一種幽門螺桿菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種幽門螺桿菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐劑。本發(fā)明的幽門螺桿菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐劑，其活性成分是一條多肽鏈，主要是由鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白Flic的D0和D1區(qū)與幽門螺桿菌鞭毛蛋白FlaA的D2和D3區(qū)構(gòu)成。該蛋白佐劑的核苷酸序列是由PCR技術(shù)合成的，并利用表達(dá)載體在大腸桿菌中表達(dá)，經(jīng)蛋白純化后，得到該佐劑蛋白。
【專利說明】一種幽門螺桿菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及到一種幽門螺桿菌(Hp)多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白的設(shè)計(jì)、構(gòu)建和制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鞭毛蛋白是細(xì)菌鞭毛的主要組成蛋白，根據(jù)鞭毛蛋白基因結(jié)構(gòu)與功能將鞭毛蛋白分為四個區(qū)域，即高度保守的N-末端和C-末端(DO，Dl區(qū))和高度變異的中間部分(D2，D3區(qū))，這些復(fù)雜的表面復(fù)合物與細(xì)菌運(yùn)動有關(guān)，同時(shí)也與誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答相關(guān)聯(lián)。機(jī)體對外來抗原物質(zhì)如對病原微生物的識別是由細(xì)胞的特定受體介導(dǎo)的。目前已證實(shí)，這一識別主要是通過細(xì)胞表面的Toll樣受體(Toll-like receptor, TLRs)家族分子來實(shí)現(xiàn)的。TLRs可識別病原微生物高度保守的結(jié)構(gòu)基序，即所謂的病原相關(guān)分子模式(pathogenassociated molecular patterns, PAMPs),并誘導(dǎo)產(chǎn)生天然免疫應(yīng)答。特定的TLRs可以識別相應(yīng)的PAMPs，其中鞭毛蛋白高度保守的D0，Dl區(qū)能以配體受體識別的方式激活表達(dá)TLR5受體的APC，如樹突狀細(xì)胞(DC)，巨噬細(xì)胞以及腸上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)分泌前炎性因子及細(xì)胞因子，進(jìn)而介導(dǎo)激活T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答；而高度變異的D2，D3區(qū)的抗原性能刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的免疫反應(yīng)；細(xì)菌鞭毛蛋白作為佐劑不僅可使機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液和細(xì)胞免疫，越來越多的研究顯示鞭毛蛋白還能通過TLR5受體調(diào)節(jié)黏膜免疫反應(yīng)。細(xì)菌鞭毛蛋白與TLR5受體結(jié)合后，主要是通過髓樣分化因子MyD88激活白介素受體相關(guān)激酶(IRAK4)和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)，TRAF6被磷酸纖維素化后，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化因子β活化激酶I (TAKl)和促分裂原活化蛋白酶ΜΚΚ6，激活下游的NF- κ B、JNK和促分裂原活化蛋白激酶(ΜΑΡΚ)ρ38信號通路，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子如IL-6、IL-12及TNF-α等基因的表達(dá)。目前，鞭毛蛋白已作為一種 有效的免疫佐劑用于各類疫苗的研究中，如尿道致病性大腸埃希菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC),抗鼠疫(耶爾森氏)桿菌(Yersinia Pestis)、痕原蟲(Plasmodium falciparum)、破傷風(fēng)梭菌(Clostridium tetani)、西尼羅病毒(WestNile viruses)等疫苗的研究。
