一株海旋菌及制備瓊膠酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株海旋菌（Thalassospirasp.）fjfst-2013007，已于2013年12月25日在保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心登記保藏，其保藏編號為CCTCCM2013708，以及用該菌株發(fā)酵制備瓊膠酶的方法。本發(fā)明以該菌株作為菌種，采用碳源、氮源、無機鹽組成的發(fā)酵培養(yǎng)基，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，瓊膠酶的活力達到11.2U/ml。發(fā)酵液通過硫酸銨進行鹽析，離心收集沉淀，后進行透析，取透析液過離子交換柱及凝膠柱，冷凍干燥即可獲得瓊膠酶干粉。
【專利說明】一株海旋菌及制備瓊膠酶的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于食品生物【技術領域】,涉及篩選一株海旋菌sp.)及其培養(yǎng)發(fā)酵制備瓊膠酶的方法。
【背景技術】
[0002]瓊膠(agar)，又名瓊脂，是一種在海洋紅藻中經(jīng)熱水提取得到的海藻多糖，其資源豐富，廣泛應用于食品，醫(yī)藥，生物技術等領域，瓊膠主要由中性的瓊膠糖(agarose)和離子性的硫瓊膠(agar)組成,瓊膠糖是由1，3連接的β -D-半乳糖和1，4連接的3，6-內(nèi)醚- a -L-半乳糖殘基反復交替連接的直鏈聚合物。[0003]瓊膠酶來源廣泛，主要存在于海洋細菌中:交替單胞菌屬，噬細胞菌屬，假單胞菌屬，交替假單胞菌屬，鏈霉菌屬，微顫菌屬，弧菌屬。在以海藻為食的動物屬中均有發(fā)現(xiàn)，如海兔屬，濱螺屬，冠海詹屬等。
[0004]瓊膠寡糖就是指瓊膠多糖經(jīng)水解后聚合度(DP)為2-10的低聚糖，又稱瓊膠低聚糖，主要由瓊二糖的重復單位連接而成，水溶性好，有利于人體吸收，大大提高了其應用價值，是一種新型的海洋功能性低聚糖，瓊膠寡糖在化妝品領域有廣泛的應用價值，主要源自于其護膚保濕、延緩衰老、美白的功能以及作為化妝品添加劑具有的能夠防止皮膚感染和過敏性皮炎的作用。同時由于其與生物的內(nèi)源性糖結構相似的特點，因此對生物體無毒害，對瓊膠寡糖功能的研究日益發(fā)展。并且在食品生產(chǎn)中，因瓊膠寡糖不被消化酶分解，且無熱量產(chǎn)生，可作高甜味劑的填充劑及分散劑用于飲料、面包及低熱量食品的生產(chǎn)；此外，瓊膠寡糖具有較強的抑菌作用，是一種很好的天然防腐劑和抗氧化劑。
[0005]福建省擁有廣闊的海域，近幾年加快加深了在海洋資源方面的開發(fā)利用。海洋中豐富的海藻資源為海藻多糖提供了充足的來源。同時瓊脂的生產(chǎn)依賴于對石花菜、雞毛菜、江蘺、麒麟菜、紫菜等海藻的工業(yè)化利用，而且對于瓊脂的生產(chǎn)只是對這些海藻資源的初步利用，其后續(xù)的深加工得到的產(chǎn)品在市場上有十分廣闊的應用前景。若將瓊脂進一步加工，得到的瓊膠寡糖，應用在醫(yī)藥、保健食品和化妝品等行業(yè)，其價值遠遠超過瓊脂。因此海藻進一步精深加工不僅是對資源的充分利用，而且也加深了對海洋資源的充分了解和研究，對于生產(chǎn)應用和科學研究來說都是十分重要而且必要的。雖然福建省海藻資源已相當豐厚，但是瓊膠寡糖的綠色生產(chǎn)依賴于瓊膠酶的應用。由于瓊膠酶的來源相對較少、活性低、價格昂貴，在生產(chǎn)應用中有一定的限制。微生物來源的瓊膠酶可以進行大批量生產(chǎn)，但是一般篩選得到的野生菌株，其產(chǎn)酶活性往往不會很高。因此，提高菌株的產(chǎn)酶活力，獲得純度相對較高的瓊膠酶，對采用酶解法生產(chǎn)瓊膠寡糖具有重要的意義。應用微生物誘變育種技術提高菌株的產(chǎn)酶活力，并對發(fā)酵得到的瓊膠酶進行分離純化，使瓊膠酶的活力和純度都大大提高，有利于瓊膠酶及其產(chǎn)物在工業(yè)和科學研究領域的應用。
