一種檢測多子小瓜子的引物、試劑盒及其方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種檢測多子小瓜子的引物、試劑盒及其方法。所述引物序列為由SEQ?ID?NO:1-4的4條序列組成。本發(fā)明還保護(hù)其試劑盒和方法。應(yīng)用此引物進(jìn)行LAMP快速檢測，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，檢測時間短，1小時左右可獲得檢測結(jié)果，比普通PCR檢測縮短2～4h。操作簡單、結(jié)果明顯，整個檢測過程不涉及復(fù)雜儀器和設(shè)備，一般技術(shù)人員即可完成檢測，結(jié)果容易辨別，通過不同顏色，肉眼即可觀察結(jié)果，不需要繁瑣的電泳和紫外觀察，安全。
【專利說明】—種檢測多子小瓜子的引物、試劑盒及其方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體的涉及一種檢測多子小瓜子的引物、試劑盒及其方法。
【背景技術(shù)】
[0002]寄生于淡水魚類的多子小瓜蟲屬于原生動物門(Portozea),纖毛綱(Ciliata),膜口目(Holotricha),凹口科(Ophryoglenidae),小瓜蟲屬{Ichthyophthirius)。目前僅多子小瓜蟲一種(/.小瓜蟲分布在熱帶、亞熱帶和溫帶地區(qū)，向北可以一直延伸到北極圈。
[0003]PCR檢測技術(shù)是根據(jù)生物體的特異的基因片段，對生物體進(jìn)行檢測鑒定的技術(shù)。該方法已經(jīng)在人類和動植物的病原檢測中廣泛應(yīng)用，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、方便快捷的諸多優(yōu)點。Sun等(2006)報告了應(yīng)用特異引物對擴(kuò)增多子小瓜蟲部分ITS-1序列，完整5.8SrDNA序列，以及部分ITS-2序列的PCR方法。該方法使用的正向引物序列為5’ -GTA CTTTAT TTA GGA GGA GGA CT-3’，反向引物序列為 5’ -TGT TTA ACG AGA GAA AAT CAT AAAT-3’，能特異性擴(kuò)增326 bp左右的目標(biāo)片段，結(jié)合產(chǎn)物測序，可以對多子小瓜蟲進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。
[0004]實時熒光PCR方法因減少了污染環(huán)節(jié)，PCR檢測和結(jié)果判定一步完成，比普通PCR更靈敏和快捷，還適合高通量檢測，因此在病原檢測領(lǐng)域取得了廣泛應(yīng)用。Olivier(2005)報道了 SYBR Green熒光PCR法檢測游離在水體中的多子小瓜蟲的檢測技術(shù)。該方法以多子小瓜蟲18 S rDNA基因中位于455-647堿基之間的序列設(shè)計引物頂RH5’ -AGTGACAAGAAATAGCAAGCCAGGAG-3’ 和 MRrl 5’ -ACCCAGCTAAATAGGCAGAAGTTCAA-3’，不僅可以對多子小瓜蟲的感染進(jìn)行定量分析，還可以在避免損傷魚體的情況下達(dá)到檢測的目的。
[0005]以PCR為基礎(chǔ)的分子鑒定方法克服了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定上的缺陷，但在應(yīng)用過程中人們發(fā)現(xiàn)PCR技術(shù)存在一些不足，如靶基因易被污染，可能引起非特異性擴(kuò)增，多種因素可以產(chǎn)生抑制擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)時間較長，一般需要幾小時，需要比較昂貴的PCR儀，不利于在基層實驗室推廣應(yīng)用等。2000年，日本學(xué)者Notomi等(Loop-mediated isothermalamplification of DNA [J].Nucleic Acids Research, 2000, 28:E63)建立了一種新的
核酸擴(kuò)增方法-環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)
技術(shù)，LAMP技術(shù)是采用針對靶基因的6個特異部位設(shè)定的4條特異性引物(內(nèi)引物:FIP由FlC和F2組成；BIP由BIC和B2組成，外引物:F3、B3)及具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在60-65°C恒溫條件下對核酸進(jìn)行擴(kuò)增，短時間擴(kuò)增效率可達(dá)到IO9-1Oki個拷貝。該技術(shù)克服了 PCR技術(shù)的一些缺點。目前已在人類及動植物細(xì)菌、病毒、寄生蟲、真菌等的檢測中取得重要進(jìn)展，在疫病診斷領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
