提取結(jié)核桿菌dna的方法及檢測其多重耐藥性的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提取結(jié)核桿菌DNA的方法以及快速準(zhǔn)確檢測結(jié)核分枝桿菌多重耐藥性（multiple?drug?resistence，MDR）的試劑盒。該方法包括從由臨床樣本提取待檢DNA，應(yīng)用熒光實時定量PCR確定結(jié)核分枝桿菌感染、鑒別是否為耐藥性及何種耐藥性菌株感染，最終確定病原體感染數(shù)量。本發(fā)明方法可以檢測目前已確定可引起結(jié)核菌耐藥（包括利福平、異煙肼和乙胺丁醇）的全部耐藥基因共29個位點，是迄今為止囊括結(jié)核耐藥基因最全面的快速分子診斷系統(tǒng)。另外通過獨(dú)特的引物、探針和選擇熒光染料標(biāo)記設(shè)計，實現(xiàn)應(yīng)用多重qPCR檢測上述全部耐藥基因位點，得到應(yīng)用簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，對于快速診斷結(jié)核菌感染、確定耐藥性從而進(jìn)行有針對性的治療具有巨大的實用價值和廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】提取結(jié)核桿菌DNA的方法及檢測其多重耐藥性的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種提取結(jié)核桿菌DNA的方法及快速準(zhǔn)確檢測結(jié)核分枝桿菌多重耐藥性的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病仍是一個全球性的問題。目前全球約有20億人被感染，每年新出現(xiàn)結(jié)核病患者約800萬~1000萬,每年因結(jié)核病死亡人數(shù)約200萬~300萬，結(jié)核病已成為21世紀(jì)嚴(yán)重危及人類健康的疾病之一。中國也是結(jié)核病發(fā)生比較嚴(yán)重的國家之一，有接近一半的人口已經(jīng)感染了結(jié)核病病菌，目前有結(jié)核病人500萬，每年新增患者150萬。
[0003]雖然結(jié)核病已經(jīng)不是過去那種能夠讓人“十癆九死”的瘟神了，但近20年來結(jié)核病在世界范圍內(nèi)出現(xiàn)暴發(fā)流行，出現(xiàn)“復(fù)燃“，其主要原因是耐藥結(jié)核病的產(chǎn)生。WH02008年報道顯示，全球結(jié)核病總耐藥率為20.0%，耐多藥率為5.3%每年新出現(xiàn)耐多藥結(jié)核病患者約50萬人，廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)患者5萬人。隨著世界范圍內(nèi)的旅行和人口流動的增加，耐藥性肺結(jié)核病例過去20年來一直呈上升態(tài)勢，嚴(yán)重地威脅著結(jié)核病控制工作已取得的進(jìn)展。
[0004]耐藥的發(fā)生與結(jié)核桿菌的基因突變有關(guān)。藥物靶基因一個或幾個核苷酸突變(增加、缺失、替代)，造成核苷酸編碼錯誤致氨基酸錯位排列，影響藥物與靶位酶結(jié)合而產(chǎn)生耐藥。因一個基因突變而產(chǎn)生的耐藥為單基因型耐藥，因多基因型突變而產(chǎn)生的耐藥為多基因耐藥；對多種藥物發(fā)生耐藥是結(jié)核分枝桿菌的不同靶位基因相繼發(fā)生突變造成的。
[0005]與病毒性傳染病如艾滋和肝炎病不同，目前已有多種有效抗結(jié)核藥物。因此，有效控制結(jié)核病的關(guān)鍵在于研發(fā)出快速、可靠的耐藥結(jié)核病檢測技術(shù)。因為只有快速、準(zhǔn)確地檢測出病人是否為耐藥結(jié)核病及對何種藥物耐藥，病人才能得以及時而且合理的治療，從而有效地控制住結(jié)核病傳播。而目前因臨床所使用的藥敏試驗耗時長(6-8周)、費(fèi)力，病人的病情得不到及時的合理化治療，根本無法滿足目前結(jié)核病防治的需要。