[0003]Hp中的鞭毛蛋白在Hp的定植過程中起著至關(guān)重要的作用，能夠通過擺動提供動力，幫助Hp穿過黏液層，到達(dá)胃上皮表面適合其生存的微氧環(huán)境，是影響Hp定植及感染持續(xù)存在的重要因素。但是，由于Hp鞭毛蛋白因其結(jié)構(gòu)特殊性，雖然能引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體反應(yīng)，卻不能被APC上的TLR5識別，刺激機(jī)體產(chǎn)生有效的黏膜免疫應(yīng)答，從而逃避了機(jī)體的免疫監(jiān)督形成持續(xù)感染。
[0004]如何解決Hp鞭毛蛋白不能有效調(diào)節(jié)黏膜免疫的問題以及能否改造Hp鞭毛蛋白使其做為Hp疫苗的生物佐劑，使其既能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫，又能調(diào)節(jié)黏膜免疫反應(yīng)，有效清除Hp胃黏膜感染，抑制Hp胃部定植，增強(qiáng)疫苗治療Hp感染的效果，成為Hp疫苗研究的一個新的思路。根據(jù)國內(nèi)外研究報(bào)道，鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白Flic高度保守的D0，Dl區(qū)能以配體受體識別的方式激活TLR5，調(diào)控TNF-a、IL_6和IL-12等促炎細(xì)胞因子的合成，具有很好的免疫佐劑功效，已經(jīng)應(yīng)用于流感疫苗、雞瘟疫苗等病原體疫苗研究中，其中與Flic融合表達(dá)的兩個流感病毒疫苗已經(jīng)進(jìn)入II期臨床實(shí)驗(yàn)
[0005]本發(fā)明的思路如下:依據(jù)鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白Flic和Hp鞭毛蛋白FlaA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和免疫學(xué)效果，通過生物信息學(xué)軟件分析，選擇了能特異性激活TLR-5的鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白Flic的DO和Dl區(qū)域與Hp鞭毛蛋白FlaA的D2，D3區(qū)域，設(shè)計(jì)出了一種Hp多表位疫苗的嵌合鞭毛蛋白佐劑CF，該嵌合鞭毛蛋白佐劑結(jié)構(gòu)新穎，功能獨(dú)特。通過密碼子優(yōu)化、基因合成和基因克隆等技術(shù)，成功構(gòu)建了 CF，通過原核表達(dá)和蛋白純化等技術(shù)，獲得了純化蛋白CF。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的第一個方面是提供了一種幽門螺桿菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐劑。
[0007]本發(fā)明的第二個方面是提供了該幽門螺桿菌多表位疫苗的嵌合鞭毛蛋白的制備方法。
[0008]本發(fā)明的第一個方面是提供了一種幽門螺桿菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐劑CF。該嵌合鞭毛蛋白CF主要由鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白Flic的DO和Dl區(qū)域與Hp鞭毛蛋白FlaA的D2和D3區(qū)域嵌合構(gòu)成，具有以下優(yōu)點(diǎn):(I)鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白Flic高度保守的DO和Dl區(qū)能以配體受體識別的方式激活表達(dá)TLR5受體的APC，如樹突狀細(xì)胞(DC)，巨噬細(xì)胞以及腸上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)分泌前炎性因子及細(xì)胞因子，進(jìn)而介導(dǎo)激活T細(xì)胞和B細(xì)胞應(yīng)答。(2)天然的鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白Flic可以激活TLR5介導(dǎo)的黏膜免疫應(yīng)答，但不能產(chǎn)生針對Hp鞭毛蛋白FlaA的特異性抗體。本發(fā)明的嵌合鞭毛蛋白CF既保留鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白Flic可以刺激TLR5能力，又可以激發(fā)針對Hp鞭毛蛋白FlaA的特異性抗體。