[0006]多子小瓜蟲目前的檢測診斷方法有形態(tài)學(xué)檢測方法，普通PCR檢測方法，和熒光PCR檢測方法三種。上述這三種檢測診斷方法分別需使用到光學(xué)顯微鏡、普通PCR儀、熒光PCR儀、電腦等較精密的儀器設(shè)備。這些儀器設(shè)備不僅價值較高，而且其存放和使用對環(huán)境要求較高，不適宜于在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中安置和應(yīng)用。同時，普通PCR檢測方法和熒光PCR檢測方法，檢測流程較復(fù)雜，達(dá)不到快速檢測診斷的目的。目前，在國內(nèi)外除開發(fā)有適宜于實驗室環(huán)境檢測診斷多子小瓜蟲的普通PCR和熒光PCR技術(shù)方法外，尚未開發(fā)出更快速簡便的，適宜于水產(chǎn)養(yǎng)殖等粗放的環(huán)境中的多子小瓜蟲檢測診斷技術(shù)。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種更簡便，且結(jié)果準(zhǔn)確的檢測多子小瓜子的方法。
[0009]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于檢測多子小瓜子的引物，其特征在于，所述引物序列為由SEQ ID NO: 1-4的4條序列組成。
[0010]一種用于檢測多子小瓜子的試劑盒，其特征在于，包括所述的引物。
[0011]一種用于檢測多子小瓜子的方法，其特征在于，所述方法應(yīng)用了所述引物或者所述試劑盒。
[0012]所述方法，包括如下步驟，
提取DNA模板；
LAMP PCR擴(kuò)增:應(yīng)用權(quán)利要求1的引物或者權(quán)利要求2的試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增； 結(jié)果判斷。
[0013]所述提取DNA模板可以從魚鰭、魚鰓、魚體表刮取物、飼養(yǎng)水體離心收集沉淀等物中提取。
[0014]所述的LAMP PCR 擴(kuò)增體系為，SEQ ID NO: 1-2 的序列各 0.8 μ mol/L, SEQ IDNO: 3-4 的序列各 0.2 μ mol/L, I U DNA 模板，1.2 mmol/L dNTP, I mol/L 甜菜喊，8U BsmDNA聚合酶，IXBsm buffer,加滅菌雙蒸懼水補(bǔ)全到25 μ I。
[0015]所述的LAMP PCR擴(kuò)增程序為，95°C保溫5 min，60 °C保溫I h，80 °C保溫5 min。
[0016]所述的結(jié)果判斷為加入顯色劑，輕晃混勻，反應(yīng)液呈淺黃色的為陽性結(jié)果，反應(yīng)液呈橙黃色的為陰性結(jié)果。
[0017]所述顯色劑為SYBR green I。
[0018]雖然LAMP技術(shù)是一項公開的技術(shù)方法，但是其具體效用必須通過研究人員，經(jīng)過自身的創(chuàng)造性思維，學(xué)術(shù)造詣，研究開發(fā)，反復(fù)試驗等過程，研究建立出創(chuàng)新的，具有科研價值的研究成果，才能使LAMP技術(shù)在具體的，特定的領(lǐng)域發(fā)揮作用。否則即便人們熟悉LAMP技術(shù)，但是依然無法達(dá)到檢測鑒定生物體的目的，無法解決實際問題。
[0019]本發(fā)明的創(chuàng)新點，不在LAMP技術(shù)本身，而在于研究開發(fā)者通過何種手段，將LAMP技術(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)榭梢杂脕頇z測多子小瓜蟲的檢測診斷方法，以填補(bǔ)多子小瓜蟲現(xiàn)場檢測診斷領(lǐng)域的空白。目前，國內(nèi)外的研究者，均以建立快速、準(zhǔn)確的檢測診斷手段為目標(biāo)。一項快速、準(zhǔn)確的檢測診斷手段的研發(fā)和建立需要研究者的不斷探索和努力，也能夠創(chuàng)造巨大的社會價值和經(jīng)濟(jì)價值。所以本發(fā)明是以LAMP技術(shù)為基本原理，在此基礎(chǔ)上開發(fā)創(chuàng)造出其他研究者未能實現(xiàn)的，多條新的引物，從而實現(xiàn)了 LAMP方法到檢測診斷多子小瓜蟲LAMP技術(shù)的質(zhì)的飛躍。如果沒有發(fā)明人創(chuàng)造性的開發(fā)出特殊的引物，LAMP技術(shù)只能是一個概念，不能發(fā)揮任何價值。[0020]本發(fā)明所提供的多子小瓜蟲LAMP快速檢測方法具有以下優(yōu)點:
一、靈敏度高，對多子小瓜蟲的檢測極限可達(dá)到I條幼蟲水平。
[0021]二、特異性強(qiáng)，所用的特異引物為根據(jù)多子小瓜蟲的18S rDNA六個不同區(qū)域設(shè)計出的4條引物，增強(qiáng)了反應(yīng)的特異性。
[0022]三、檢測時間短，I小時左右可獲得檢測結(jié)果，比普通PCR檢測縮短24h。
[0023]四、不需要PCR儀，對儀器設(shè)備要求低，不需要任何PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)，只需要一個水浴鍋或者保溫瓶就可以完成檢測。
[0024]五、操作簡單、結(jié)果明顯，整個檢測過程不涉及復(fù)雜儀器和設(shè)備，一般技術(shù)人員即可完成檢測，結(jié)果容易辨別，通過不同顏色，肉眼即可觀察結(jié)果，不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。
[0025]六、檢測過程不需要使用EB等有毒試劑，對人和環(huán)境非常安全。[0026]綜上所述，本發(fā)明具有比現(xiàn)有PCR技術(shù)檢測多子小瓜蟲的方法具有更高的特異性、靈敏度和便攜性。可以在實際生產(chǎn)中現(xiàn)場應(yīng)用檢測。
[0027]從實施例所得的圖1可以看出，結(jié)果清晰可辨，簡單明了。