[0006]瓊膠酶主要來源于海洋軟體動物和海洋微生物。分解瓊膠的細菌主要存在于海洋環(huán)境中。自從19 O 2年Gr an第一次從海水中分離到瓊膠降解細菌一瓊膠假單胞菌(Psudomonas galatica)以來，人們已經(jīng)從海水系統(tǒng)中分離到多種瓊膠分解菌。如iCytophaga （ 遼細胞菌屬)(Duckworth M et al., 1968)、Vibrio (弧菌屬)(Aoki etal., 1990)、Streptomyces (鏈霉菌屬)(Bibb MJ et al., 1987)、Pseudomonas~like (類假單胞菌屬)(Von Hofsten B et al.，1975)、Wierococcw1S (交替球菌屬)(ShiehWY et al., 1998)Pseudomonas (假單胞菌屬)(Belas R et al., 1989)Pseudomanas(井氏假單胞菌)(王選良，1985)、Wierfflmas agarlytics GJlB (交替假單胞菌)(Potin et al., 1993)、Thalassomonas sp.JAMB-A33 (海洋嗜冷單胞菌)(Ohtaet al., 2005)。因此篩選新的微生物法制備瓊膠酶稱為研究者的新任務。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一株海旋藻，以及一種利用此菌株制備瓊膠酶的方法。
[0008]本發(fā)明的技術方案:一株篩選自廈門近海海域的海水采取樣液中的細菌，可以用于制備瓊膠酶(agarase),其分類命名為海旋菌(Jhalassospira sp.) fjfst-2013007,已于2013年12月25日在保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心登記保藏，其保藏編號為CCTCC M2013708，保藏地址為武漢大學。
[0009]微生物菌株的篩選與鑒定:
本發(fā)明從廈門近海海域的海水采取樣液，接種到富集培養(yǎng)基中進行光照培養(yǎng)后涂布于瓊脂篩選培養(yǎng)基上，在25°C下，培養(yǎng)48h挑選有明顯凹陷的菌落進入瓊脂篩選培養(yǎng)基中進行劃線分離純化，純種接到發(fā)酵培養(yǎng)基25 °C，120 rpm,搖瓶培養(yǎng)24_72h，檢測培養(yǎng)基中的瓊脂酶活力，最終篩選出目標菌株，對其進行生理生化特性鑒定和分子生物學實驗指南進行16s rDNA序列分析,確定其屬于海旋菌sp.),擬命名為海旋菌(Thalassospirasp.) fj fst-2013007。
[0010]用所述海旋菌sp.) fjfst-2013007生產(chǎn)瓊膠酶的方法包括如下步驟:
(1)將海旋菌sp.) f jfst_2013007在種子培養(yǎng)基中，用250mL錐形瓶裝20-60mL種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并接種菌落，接種后于20-30°C 160rpm搖床培養(yǎng)12-24h后得到種子發(fā)酵液；
(2)用250mL錐形瓶裝30mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并按6%_10%的接種量，將種子發(fā)酵液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后于25-30°C，160rpm搖床培養(yǎng)培養(yǎng)48-72h后得到含瓊膠酶的發(fā)酵液；
(3)而后將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過4°C，6000-8000g冷凍離心10_20min之后，取上清液； (4)將上清液加入質(zhì)量分數(shù)為60%-80%的飽和硫酸銨進行鹽析，放置冰箱過夜，4°C，8000-10000g 離心 20-40min 取沉淀；
(5)用緩沖液A 平衡 DEAE-Sepharose Fast Flow 柱(C>2cm X 10cm),過 4-5 個床體積。稱取0.3g瓊膠酶粉溶于8mL緩沖液A中，6000g離心20min后取上清液上離子交換柱。上樣后用緩沖液A過2-3個床體積洗去沒有被吸附的雜蛋白，然后用以緩沖液A配制的0-0.5mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫。流速控制在0.5mL/min,檢測波長為280nm。洗脫液分部收集，4.5mL/管。測定洗脫管峰部分的試管中溶液的酶活力，將有活性的部分合并，冷凍干燥后得酶半成品；