[0009]本發(fā)明的第二個方面是提供了幽門螺桿菌多表位疫苗的嵌合鞭毛蛋白CF的制備方法，其技術(shù)路線簡述如下:
[0010](I)嵌合鞭毛蛋白CF分子的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
[0011]在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找幽門螺桿菌26695鞭毛蛋白FlaA的D2、D3區(qū)域的核苷酸序列以及腸炎沙門氏菌鞭毛蛋白Flic (GenBank:AE027871.1)的D0、D1區(qū)的核苷酸序列，通過生物信息學(xué)軟件對Flic的DO區(qū)、Dl區(qū)與FlaA的D2-D3的間隔序列，加以分析和確定，設(shè)計(jì)一個具有科學(xué)合理結(jié)構(gòu)的嵌合鞭毛蛋白。
[0012](2)重組表達(dá)質(zhì)粒pETCF (含有嵌合基因CF)的構(gòu)建
[0013]將所設(shè)計(jì)的嵌合鞭毛蛋白CF的基因序列送至基因合成公司進(jìn)行密碼子的優(yōu)化并合成，利用基因克隆技術(shù)將CF基因克隆至pET28a載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pETCF。
[0014](3)嵌合鞭毛蛋白CF的原核表達(dá)及純化
[0015]將重組表達(dá)載體pETCF轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌BL21(DE3)中，構(gòu)建重組基因工程菌株BL21(DE3)/pETCF。利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，并通過HisTrap? FF crude鎳離子親和層析和DEAESepharose FF陰離子交換層析能夠獲得高純度嵌合鞭毛蛋白CF。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1:嵌合鞭毛蛋白CF的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特點(diǎn)。[0017]圖2:重組表達(dá)載體pETCF的質(zhì)粒圖譜。
[0018]Nco I和Xho I之間為插入的嵌合基因CF ;
[0019]圖3:嵌合鞭毛蛋白CF的原核蛋白表達(dá)。
[0020]1:未加IPTG誘導(dǎo)的pET28a空載；2:加IPTG誘導(dǎo)的pET28a空載；3:未加IPTG誘導(dǎo)的pETCF ；4:加IPTG誘導(dǎo)的pETCF ；
[0021]圖4:嵌合鞭毛蛋白CF的HisTrap? FF crude鎳離子親和層析純化。
[0022]1-6:20mM咪洗脫下的雜蛋白和部分目的蛋白；7_11:30mM咪唑洗脫的目的蛋白CF ; 12-16:40mM咪唑洗脫下的部分目的蛋白CF和雜志蛋白；17-22:50mM咪洗脫下的雜蛋白；23-27:500mM咪洗脫下的雜蛋白；
【具體實(shí)施方式】
[0023]材料
[0024]1.1PTG溶液:稱取1.2g IPTG置于50ml離心管中，加入40ml無菌水，充分混勻溶解后，定容至50ml。用0.22 μ m濾器過濾除菌，小份分裝，_20°C保存。
[0025]2.卡那霉素(Kan) I&液(50mg/mL):稱取50mg卡那霉素(Kan)溶于ImL無菌水，制得濃度為50mg/mL的貯存液，通過0.22 μ m細(xì)菌濾器過濾除菌，溶液分裝保存于_20°C冰箱中。
[0026]3.培養(yǎng)基:(I)LB液體培養(yǎng)基:稱取IOg胰蛋白胨、5g酵母提取物和5gNaCl，加蒸餾水至1000ml，調(diào)整pH至7`.4，高壓蒸氣滅菌。(2) LB固體培養(yǎng)基:1.5g瓊脂粉/100ml LB培養(yǎng)液，高壓滅菌后，傾倒平板。
[0027]4.DNA 電泳緩沖液(50x TAE):稱取 242g Tris,37.2g Na2EDTA.2Η20 和 57.1ml 冰乙酸，加水至1000ml，使用時(shí)稀釋50倍。
