扁穗牛鞭草isap指紋圖譜的建立方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法及其應(yīng)用。本發(fā)明利用ISAP分子標(biāo)記技術(shù)來構(gòu)建不同扁穗牛鞭草種質(zhì)的DNA指紋圖譜，有利于對無性系扁穗牛鞭草進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定，與常規(guī)的形態(tài)檢驗與生化檢驗相比，不受生長環(huán)境和季節(jié)的影響，結(jié)果更可靠，省時省力；本發(fā)明具有操作簡單、直觀實用等特點，可以促進(jìn)ISAP分子標(biāo)記技術(shù)在準(zhǔn)確、快速、簡便的品種鑒定中更廣泛地應(yīng)用，同時應(yīng)用該方法，對扁穗牛鞭草無性系種質(zhì)的遺傳變異進(jìn)行鑒定，從而實現(xiàn)對扁穗牛鞭草無性系種質(zhì)變異的早期篩選及新品種選育的需要。
【專利說明】扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]扁穗牛鞭草(Hemarthria compressa L.)是禾本科牛鞭草屬多年生暖季型優(yōu)良飼草，莖葉量多，草質(zhì)柔嫩，營養(yǎng)豐富，富含果膠、植物膠汁、藻類多糖和部分纖維素等水溶性纖維素而入口微甜，既可放牧利用，又可調(diào)制干草、青貯。牲畜喜食用，主要靠地上莖繁殖，具有適應(yīng)性廣、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、耐刈割、適口性好、高抗及競爭性強(qiáng)的優(yōu)點，對退耕還草、種草養(yǎng)畜、水土保持及環(huán)境綠化等具有重要應(yīng)用價值。
[0003]隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，特別是分子標(biāo)記和基因標(biāo)記技術(shù)的建立和成熟，為發(fā)展簡便、快速、準(zhǔn)確的種質(zhì)鑒定技術(shù)提供了有效手段。ISAP(intron sequenceamplified polymorphism)標(biāo)記技術(shù)一種基于基因中內(nèi)含子序列的功能型分子標(biāo)記,利用內(nèi)含子剪接位置的保守一致序列作為其引物的核心序列，其上下游引物均為18bp，上下游引物間通過組合配對的方式作為擴(kuò)增的引物對，對真核生物的基因序列進(jìn)行擴(kuò)增的分子標(biāo)記。ISAP標(biāo)記通過對基因序列的擴(kuò)增而與表達(dá)序列緊密連鎖，可以被廣泛而高效地應(yīng)用于高密度圖譜的構(gòu)建，QTL檢測，基因定位，圖位克隆以及分子標(biāo)記輔助育種等。
[0004]由于扁穗牛鞭草為無性繁殖，其品種選育一般通過選擇具有優(yōu)良遺傳變異的無性系材料。這也為其品種或優(yōu)良品系的知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)帶來挑戰(zhàn)。DNA指紋圖譜技術(shù)正是基于每種植物及其品種都有各自特定的性狀和相應(yīng)的DNA序列差異而建立的應(yīng)用性遺傳分析方法，通過對已有各品種或品系DNA進(jìn)行掃描并編碼登記形成各自獨特的指紋圖譜鑒定某個品種或品系的真?zhèn)魏吞禺愋?。開展扁穗牛鞭草種質(zhì)資源的DNA指紋圖譜構(gòu)建研究，可以有效地解決同種異名、同名不同質(zhì)和疑似近似品種的管理問題，為其品種審定和保護(hù)提供重要理論參考依據(jù)。目前，未見ISAP標(biāo)記技術(shù)在扁穗牛鞭草無性系DNA指紋圖譜方面的研究，也沒有建立一種完善的扁穗牛`鞭草DNA指紋圖譜的構(gòu)建方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供一種扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法及其應(yīng)用。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明技術(shù)方案如下:
[0007]扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，包括如下步驟:
[0008]1.DNA提取:采用CTAB法提取扁穗牛鞭草基因組DNA ；
[0009]2.1SAP引物序列的PCR擴(kuò)增:在Bio-Rad icycler PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對72對引物進(jìn)行多態(tài)性篩選；
[0010]3.1SAP-PCR產(chǎn)物的電泳檢測:用6 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠在電泳儀上電泳，銀染法后拍照，得照片；
[0011]4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析:在相同遷移位置，人工記錄每個引物的擴(kuò)增片段，有帶記為1，無帶記為0，形成原始“0，I” 二元數(shù)據(jù)矩陣；[0012]5.DNA指紋圖譜的構(gòu)建:根據(jù)照片上引物擴(kuò)增情況，挑取具有代表性的ISAP多態(tài)性帶，繪制扁穗牛鞭草的DNA指紋圖譜。
