操作步驟2直至傳代至80代;按照上述方法持續(xù)進(jìn)行傳代直至菌株毒力弱化。初代菌株和每傳80代菌株均進(jìn)行毒力檢測(cè):高劑量(IO8 CFU/尾)注射感染健康羅非魚(yú),每組20尾,設(shè)三個(gè)重復(fù)組,注射感染后持續(xù)觀察記錄30天,無(wú)羅非魚(yú)發(fā)病或死亡,30天后所有羅非魚(yú)細(xì)菌分離未檢測(cè)到無(wú)乳鏈球菌,說(shuō)明菌株已不能感染羅非魚(yú)發(fā)病或死亡即鑒定為羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化株。如表1所示,按上述方法進(jìn)行傳代致弱,初代羅非魚(yú)無(wú)乳鏈球菌具有極強(qiáng)的感染致死率,當(dāng)傳代至720代,毒力顯著降低,傳代至800代以后高劑量腹腔注射也不能引起羅非魚(yú)感染發(fā)病或死亡。
[0022]采用本發(fā)明的方法對(duì)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌野生強(qiáng)毒株HN016進(jìn)行溫差傳代快速培養(yǎng),可對(duì)羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌野生強(qiáng)毒株的毒力進(jìn)行弱化,證明了本發(fā)明技術(shù)方法的可行。
[0023]表1初代菌株和每傳80代菌株毒力檢測(cè)
組別I初代 |80 |160 |240 |320 丨400 丨480 丨560 丨640 丨720 |800丨820丨840
組 I 死亡率(%)IlOO |90.0 |θ5.0 |85.0 ΙθΟ.0 |85.0 |θ5.0 卜5.0 |50.0 |30.0 |θ |θ |θ
【權(quán)利要求】
1.一種羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化方法,其特征在于采用溫差傳代快速培養(yǎng)法,即首先將分離保存的野生毒株在血平板上劃線培養(yǎng)細(xì)菌,挑單菌落于胰豆蛋白胨液體培養(yǎng)基TSB培養(yǎng);步驟1:培養(yǎng)6 h后接種于新TSB培養(yǎng)基25 °C振蕩培養(yǎng),6 h傳一代傳至20代;步驟2:取第20代培養(yǎng)物接種于低營(yíng)養(yǎng)胰豆蛋白胨液體培養(yǎng)基LTSB 35 °C振蕩培養(yǎng),6 h傳一代傳至40代;取第41代重復(fù)操作步驟I直至傳代至60代;取第61代重復(fù)操作步驟2直至傳代至80代;按照上述方法持續(xù)進(jìn)行傳代,在傳代過(guò)程中對(duì)菌株的毒力進(jìn)行測(cè)定,傳代直至確定菌株毒力弱化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化方法,其特征在于:所述的胰豆蛋白胨液體培養(yǎng)基TSB的配方為:胰蛋白胨17.0 g/L,大豆蛋白胨5.0 g/L,NaCl 5.0g/L,葡萄糖 2.5 g/L,蒸懼水 1000 mL,調(diào) pH 7.2-7.4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的羅非魚(yú)源無(wú)乳鏈球菌毒力弱化方法,其特征在于:所述的低營(yíng)養(yǎng)胰豆蛋白胨液體培養(yǎng)基LTSB的配方為:胰蛋白胨9.0 g/L,大豆蛋白胨2.5 g/L,NaCl 5.0 g/L,葡萄糖 2 .5 g/L,蒸餾水 1000 mL,調(diào) pH 7.2_7.4。
【文檔編號(hào)】C12N1/36GK103881959SQ201410087094
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月18日
【發(fā)明者】李莉萍, 王瑞, 陳明, 甘西, 梁萬(wàn)文, 黃婷, 朱佳杰, 雷愛(ài)瑩, 李健, 陳福艷 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)科學(xué)研究院
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