[0028]5.SDS-PAGE電泳緩沖液(5X):稱取Tris粉末15.lg、甘氨酸94g、SDS5.0g ;加入約800ml的去離子水，攪拌溶解；加去離子水定容至1L，室溫保存；注意:加水時(shí)應(yīng)讓水延著壁緩緩流下，以避免由于SDS的原因產(chǎn)生很多泡沫。
[0029]6.考馬斯亮藍(lán)蛋白染色試劑:(I)考馬斯亮藍(lán)G-250染液(蛋白質(zhì)定量用)--考馬斯亮藍(lán)G-250IOOmg溶解在50ml95%乙醇中，然后加入86%磷酸100ml，用蒸餾水稀釋至1000ml。(2)考馬斯亮藍(lán)R-250染液:0.29g考馬斯亮藍(lán)R-250溶解在250ml脫色液中。(3)固定液:500ml乙醇、100mL冰醋酸用蒸餾水稀釋至1000ml。(4)脫色液:250ml乙醇、80ml冰醋酸用蒸餾水稀釋至1000ml。(5)保存液:25ml87%甘油溶于225ml脫色液中。
[0030]實(shí)例1:新型嵌合鞭毛蛋白CF的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)
[0031]在GenBank數(shù)據(jù)庫中查找鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白Flic (GenBank:AE027871.1)的DO、Dl區(qū)的核苷酸序列和幽門螺桿菌26695鞭毛蛋白FlaA的D2、D3區(qū)的核苷酸序列，其中Flic的DO區(qū)對應(yīng)的的核苷酸序列為I~426，F(xiàn)lic的Dl區(qū)對應(yīng)的的核苷酸序列為1255~1515，F(xiàn)laA的D2-D3區(qū)對應(yīng)的核苷酸序列為559~909。
[0032]經(jīng)過生物信息學(xué)軟件DNAstar分析，間隔序列(GGGGS)易形成轉(zhuǎn)角和β _折疊，不易形成α -螺旋，為柔性結(jié)構(gòu)，能有效間隔開Flic/D0、FlaA/D2-D3和Flic/Dl，有利于幽門螺桿菌鞭毛蛋白FlaA抗原表位的有效呈遞且表現(xiàn)出較高的復(fù)性效率。
[0033]結(jié)果:嵌合鞭毛蛋白CF的分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)特點(diǎn)和思路如圖1所示。[0034]實(shí)例2:重組表達(dá)載體pETCF (含有嵌合基因CF)的構(gòu)建
[0035]將所設(shè)計(jì)的嵌合鞭毛蛋白CF的基因序列送交南京思普金生物有限公司進(jìn)行密碼子的優(yōu)化并全基因合成，并克隆至pET28a中。
[0036]結(jié)果:思普金生物有限公司采用T7啟動子和終止子通用引物進(jìn)行基因測序，證明PCR合成的pETCF中嵌合基因CF的核苷酸序列完全正確，且無移碼突變。重組表達(dá)載體pETCF的質(zhì)粒圖譜如(圖2)所示。
[0037]實(shí)例3:嵌合鞭毛蛋白的原核表達(dá)
[0038]將思普金生物有限公司合成的重組質(zhì)粒pETCF轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli BL21 (DE3)菌株中。在預(yù)先制備好的含50 μ g/mL Kan的LB平板上，接種環(huán)劃線基因工程菌株BL21 (DE3) /pETCF，倒置于37°C培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)12~16h后，挑取單個菌落，接種于含50 μ g/mL Kan的LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm，培養(yǎng)12~16h。送至思普金生物有限公司進(jìn)行序列測定。
[0039]將測序正確的菌種以2%接種量接種于含50μ g/mL Kan LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm振蕩過夜，次日晨再將該菌液以I %接種量接種于含50 μ g/mL Kan的LB液體培養(yǎng)基中，370C，180rpm搖瓶3h (0D值在0.6~0.8)，加入IPTG使終濃度達(dá)到0.5mmol/L, 16°C，180rpm誘導(dǎo)表達(dá)，以空載體菌BL21 (DE3)/pET28a作為陰性對照。