(6)將SephcrylS-100凝膠過濾層析柱(Φ 1.6cm X80cm)用緩沖液A平衡后,稱取半成品瓊膠酶0.05g溶于4mL平衡緩沖液中，6000g低溫離心20min后取上清液上層析柱。用緩沖液A進行洗脫，控制流速為0.lmL/min。洗脫液經(jīng)紫外檢測并分部收集(4.0mL/管)。分別測定出峰部分試管的酶活力，將有活性的部分合并，經(jīng)充分透析脫鹽后經(jīng)超濾膜濃縮，對濃縮液冷凍干燥，得成品瓊膠酶。
[0011]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:海鹽20-30g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母粉0.5-2.5g/L，瓊脂
1.5-2.5g/L，調(diào)節(jié)pH為7.2-8.4，去離子水配制；所述的種子培養(yǎng)基:瓊脂2g/ L,海鹽30g/L,蛋白胨5g,酵母粉lg, PH為8.0,去離子水配制。
[0012]所述的緩沖液A為0.02mol/L，pH7.5的Tris-HCl緩沖液。
[0013]用該方法生產(chǎn)的瓊膠酶的檢測方法:
取上述步驟(3)得到含有瓊膠酶的發(fā)酵液上清液lmL，加入ImL的PBS緩沖液(其中含有瓊膠0.2%)，置于40°C水浴鍋中酶解30min，后加入1.5mLDNS,沸水浴15min。冷卻至室溫后，用蒸懼水補齊刻度，使用分光光度計在520nm下進行檢測。IU定義為Imin產(chǎn)生Iug瓊膠寡糖的值。
[0014]本發(fā)明的有益效果:篩選出一種用于微生物法生產(chǎn)瓊膠酶的菌株，分類命名為海HiMiThalassospira sp.)fjfst-2013007。本發(fā)明以該菌作為菌種，國內(nèi)還未見有用該菌種生產(chǎn)瓊膠酶的報告。該菌以常見碳源，氮源，無機鹽組成的發(fā)酵培養(yǎng)基，生產(chǎn)周期短，IOh可達到對數(shù)生長期，該菌種能誘導表達瓊膠酶，可以在24h內(nèi)達到最大酶產(chǎn)量。通過簡單的分離純化方法可在粗酶液中收集得到活性高的瓊膠酶。本發(fā)明所使用的瓊膠酶制備及純化工藝簡單，成本低廉，且產(chǎn)酶時間短，適合用于工業(yè)生產(chǎn)或醫(yī)藥領域，食品化工和海產(chǎn)養(yǎng)殖等領域。
【具體實施方式】
[0015]以下是說明本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明并不限于此。
[0016]實施例1
取廈門近海海域的海水采取樣液，吸取Iml進行稀釋(10_\ IO-2, IO-3, IO-4,)，吸取
0.5ml涂布于瓊脂篩選培養(yǎng)基上，在25°C下，培養(yǎng)48h挑選有明顯凹陷的菌落進入瓊脂篩選培養(yǎng)基中進行劃線分離純化，將純種接到液體培養(yǎng)基25 V，IOOrpm,搖瓶培養(yǎng)48h，離心取上清，采用分光光度法檢測培養(yǎng)基中的瓊脂酶活性，經(jīng)過初篩，共分離獲得3株能長瓊膠酶的細菌，結合瓊膠酶的生產(chǎn)能力，最終選定作為出發(fā)菌株。
[0017]實施例2
經(jīng)形態(tài)學和生理生化特性研究，產(chǎn)瓊膠酶菌株的特征如下:
菌落形態(tài):菌落呈現(xiàn)出圓形，表面光滑，乳白色，邊緣有整齊。
[0018]細胞形態(tài):此為革蘭氏陰性菌，形態(tài)為似弧菌狀。
[0019]生理生化特征:為嚴格需氧，能利用淀粉，，葡萄糖，蔗糖，醋酸鈉，D-半乳糖等多種化合物作為碳源，也可以利用蛋白胨，酵母膏，硝酸銨，硫酸銨，等多種化合物作為氮源。
[0020]對菌株的16S rRNA基因進行PCR擴增與序列測定，發(fā)現(xiàn)其16S rRNA的基因部分片斷長度為1487bp，經(jīng)過NCBI和 核糖體數(shù)據(jù)庫進行比對，鑒定為海旋菌
sp.),擬命名為海旋菌sp.) f jfst-2013007,菌株的16S rRNA序列具體可見序列表。[0021]實施例3