[0006]結(jié)核病致病原是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, TB)。它是一類單細(xì)胞，需氧，革蘭氏陽性菌。典型的分枝桿菌通常有一個較厚的、疏水性的細(xì)胞壁，缺乏細(xì)胞外膜。結(jié)核分枝桿菌感染的特殊性給結(jié)核病的診斷和有效治療帶來很大的困難，主要表現(xiàn)在:(I)結(jié)核菌感染后可能表現(xiàn)出癥狀，如慢性咳嗽(典型的會痰中帶血)，發(fā)熱，夜間盜汗，疲勞乏力，臉色蒼白，消瘦等，但也可能是潛在的和完全無癥狀。這時應(yīng)用傳統(tǒng)的檢測方法常無法診斷或造成假陰性(漏診)；(2)結(jié)核病感染的常規(guī)診斷通常依賴于身體檢查和實驗室檢查。身體檢查往往僅在結(jié)核活動期或感染后期才能發(fā)現(xiàn)癥狀。結(jié)核菌素皮試和抗酸性染色方法的特異性不強(qiáng)。肺組織活檢，胸腔穿刺術(shù)等創(chuàng)傷性檢測方法對機(jī)體損害較大。最廣泛采用的痰液涂片、顯微鏡下檢查確診結(jié)核病檢出率很低。而細(xì)胞培養(yǎng)的方式由于結(jié)核分枝桿菌的特殊結(jié)構(gòu)、生長特性以及在感染個體體內(nèi)的滴度通常較低等特點，需要較長的細(xì)菌培養(yǎng)周期，從臨床標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)核菌通常需要四到八周之間。在此期間，病人可能病情加重或傳染給他人。這使作為傳統(tǒng)意義上結(jié)核診斷金標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法在實際操作上存在巨大的局限性，難以有效控制病情發(fā)展和傳播；(3)更重要的是耐藥及多重耐藥菌的出現(xiàn)使對結(jié)核病的治療雪上加霜。結(jié)核桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)是基因突變和自然選擇的結(jié)果。但在實際操作中其根本原因就是由于對耐藥性檢驗不力，對患者感染結(jié)核菌耐藥性不了解，造成無法選擇正確有效的治療藥物。而這基本相當(dāng)于一個人工選擇耐藥性結(jié)核菌感染的過程，其結(jié)果是造成更嚴(yán)重、更難治的耐藥菌感染，同時促進(jìn)了新的耐藥菌種的出現(xiàn)和傳播。因此可以說，在沒有結(jié)核菌耐藥監(jiān)測前提下的抗生素治療，適得其反，弊大于利。
[0007]針對上述問題，對結(jié)核病及耐藥與多重耐藥菌株的快速分子診斷方法是目前結(jié)核病防治的關(guān)鍵。分子診斷方法快速，靈敏度高、特異性好、結(jié)果準(zhǔn)確，非常適于對結(jié)核病及耐藥與多重耐藥病的診斷。熒光定量PCR是目前臨床最重要的分子診斷技術(shù)。由于其快速，靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確，已被廣泛地應(yīng)用到艾滋病，肝炎，和HPV等傳染病診斷與普查。但在結(jié)核病及耐藥與多重耐藥分子診斷尚未廣泛開展起來。這主要存在以下幾個問題:
[0008](1)檢驗內(nèi)容有限:目前的方法常僅限于測試是否有結(jié)核菌感染，或集中于測試是否為耐利福平耐藥，結(jié)果非常局限而不夠全面。比如美國食品藥品管理局(FDA)近年批準(zhǔn)的首個用來檢測結(jié)核菌耐藥性的分子診斷試劑盒就是用于檢測利福平耐藥性的，稱為XpertMTB/RIF。誠然，利福平是很重要的結(jié)核一線抗生素，但對其它藥物耐藥和多重結(jié)核耐藥菌根本無法檢測。而常規(guī)結(jié)核病抗生素治療一個公認(rèn)的基本原則就是復(fù)合用藥。而且單一抗生素用藥是造成結(jié)核菌產(chǎn)生耐藥的重要原因之一。如果僅知道利福平的耐藥信息對指導(dǎo)治療的實用價值是有限的。近年來耐藥與多重耐藥結(jié)核菌感染甚至爆發(fā)的出現(xiàn)要求有更先進(jìn)的方法，全面檢測結(jié)核感染的耐藥信息。
[0009](2)目前市場上基于熒光定量PCR檢測的方法多數(shù)每個反應(yīng)僅作單突變點檢測。這樣或者限制了可以檢測突變點的數(shù)量，或者試劑過多、操作復(fù)雜費(fèi)時，在實際臨床實踐中受到制約。多重?zé)晒舛縋CR的應(yīng)用不僅能夠檢測所有結(jié)核菌耐藥與多重耐藥，而且，大大簡化了實驗方法。
[0010](3)對于樣本的DNA提取缺乏規(guī)范有效的方法。結(jié)核桿菌DNA的提取一直是困擾結(jié)核病分子診斷發(fā)展的一個技術(shù)難題。