[0013]所述步驟I中DNA提取包括如下步驟:
[0014](I)取適量植物組織置于研缽中，加入約30mL的液氮，搗碎葉片，等液氮快揮發(fā)完時，快速研磨到粉狀，把粉末轉(zhuǎn)移到有標(biāo)記的2.0ml無菌離心管中；加入800μ L65°C預(yù)熱的DNA提取液于2.0ml無菌離心管中，迅速顛倒混勻后，將離心管置于65°C水浴20_60min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次；取出樣品管按體積比24: I加入700 UL氯仿/異戍醇顛倒充分混勻后，12000rpm離心5min,得上清液；
[0015](2)將步驟(1)所得的上清液吸取到一個新的1.5mL無菌離心管；緩慢加入預(yù)冷的異丙醇，加入量按吸取上清液體積的2 / 3計，上下?lián)u動離心管，注意觀察DNA將從溶液中析出，_20°C放置30min，使得DNA成團(tuán)，12000rpm離心5min，將析出的白色絮狀DNA沉淀轉(zhuǎn)入新的1.5mL無菌離心管；加入75 %的乙醇溶液900 μ L，清洗2_3次，混勻，4°C, 12000rpm離心6min,倒掉上清液,然后用無水乙醇洗漆一次,室溫下放置數(shù)分鐘；加入500 μ L的TE緩沖液，37°C保溫Ih以除去DNA中的RNA ;在無菌離心管加入500 μ L苯酚、氯仿和異戊醇的混合物，氯仿和異戊醇的混合物各抽提一次，充分混勻，在室溫下12000rpm，離心5min ；
[0016](3)取上清液于另已1.5ml無菌離心管中，加入200 μ L5moI / L的NaCl和750 μ L飽和水乙醚,輕搖5min,在室溫下12000rpm,離心10min ;小心除去上層乙醚,將下層液體移到鑫的1.5ml無菌離心管中，加入I / 10體積的NaAc和兩倍體積無水乙醇，_20°C沉淀DNAlh ;12000rpm離心10min，沉淀用70%乙醇、無水乙醇各洗滌I次，室溫放置5min ；
[0017]干燥后加入150-200 μ L雙蒸水或0.1 XTE緩沖液，放在4°C冰箱中保存；
[0018](4)采用紫外分光光度計法檢測DNA的含量，檢測260、280nm處的OD值，計算得出DNA的含量。如0D260 / 0D280=1.8左右，DNA較為純凈；〈1.8，則有蛋白污染；>1.8，則有RNA污染。同時，還可進(jìn)一步用1%的瓊脂糖電泳檢測DNA的質(zhì)量，以得到非常直觀的效果O
[0019]所述DNA 提取為 2% CTAB ;1.4mol / LNaCl ；20mmol / L EDTAPH8.0 ; IOOmmol /LTris-HClPH8.0 ；2% β -巰基乙醇。
[0020]所述TE 緩沖液為 IOmmol / L Tris-HCl, lmmol / LEDTA, ΡΗ8.0)溶解，加入3 μ LRNAase(IOmg / ml。
[0021]所述步驟⑵中苯酚:氯仿:異戊醇的體積比為25: 24:1。
[0022]所述步驟⑵氯仿:異戊醇的體積比為24: I。
[0023]本發(fā)明的有益效果為:
[0024](I)本發(fā)明利用ISAP分子標(biāo)記技術(shù)來構(gòu)建不同扁穗牛鞭草種質(zhì)的DNA指紋圖譜，有利于對無性系扁穗牛鞭草進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的鑒定，與常規(guī)的形態(tài)檢驗與生化檢驗相比，不受生長環(huán)境和季節(jié)的影響，結(jié)果更穩(wěn)定、可靠，且省時省力；構(gòu)建DNA指紋普和鑒定技術(shù)使ISAP分子標(biāo)記技術(shù)在植物品種鑒定、親緣關(guān)系分析、植物種質(zhì)資源創(chuàng)新和分子標(biāo)記輔助育種中的廣泛推廣應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)；
[0025](2)采用本發(fā)明構(gòu)建的扁穗牛鞭草DNA指紋圖譜，涵蓋了我國西南地區(qū)大部分種質(zhì)資源，具有一定的廣泛性，同時，對于鑒定出的新品種，可以進(jìn)一步補(bǔ)充完善扁穗牛鞭草種質(zhì)的指紋圖譜，以滿足新品種選育的需要。
[0026](3)本發(fā)明具有操作簡單、直觀實用等特點，可以促進(jìn)ISAP分子標(biāo)記技術(shù)在準(zhǔn)確、快速、簡便的品種鑒定中更廣泛地應(yīng)用，同時應(yīng)用該方法，對扁穗牛鞭草無性系種質(zhì)變異品種進(jìn)行鑒定，從而實現(xiàn)對扁穗牛鞭草無性系種質(zhì)變異的早期篩選及新品種選育的需要。
【具體實施方式】
[0027]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0028]實施例1
[0029]1.材料來源
[0030]試驗材料為26份扁穗牛鞭草無性系種質(zhì)(表1)，包括“重高”、“廣益”和“雅安”3個國審品種、栽培品系和野生材料，具有較好的代表性。
[0031]表1扁穗牛鞭草無性系來源
