一種腫瘤特異性殺傷細胞制劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種腫瘤特異性殺傷細胞制劑及其制備方法，本發(fā)明的特異性殺傷細胞為DC疫苗，CIK，CTL細胞的混合物，所述制劑含有胸腺五肽，將其和殺傷細胞混合具有明顯提高治療效果的作用。
【專利說明】一種腫瘤特異性殺傷細胞制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的細胞免疫治療新技術(shù)，特別涉及一種初始T細胞來源的新型腫瘤特異性殺傷細胞(DC-CIK-CTL)制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中國專利2012101271586描述了一種效應(yīng)細胞制備方法，即應(yīng)用⑶4+和⑶8+混合的初始T細胞，制備DC-CIK-CTL效應(yīng)細胞，同時提供一種應(yīng)用復(fù)合制劑對腫瘤微環(huán)境進行干擾，從而打破腫瘤免疫耐受，在此基礎(chǔ)上進行效應(yīng)細胞回輸治療的新技術(shù)。其中DC-CIK-CTL效應(yīng)細胞的制備方法是:外周血獲得單狀核細胞，體外分離出DC細胞和總T細胞。DC細胞經(jīng)過5天的培養(yǎng)擴增并加入病人自體腫瘤相關(guān)全抗原至第7天成熟，獲得腫瘤特異性DC疫苗備用。T細胞則進一步分離出初始CD4+T細胞和初始CD8+T細胞，將兩種初始T細胞按1:1混合，經(jīng)INF- Y沖擊后，應(yīng)用⑶3單抗和IL-2擴增至第7天制備CIK。半數(shù)細胞移瓶后加入DC疫苗激活制備腫瘤特異性CTL，另外半數(shù)細胞繼續(xù)CIK培養(yǎng)，至第10天分別收獲CIK和CTL效應(yīng)細胞，混合移入含有2.0g人血白蛋白的250ml0.9%氯化鈉中，制備成高效DC-CIK-CTL?；剌斍笆紫葘Σ∪藢嵤┪h(huán)境干擾，方法是:環(huán)磷酰胺(CTX)600-1200mg靜脈滴入，I次/日共2天，次日靜脈回輸DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。細胞回輸治療第一天引流區(qū)域淋巴結(jié)注射DC疫苗，每周一次共三次。
[0003]但實驗 發(fā)現(xiàn)使用該方法，臨床有效率雖然有所提高，但還未達到理想程度，為此本發(fā)明人對上述方法進行了改進，取得了意想不到的技術(shù)效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的主要目的在于:解決目前DC-CIK-CTL方法腫瘤殺傷率低、臨床有效率低的問題，應(yīng)用本技術(shù)，可以顯者提聞腫瘤的殺傷效率，提聞臨床有效率和客觀療效。
[0005]為保證上述技術(shù)的實施，本發(fā)明提供了一種特異性腫瘤殺傷細胞制劑及其制備方法。
[0006]本發(fā)明的制劑包括腫瘤特異性殺傷細胞(DC-CIK-CTL)和胸腺五肽。
[0007]本發(fā)明提供一種腫瘤特異性殺傷細胞制劑，其特征在于，含有腫瘤特異性殺傷細胞以及胸腺五肽，其中胸腺五肽加入量為5mg。
[0008]本發(fā)明的制劑，所述腫瘤特異性殺傷細胞，制備方法采:
[0009]外周血單狀核細胞采集:
[0010]應(yīng)用COBESPECTRA細胞成分分離機，按照說明書設(shè)定參數(shù)設(shè)定程序，外周血循環(huán)6000-8000ml，采集單狀核細胞120_140ml，分裝入50ml離心管，日立細胞離心機1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上層血漿移入50ml離心管，制備自體滅活血清，4°C冷藏備用，收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細胞分離液15ml的50ml離心管，應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機離心2000rpmX15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細胞層，分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX10分鐘，棄上清，加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心1000rpmX 5分鐘洗滌，棄上清，重復(fù)洗滌3次后，加入1640培養(yǎng)基，細胞計數(shù)，
[0011]DC和T細胞分離:
[0012]175cm2培養(yǎng)瓶分別加入1640無血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放置20分鐘行培養(yǎng)瓶活化，將單狀核細胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細胞濃度控制在I X IO7個/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細胞為外周血總T細胞，剩余貼壁細胞即為DC細胞，