[0011]因此，開發(fā)一項嶄新的，適合臨床結(jié)核病防治的熒光定量PCR檢測方法是當(dāng)前急待解決的問題。該方法應(yīng)該不僅提供從結(jié)核菌DNA提取到最終獲得結(jié)核菌感染與否，耐藥與多重耐藥與否全部信息，而且要能準(zhǔn)確可靠，快速、簡便地應(yīng)用于臨床實驗室。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明提供一種提取結(jié)核桿菌DNA的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的DNA提取困難，費(fèi)時費(fèi)力等問題。
[0013]本發(fā)明提供一種快速準(zhǔn)確檢測結(jié)核分枝桿菌多重耐藥性的試劑盒，以準(zhǔn)確可靠，快速、簡便地檢測結(jié)核桿菌耐藥性及多重耐藥性。
[0014]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0015]從痰液中提取結(jié)核桿菌DNA的方法，包括以下步驟:
[0016]a)、堿處理，將生物樣本(痰液)加入NaOH溶液內(nèi)液化處理；
[0017]b)、一次離心，將上述液化后的生物樣本置入離心機(jī)內(nèi)離心，棄上清液；
[0018]c)、Tris緩沖液洗漆沉淀,棄去上清液；[0019]d)、加入DNA提取液，沸水浴5-15分鐘；
[0020]e)、二次離心，將上步所得液體置于離心機(jī)內(nèi)離心，收集上清液，即得結(jié)核桿菌DNA。
[0021]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述堿處理中的NaOH溶液的濃度為4%，堿處理的溫度為37 °C,堿處理的時間為30分鐘。
[0022]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述一次離心和二次離心的轉(zhuǎn)速均為12000轉(zhuǎn)，時長為10分鐘。
[0023]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述DNA提取液包括以下濃度的組分:
[0024]
【權(quán)利要求】
1.提取結(jié)核桿菌DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟: a)、堿處理，將生物樣本(痰液)加入NaOH溶液內(nèi)液化處理； b)、一次離心，將上述液化后的生物樣本置入離心機(jī)內(nèi)離心，棄上清液； c)、Tris緩沖液洗漆沉淀,棄去上清液； d)、加入DNA提取液，沸水浴5-15分鐘； e)、二次離心，將上步所得液體置于離心機(jī)內(nèi)離心，收集上清液，即得結(jié)核桿菌DNA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取結(jié)核桿菌DNA的方法，其特征在于，所述堿處理中的NaOH溶液的濃度為4%，堿處理的溫度為37°C，堿處理的時間為30分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取結(jié)核桿菌DNA的方法，其特征在于，所述一次離心和二次離心的轉(zhuǎn)速均為12000轉(zhuǎn)，時長為10分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提取結(jié)核桿菌DNA的方法，其特征在于，所述DNA提取液包括以下濃度的組分:

5.一種檢測結(jié)核分枝桿菌多重耐藥性的試劑盒，其特征在于，包括:痰液樣本液化劑、DNA提取液、qPCR反應(yīng)液、多重耐藥基因檢測引物、核苷酸探針、各耐藥基因野生型及各耐藥基因變異型序列檢測標(biāo)準(zhǔn)品； 所述多重耐藥基因檢測引物的DNA序列為SEQ ID Nos:1_79 ； 所述核苷酸探針的序列為SEQ ID Nos:80-92 ； 所述各耐藥基因野生型及各耐藥基因變異型序列檢測標(biāo)準(zhǔn)品的序列為SEQ ID Nos:93-138。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測結(jié)核分枝桿菌多重耐藥性的試劑盒，其特征在于，所述痰液樣本液化劑為濃度為4%的NaOH溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種檢測結(jié)核分枝桿菌多重耐藥性的試劑盒，其特征在于，所述DNA提取液包括以下濃度的組分:
【文檔編號】C12Q1/68GK103911365SQ201410093113
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】李沛祥 申請人:南京愛必夢生物材料有限公司