(I)將海旋菌(?asp.) fjfst-2013007在種子培養(yǎng)基中，用250mL維形
瓶裝30mL種子培養(yǎng)基,按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并接種菌落，接種后于25°C, 140rpm搖床培養(yǎng)24h后得到種子發(fā)酵液，所述種子培養(yǎng)基為:海鹽25g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉lg/L，瓊脂2g/L,調(diào)節(jié)pH為7.4,去離子水配制。
[0022](2)用250mL錐形瓶裝30mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并按4%的接種量，將種子發(fā)酵液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后于25°C，140rpm搖床培養(yǎng)培養(yǎng)48h后得到含瓊膠酶的發(fā)酵液，所述種子培養(yǎng)基為:海鹽25g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉lg/L，瓊脂2g/L，調(diào)節(jié)pH為7.4，去離子水配制。
[0023]該實施例所得的瓊膠酶的活力為1.71U/mL 實施例4
(I)將海旋菌sp) fjfst-2013007在種子培養(yǎng)基中，用250mL錐形瓶裝30mL種子培養(yǎng)基,按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并接種菌落，接種后于25°C, 160rpm搖床培養(yǎng)24h后得到種子發(fā)酵液，所述的種子培養(yǎng)基:瓊脂2g/ L,海鹽30 g/L，蛋白胨5g，酵母粉lg, PH為8.0，去離子水配制。
[0024](2)用250mL錐形瓶裝30mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并按6%的接種量，將種子發(fā)酵液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，接種后于25°C，160rpm搖床培養(yǎng)培養(yǎng)72h后得到含瓊膠酶的發(fā)酵液，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:海鹽25g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉lg/L，瓊脂2.5g/L，調(diào)節(jié)pH為7.5,去離子水配制；。
[0025]該實施例所得的瓊膠酶的活力為11.2U/mL 實施例5
(I)將上述發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過4°C，8000g冷凍離心15min之后，取上清液。
[0026](2)將上清液加入質(zhì)量分數(shù)為80%的飽和硫酸銨進行鹽析，放置冰箱過夜，4°C，1000Og離心30min取沉淀。
[0027](3)用緩沖液 A ( 0.02mol/L, pH7.5 的 Tris-HCl 緩沖液)平衡 DEAE-SepharoseFast Flow柱(C>2cm X 10cm),過4_5個床體積。稱取0.3g瓊膠酶粉溶于8mL緩沖液A中，6000g離心20min后取上清液上離子交換柱。上樣后用緩沖液A過2_3個床體積洗去沒有被吸附的雜蛋白，然后用以緩沖液A配制的0-0.5mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫。流速控制在0.5mL/min,檢測波長為280nm,洗脫液分部收集,4.5mL/管。測定洗脫管峰部分的試管中溶液的酶活力，將有活性的部分合并，冷凍干燥后得酶半成品。
[0028](4)將Sephcryl S-100凝膠過濾層析柱(Φ 1.6cm X80cm)用緩沖液A平衡后，稱取半成品瓊膠酶0.05g溶于4mL平衡緩沖液中，6000g低溫離心20min后取上清液上層析柱。用緩沖液A進行洗脫，控制流速為0.lmL/min。洗脫液經(jīng)紫外檢測并分部收集(4.0mL/管)。分別測定出峰部分試管的酶活力，將有活性的部分合并，經(jīng)充分透析脫鹽后經(jīng)超濾膜濃縮，對濃縮液冷凍干燥，得成品瓊膠酶。