[0040]結(jié)果:將基因工程重組菌株BL21(DE3)/pETCF在PH值為7、IPTG濃度為0.5mmol/L、誘導(dǎo)溫度18°C、誘導(dǎo)時(shí)間為IOh的情況下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。與對照菌株對比，基因工程重組菌株BL21(DE3)/pETCF在約33KD處出現(xiàn)目的蛋白條帶，與嵌合鞭毛蛋白CF的理論大小相符合(圖3)。嵌合鞭毛蛋白 在可溶性蛋白和包涵體蛋白中都有存在。
[0041 ] 實(shí)例4:嵌合鞭毛蛋白CF的純化
[0042](I)HisTrap? FF crude鎳離子親和層析柱的純化
[0043]向裝填好的HisTrap? FF crude柱中加入適量的去離子水將乙醇沖洗干凈后，加入8倍柱體積的Binding buffer平衡，平衡結(jié)束后即可上樣。收集菌體后，每IOOmg菌體加入l-5mlBinding Buffer，超聲裂解菌體。將菌體裂解液負(fù)載上柱，流速為10倍柱體積/小時(shí)；使用15倍柱體積的Wash buffer沖洗柱子,收集流穿峰；使用5倍柱體積的ElutionBuffer洗脫，收集洗脫峰；依次使用3倍柱體積的Binding Buffer和5倍柱體積的去離子水洗滌后，用3倍柱體積的20%乙醇平衡(乙醇要將填料浸沒)，4°C保存。
[0044]結(jié)果:經(jīng)HisTrap? FF crude鎳離子親和層析柱的純化后，收集的各個蛋白峰進(jìn)行SDS-PAGE分析，可以發(fā)現(xiàn)嵌合鞭毛蛋白CF集中在30mM咪唑洗脫產(chǎn)生的蛋白峰(圖4)。
[0045](2)陰離子交換層析(Sepharose FF)的純化
[0046]Sepharose FF陰離子交換層析方法:用離子交換層析緩沖液A平衡DEAESepharose FF離子交換層析柱。將經(jīng)過HisTrap? FF crude親和層析一級純化后的蛋白樣品以10ml/min流速上樣DEAE Sepharose FF陰離子交換層析柱；用離子交換層析緩沖液B洗脫蛋白；洗脫方式:連續(xù)梯度洗脫40min，收集目的蛋白峰。
[0047]結(jié)果:經(jīng)Sepharose FF陰離子交換層析純化,收集的各個蛋白峰進(jìn)行SDS-PAGE分析，嵌合鞭毛蛋白CF主要集中在用0.5MNaCl的磷酸鹽緩沖溶液洗脫下的蛋白峰中。
【權(quán)利要求】
1.一種幽門螺桿菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐劑，其活性成分是一條多肽，主要由鼠傷寒沙門菌鞭毛蛋白FliC的DO和Dl區(qū)與幽門螺桿菌鞭毛蛋白FlaA的D2和D3區(qū)構(gòu)成，其氨基酸序列如序列I所示。
2.如權(quán)利要求1所述，一種幽門螺桿菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐劑，其天然核苷酸序列如序列2所示，經(jīng)密碼子優(yōu)化的核苷酸序列如序列3所示。
3.包含權(quán)利要求2中所述的核苷酸序列的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌。
4.如權(quán)利要求1所述，一種幽門螺桿菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐劑，其特征為在Flic/D0、FlaA/D2-D3和Flic/Dl之間的間隔氨基酸序列為GGGGS。
5.一種幽門螺桿菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐劑的制備方法，經(jīng)密碼子優(yōu)化，通過PCR技術(shù)合成嵌合鞭毛蛋白CF的核苷酸序列，并構(gòu)建含有該核苷酸序列的重組表達(dá)載體pETCF及其重組基因工程菌。重組基因工程菌株發(fā)酵后，利用蛋白質(zhì)純化技術(shù)獲得該嵌合鞭毛蛋白佐劑。
6.按照權(quán)利I和5所述的幽門螺桿菌多表位疫苗的新型嵌合鞭毛蛋白佐劑，其特征在于能夠激活TLR5的同時(shí)具 有刺激機(jī)體產(chǎn)生針對幽門螺桿菌鞭毛蛋白FlaA的特異性抗體。
【文檔編號】C12N15/70GK103861101SQ201410088031
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月12日
【發(fā)明者】奚濤, 邢瑩瑩, 宋輝, 陸園園, 呂小波 申請人:中國藥科大學(xué)