[0032]
【權(quán)利要求】
1.扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，其特征在于，包括如下步驟: (1).DNA提取:采用CTAB法提取扁穗牛鞭草基因組DNA ； (2).ISAP引物序列的PCR擴(kuò)增:在Bio-Rad icycler PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對72對引物進(jìn)行多態(tài)性篩選； (3).1SAP-PCR產(chǎn)物的電泳檢測:用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠在電泳儀上電泳，銀染法后拍照，得照片； (4).數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析:在相同遷移位置，人工記錄每個引物的擴(kuò)增片段，有帶記為1，無帶記為0，形成原始“0，I” 二元數(shù)據(jù)矩陣； (5).DNA指紋圖譜的構(gòu)建:根據(jù)照片上引物擴(kuò)增情況，挑取具有代表性的ISAP多態(tài)性帶，繪制扁穗牛鞭草的DNA指紋圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟I中DNA提取包括如下步驟: (1)取適量植物組織置于研缽中，加入約30mL的液氮，搗碎葉片，等液氮快揮發(fā)完時，快速研磨到粉狀，把粉末轉(zhuǎn)移到有標(biāo)記的2.0ml無菌離心管中；加入800 μ L65°C預(yù)熱的DNA提取液于2.0ml無菌離心管中，迅速顛倒混勻后，將離心管置于65°C水浴20_60min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次；取出樣品管按體積比24: I加入700 UL氯仿/異戊醇顛倒充分混勻后，12000rpm離心5min,得上清液； (2)將步驟(1)所得的上清液吸取到一個新的1.5mL無菌離心管；緩慢加入預(yù)冷的異丙醇，加入量按吸取上清液體積的2 / 3計，上下?lián)u動離心管，注意觀察DNA將從溶液中析出，_20°C放置30min，使得`DNA成團(tuán)，12000rpm離心5min，將析出的白色絮狀DNA沉淀轉(zhuǎn)入新的1.5mL無菌離心管；加入75%的乙醇溶液900 μ L，清洗2_3次，混勻，4°C，12000rpm離心6min，倒掉上清液，然后用無水乙醇洗滌一次，室溫下放置數(shù)分鐘；加入500 μ L的TE緩沖液，37°C保溫Ih以除去DNA中的RNA ;在無菌離心管加入500 μ L苯酚、氯仿和異戊醇的混合物，氯仿和異戊醇的混合物各抽提一次，充分混勻，在室溫下12000rpm，離心5min ； (3)取上清液于另已1.5ml無菌離心管中，加入200 μ L5moI / L的NaCl和750 μ L飽和水乙醚，輕搖5min,在室溫下12000rpm,離心10min ;小心除去上層乙醚,將下層液體移到鑫的1.5ml無菌離心管中，加入I / 10體積的NaAc和兩倍體積無水乙醇，_20°C沉淀DNAlh ；12000rpm離心10min,沉淀用70%乙醇、無水乙醇各洗漆I次,室溫放置5min ； 干燥后加入150-200 μ L雙蒸水或0.1 X TE緩沖液，放在4°C冰箱中保存； (4)采用紫外分光光度計法檢測DNA的含量，檢測260、280nm處的OD值，計算得出DNA的含量。如0D260 / 0D280=1.8左右，DNA較為純凈；〈1.8，則有蛋白污染；>1.8，則有RNA污染。同時，還可進(jìn)一步用1%的瓊脂糖電泳檢測DNA的質(zhì)量，以得到非常直觀的效果。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述 DNA 提取為 2 % CTAB ；1.4mol / LNaCl ；20mmol / L EDTAPH8.0 ;IOOmmol /LTris-HClPH8.0 ；2% β -巰基乙醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述TE緩沖液為 IOmmol / L Tris-HCl, lmmol / LEDTA, ΡΗ8.0)溶解，加入 3 μ LRNAase (IOmg /ml ο
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟(2)中苯酚:氯仿:異戊醇的體積比為25: 24:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法，其特征在于，所述步驟⑵氯仿:異戊醇的體積比為24:1。
7.如 權(quán)利要求1所述扁穗牛鞭草ISAP指紋圖譜的建立方法的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103866021SQ201410091274
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】馬嘯, 張新全, 郭志慧, 彭燕, 劉偉, 閆艷紅, 周朝杰, 顧曉燕, 劉新 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)