[0028]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1是加熒光染料檢測結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0030]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0031]實施例1:多子小瓜子的檢測
DDNA提取:取待測魚體表刮取物作為樣本，按DNA試劑盒方法提取方法或經(jīng)典的DNA酚氯仿提取法提取DNA作為LAMP檢測的DNA模板。已知感染多子小瓜蟲的魚體表刮取物的DNA作為陽性對照，已知健康的魚體表刮取物的DNA作為陰性對照。
[0032]2)引物設(shè)計
多子小瓜蟲LAMP引物設(shè)計
根據(jù)多子小瓜蟲18S rDNA (序列號Sequence ID: gb | DQ270016.1 )測序結(jié)果為模板，設(shè)計以下4條引物，序列如下:
3XGCF3:5，-GAT TAT GTC CCT GCC GTT-3’序列 SEQ ID NO:1
3XGCB3:5，-TCC TCC TCC TAA ATA AAG TAC A_3’序列 SEQ ID NO:2
3XGCFIB: 5’-ACT TOC CM AGC CTT GCG AOC OGT OGC HG TAG TM OG-3，序列SEQ ID NO:33XGCBIP: 5’-AAG TM ACC CTA CCA TTT GGA ACA TTG TGT TAA TGA TCC ATC TGC-3’序列SEQ ID NO:4 (引物合成:廈門精聚科技有限公司)
3) LAMP檢測LAMP反應(yīng)體系配置:引物3XGCF3和3XGCB3各0.8 μ mol/L，引物3XGCFIB和
3XGCBIP 各 0.2 μ mol/L, 1.2 mmol/L dNTP, I mol/L 甜菜堿，8U Bsm DNA 聚合酶，IXBsmbuffer (美國 Thermo 公司)。
[0033]LAMP反應(yīng)擴(kuò)增條件:將引物、dNTP、甜菜堿、Bsm buffer、Bsm DNA聚合酶，和I UDNA模板(即步驟I)所得)按比例混合后，95°C保溫5 min, 60 °C保溫I h，80 °C保溫5 min。
[0034]LAMP結(jié)果檢測:
將上述反應(yīng)完的體系中加入I μ I的顯色劑SYBR green I。輕晃混勻，即可觀察,結(jié)果見圖1。其中I為陽性結(jié)果，反應(yīng)液呈淺黃色，與陽性對照的結(jié)果相同。2為陰性結(jié)果(陰性對照)，反應(yīng)液呈橙黃色。
[0035]盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下在本發(fā)明的范 圍內(nèi)可以對上述實施例進(jìn)行變化、修改、替換和變型。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測多子小瓜子的引物，其特征在于，所述引物序列為由SEQ ID N0:l-4的4條序列組成。
2.一種用于檢測多子小瓜子的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的引物。
3.一種用于檢測多子小瓜子的方法，其特征在于，所述方法應(yīng)用了權(quán)利要求1的引物或者權(quán)利要求2的試劑盒。
4.權(quán)利要求3的檢測多子小瓜子的方法，其特征在于，包括如下步驟， 提取DNA模板； LAMP PCR擴(kuò)增:應(yīng)用權(quán)利要求1的引物或者權(quán)利要求2的試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增； 結(jié)果判斷。
5.權(quán)利要求4的檢測多子小瓜子的方法，其特征在于，所述提取DNA模板可以從魚鰭、魚鰓、魚體表刮取物、飼養(yǎng)水體離心收集沉淀等物中提取。
6.權(quán)利要求4的檢測多子小瓜子的方法，其特征在于，所述的LAMPPCR擴(kuò)增體系為，SEQ ID NO: 1-2 的序列各 0.8 μ mol/L, SEQ ID NO: 3-4 的序列各 0.2 μ mol/L, I U DNA模板，1.2 mmol/L dNTP, I mol/L 甜菜喊，8U Bsm DNA 聚合酶，IX Bsm buffer,加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25 μ I。
7.權(quán)利要求4的檢測多子小瓜子的方法，其特征在于，所述的LAMPPCR擴(kuò)增程序為，95°C 保溫 5 min ,60 °C 保溫 I h，80 °C 保溫 5 min。
8.權(quán)利要求4的檢測多`子小瓜子的方法，其特征在于，所述的結(jié)果判斷為加入顯色劑，輕晃混勻，反應(yīng)液呈淺黃色的為陽性結(jié)果，反應(yīng)液呈橙黃色的為陰性結(jié)果。
9.權(quán)利要求8的檢測多子小瓜子的方法，其特征在于，所述顯色劑為SYBRgreen I。
【文檔編號】C12Q1/68GK103866020SQ201410090981
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】郭書林 申請人:廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心