【權利要求】
1.一株海旋菌，其特征在于:所述海旋菌為海旋HThalassospira sp.)fjfst-2013007，已于2013年12月25日在保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心登記保藏，其保藏編號為 CCTCC M 2013708。
2.根據(jù)權利要求1所述的一株海旋菌，其特征在于:所述海旋菌sp.)fjfst-2013007 的 16S rRNA 的序列如 SEQ ID N0.1 所示。
3.—種如權利要求1所述的一株海旋菌的用途，其特征在于:用于制備瓊膠酶。
4.一種如權利要求1所述的一株海旋菌用于制備瓊膠酶的方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟: (1)用250mL錐形瓶裝20-60mL種子培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并接種菌落，接種后于20-30°C，160rpm搖床培養(yǎng)12_24h后得到種子發(fā)酵液； (2)用250mL錐形瓶裝20_60mL發(fā)酵培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌，冷卻，并按2%_10%的接種量，將種子發(fā)酵液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，20-30°C培養(yǎng)24-60h后得到含瓊膠酶的發(fā)酵液； (3)而后將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過4°C，8000-10000g冷凍離心10_20min之后，取上清液； (4)將上清液加入質(zhì)量分數(shù)為60%-80%的飽和硫酸銨進行鹽析，放置冰箱過夜，4°C，8000-10000g 離心 20-40min 取沉淀； (5)用緩沖液A平衡DEAE-SepharoseFast Flow柱,過4_5個床體積,稱取0.3g瓊膠酶粉溶于8mL緩沖液A中，6000g離心20min后取上清液上離子交換柱，上樣后用緩沖液A過2-3個床體積洗去沒有被吸附的雜蛋白，然后用以緩沖液A配制的0-0.5mol/L的NaCl溶液進行梯度洗脫；流速控制在0.5mL/min，檢測波長為280nm，洗脫液分部收集，4.5mL/管，測定洗脫管峰部分的試管中溶液的酶活力，將有活性的部分合并，冷凍干燥后得酶半成品； (6)將SephcrylS-100凝膠過濾層析柱用緩沖液A平衡后，稱取半成品瓊膠酶0.05g溶于4mL平衡緩沖液中，6000g低溫離心20min后取上清液上層析柱，用緩沖液A進行洗脫，控制流速為0.lmL/min，洗脫液經(jīng)紫外檢測并分部收集，4.0mL/管，分別測定出峰部分試管的酶活力，將有活性的部分合并，經(jīng)充分透析脫鹽后經(jīng)超濾膜濃縮，對濃縮液冷凍干燥，得成品瓊膠酶。
5.根據(jù)權利要求4所述的一株海旋菌用于制備瓊膠酶的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基為:海鹽20-30g/L，蛋白胨3-7g/L，酵母粉0.5-2.5g/L，瓊脂1.5-2.5g/L，調(diào)節(jié)pH為7.2-8.4，去離子水配制；所述的種子培養(yǎng)基:瓊脂2g/ L，海鹽30 g/L，蛋白胨5g，酵母粉lg, PH為8.0,去離子水配制。
6.根據(jù)權利要求4所述的一株海旋菌用于制備瓊膠酶的方法，其特征在于:所述的緩沖液 A 為 0.02mol/L，ρΗ7.5 的 Tris-HCl 緩沖液。
【文檔編號】C12R1/01GK103898012SQ201410093126
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月14日 優(yōu)先權日:2014年3月14日
【發(fā)明者】張龍濤, 曾誠, 曾紹校, 鄭寶東, 張怡, 黃旭輝, 歐洋 申請人:福建農(nóng)林大學