[0013]DC成熟和腫瘤特異性DC疫苗制備:
[0014]貼壁的DC細胞中加入無血清DC培養(yǎng)基20ml，置于37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中擴增培養(yǎng)5天，第6天加入自體腫瘤相關(guān)抗原50ug/ml，次日補充10-15%的自體血清，培養(yǎng)2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細胞檢測⑶83、HLA-DR表達，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療，
[0015]初始⑶4+T細胞及初始⑶8+T細胞分選:
[0016]I)、應(yīng)用美國BD、美國R&D、或德國美天旎公司生產(chǎn)的免疫磁珠試劑盒進行初始CD4+T細胞及初始CD8+T細胞分選，采用美天旎公司的50nm微小磁珠，該磁珠可被細胞生物降解而無需解離磁珠，對細胞無損傷、無激活、且對細胞生理功能無影響，
[0017]①、初始⑶4+T細胞分選:將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，按照Na'ivera4+TcellisolationkitII, human試劑盒說明書，首先加入生物素偶聯(lián)的雞尾酒單抗作為一抗，然后加入抗生 物素磁珠，置于磁場進行初始CD4+T細胞陰性分選，以祛除非初始T細胞及NK細胞等，通過分選柱進入試管底部的細胞即為初始CD4+T細胞，將所獲得的CD4+T細胞離心洗滌2-3次備用，
[0018]②、初始⑶8+T細胞分選:將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，按照Nai've⑶8+Tcellisolationkit, human試劑盒說明書分兩步進行分選,第一步,分別加入生物素偶聯(lián)的雞尾酒單抗作為一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁場進行陰性分選，以祛除非初始T細胞和NK細胞，通過分選柱進入試管底部的細胞即為初始T細胞，第二部，對所收集的初始T細胞進行⑶8+磁珠標(biāo)記，置于磁場進行陽性分選，收獲初始⑶8+T細胞，離心洗滌2-3次備用，
[0019]2 )、應(yīng)用臨床級自動細胞分選設(shè)備如美天旎的CI i tii MACS' Plus進行分選，CliniVIACSi Plus 細胞分選系統(tǒng)包括 CliniMACSPlus 儀器、CliniMACS 管道、CliniMACS 試劑和CliniMACS緩沖液，是一個以MACS技術(shù)為基礎(chǔ)的臨床級全自動細胞分選系統(tǒng)，使操作者能夠在完全封閉、無菌的系統(tǒng)內(nèi)進行臨床級的靶細胞富集或去除，使用CliniMACS.? Plus儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)高純度、高回收率的靶細胞分選，分選出的靶細胞可以直接應(yīng)用于實驗研究和臨床治療，
[0020]將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，注入CliniMACSPlus細胞準(zhǔn)備袋，用相應(yīng)細胞特異性抗體磁性標(biāo)記靶細胞，洗滌細胞以去除多余的抗體，然后，細胞準(zhǔn)備袋與管道相連，后者依次連接CliniMACS緩沖液袋和細胞收集袋，分別設(shè)定初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞的分選程序，CliniMACSPlus儀器將按照程序自動開始分選，總T細胞將自動通過分選柱，并進行一系列洗滌步驟，最終從分選柱中洗脫靶細胞至收集袋中，收獲初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞，將初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞按照1:1混合備用，[0021]CIK 制備:
[0022]取175cm2培養(yǎng)瓶，分別加入AIM-V無血清培養(yǎng)基20ml，將懸浮的初始T細胞移入，置于37°C，5%C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日，補充50%的CIK培養(yǎng)基，第5天補充IL-2培養(yǎng)基，以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色適量補充IL-2培養(yǎng)基，每次補充40%以上，第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，作為CTL培養(yǎng)，剩余半量繼續(xù)作為CIK培養(yǎng)，
[0023]CTL 制備:
[0024]第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制為5:1，繼續(xù)培養(yǎng)3天獲取CTL，
[0025]高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備:
[0026]第10天分批取DC疫苗1-2 X IO7復(fù)蘇、洗滌后、和數(shù)量分別為0.5 X IO9的CIK和CTL細胞混合，細胞總數(shù)量控制為1-2 X 109，加入50ml離心管，生理鹽水離心洗滌3_6次去除細胞碎片，得到腫瘤特異性殺傷細胞(DC-CIK-CTL)。
[0027]因此本發(fā)明的制劑，含有腫瘤特異性殺傷細胞(DC-CIK-CTL)和胸腺五肽，根據(jù)需要還可以加入1%的2.0g人血白蛋白，使用時將其溶解在250ml0.9%氯化鈉輸液中，輸入到患者體內(nèi)。
[0028]本發(fā)明的另一個內(nèi)容是，用本發(fā)明的細胞制劑治療腫瘤病人，其方法是將本發(fā)明制備的制劑回輸?shù)侥[ 瘤病人體內(nèi)。
[0029]本發(fā)明還包括制備一種干擾微環(huán)境制劑，該制劑為注射用環(huán)磷酰胺CTX，注射用CTX,以干擾腫瘤微環(huán)境為目的，而不以抗腫瘤為目的，該制劑的制備方法依據(jù)制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備即可，如制備成水針或粉針，也可直接制備成輸液劑。以上制劑的劑量范圍分別為可一次性用于病人的劑量，如靜脈注射用CTX—次用量為400-600mg/m2，制備成的制劑可直接輸注，也可加入含有0.9%氯化鈉或5%-10%的葡萄糖注射液中給病人輸注。
[0030]本發(fā)明的細胞制劑和干擾微環(huán)境制劑的使用方法如下:
[0031 ] 環(huán)磷酰胺(CTX)600-1200mg靜脈滴入，I次/日共2天，次日靜脈回輸DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。細胞回輸治療第一天引流區(qū)域淋巴結(jié)注射DC疫苗，每周一次共三次。
[0032]本發(fā)明的制劑的制備方法是將:腫瘤特異性殺傷細胞和胸腺五肽，人血白蛋白，以及0.9%氯化鈉輸液混合而成。
[0033]本發(fā)明將腫瘤特異性殺傷細胞和胸腺五肽聯(lián)合使用，回輸給患者，兩者作用互補，起到協(xié)同增效作用，對腫瘤的殺傷效率大大提高。
[0034]以下通過實驗數(shù)據(jù)說明本發(fā)明的有益效果:
[0035]采用不同方法進行B16黑色素瘤的荷瘤小鼠抗腫瘤體內(nèi)實驗。
[0036]
【權(quán)利要求】
1.一種腫瘤特異性殺傷細胞制劑，其特征在于，含有腫瘤特異性殺傷細胞以及胸腺五肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中胸腺五肽加入量為5mg。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中腫瘤特異性殺傷細胞總數(shù)量控制為1-2X109，加入1%人血白蛋白2.0g，胸腺五肽5mg，250ml生理鹽水，制備成腫瘤特異性殺傷細胞細胞制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的制劑，其中腫瘤特異性殺傷細胞為DC-CIK-CTL。
5.一種權(quán)利要求1的制劑的制備方法，所述腫瘤特異性殺傷細胞制備方法如下: 外周血單狀核細胞采集: 應(yīng)用COBESPECTRA細胞成分分離機，按照說明書設(shè)定參數(shù)設(shè)定程序，外周血循環(huán)6000-8000ml，采集單狀核細胞120_140ml，分裝入50ml離心管，日立細胞離心機1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上層血漿移入50ml離心管，制備自體滅活血清，4°C冷藏備用，收集細胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細胞分離液15ml的50ml離心管，應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機離心2000rpmX15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細胞層，分別取15ml單狀核細胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX10分鐘，棄上清，加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心1000rpmX 5分鐘洗滌，棄上清，重復(fù)洗滌3次后，加入1640培養(yǎng)基，細胞計數(shù)， DC和T細胞分離: 175cm2培養(yǎng)瓶分別加入1640無血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放置20分鐘行培養(yǎng)瓶活化，將單狀核細胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細胞濃度控制在I X IO7個/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細胞為外周血總T細胞，剩余貼壁細胞即為DC細胞， DC成熟和腫瘤特異性DC疫苗制備: 貼壁的DC細胞中加入無血清DC培養(yǎng)基20ml，置于37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中擴增培養(yǎng)5天，第6天加入自體腫瘤相關(guān)抗原50ug/ml，次日補充10-15%的自體血清，培養(yǎng)2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細胞檢測CD83、HLA-DR表達，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療， 初始CD4+T細胞及初始CD8+T細胞分選: I)、應(yīng)用美國BD、美國R&D、或德國美天旎公司生產(chǎn)的免疫磁珠試劑盒進行初始CD4+T細胞及初始CD8+T細胞分選，采用美天旎公司的50nm微小磁珠，該磁珠可被細胞生物降解而無需解離磁珠，對細胞無損傷、無激活、且對細胞生理功能無影響， ①、初始⑶4+T細胞分選:將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，按照Nalve⑶4+Tcellisolationkitll, human試劑盒說明書，首先加入生物素偶聯(lián)的雞尾酒單抗作為一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁場進行初始CD4+T細胞陰性分選，以祛除非初始T細胞及NK細胞等，通過分選柱進入試管底部的細胞即為初始CD4+T細胞，將所獲得的CD4+T細胞離心洗滌2-3次備用， ②、初始⑶8+T細胞分選:將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，按照RVive⑶8+Tcellisolationkit, human試劑盒說明書分兩步進行分選,第一步,分別加入生物素偶聯(lián)的雞尾酒單抗作為一抗，然后加入抗生物素磁珠，置于磁場進行陰性分選，以祛除非初始T細胞和NK細胞，通過分選柱進入試管底部的細胞即為初始T細胞，第二部，對所收集的初始T細胞進行⑶8+磁珠標(biāo)記，置于磁場進行陽性分選，收獲初始⑶8+T細胞，離心洗滌2-3次備用， 2)、應(yīng)用臨床級自動細胞分選設(shè)備如美天旎的QiniMACf Plus進行分選，CliniMACS*Plus細胞分選系統(tǒng)包括CliniMACSPlus儀器、CliniMACS管道、CliniMACS試劑和CliniMACS緩沖液，是一個以MACS技術(shù)為基礎(chǔ)的臨床級全自動細胞分選系統(tǒng)，使操作者能夠在完全封閉、無菌的系統(tǒng)內(nèi)進行臨床級的靶細胞富集或去除，使用Cl.1ni\WC+SS' Plus儀器，能夠?qū)崿F(xiàn)高純度、高回收率的靶細胞分選，分選出的靶細胞可以直接應(yīng)用于實驗研究和臨床治療， 將上述外周血總T細胞離心洗滌2-3次，注入CliniMACSPlus細胞準(zhǔn)備袋，用相應(yīng)細胞特異性抗體磁性標(biāo)記靶細胞，洗滌細胞以去除多余的抗體，然后，細胞準(zhǔn)備袋與管道相連，后者依次連接CliniMACS緩沖液袋和細胞收集袋，分別設(shè)定初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞的分選程序，CliniMACSPlus儀器將按照程序自動開始分選，總T細胞將自動通過分選柱，并進行一系列洗滌步驟，最終從分選柱中洗脫靶細胞至收集袋中，收獲初始CD4+T細胞和初始⑶8+T細胞，將初始⑶4+T細胞和初始⑶8+T細胞按照1:1混合備用， CIK制備: 取175cm2培養(yǎng)瓶，分別加入AIM-V無血清培養(yǎng)基20ml，將懸浮的初始T細胞移入，置于370C，5%C02細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日，補充50%的CIK培養(yǎng)基，第5天補充IL-2培養(yǎng)基，以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色適量補充IL-2培養(yǎng)基，每次補充40%以上，第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，作為CTL培養(yǎng)，剩余半量繼續(xù)作為CIK培養(yǎng)， CTL制備: 第8天DC疫苗回收后，將 每瓶CIK細胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制為5:1，繼續(xù)培養(yǎng)3天獲取CTL， 高效特異性DC-CIK-CTL細胞制劑的制備: 第10天分批取DC疫苗1-2X IO7復(fù)蘇、洗滌后、和數(shù)量分別為0.5X IO9的CIK和CTL細胞混合，細胞總數(shù)量控制為1-2 X IO9,加入50ml離心管，生理鹽水離心洗滌3_6次去除細胞碎片。
【文檔編號】C12N5/0783GK103800898SQ201410092414
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】蔡建輝, 徐建強, 楊小崗, 胡玲玲 申請人:蔡穎