系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€核細胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達基因模型的構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€核細胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達基因模型的構(gòu)建方法與應(yīng)用，構(gòu)建方法包括以下步驟：設(shè)置SLE組與正常對照組，每組包括若干份全血標本，分離得到外周血單個核細胞；測定標本RNA的含量、質(zhì)量與完整性，確定可用則執(zhí)行下一步驟；采用T-UCR芯片分析人體T-UCRs表達水平，檢測基因特異性探針標記的UCRs；進行RNA標記和芯片雜交；采用特征提取方法，分析芯片掃描結(jié)果；采用FC過濾鑒定差異表達的潛在T-UCRs及與其重疊UCRs的RNA轉(zhuǎn)錄子，采用GO分析測定與UCRs相關(guān)聯(lián)的差異性mRNA在生物進程中的作用；比較兩組中各標本間的倍數(shù)變化，篩選出表達差異的RNA。
【專利說明】系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€核細胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達基因模型的構(gòu)建方法與應(yīng)用【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及系統(tǒng)性紅斑狼瘡領(lǐng)域，尤其涉及一種系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€核細胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達基因模型的構(gòu)建方法與應(yīng)用。
【【背景技術(shù)】】
[0002]系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一種與彌漫性結(jié)締組織相關(guān)的典型的全身性自身免疫病，其具有重要的特征是發(fā)生免疫炎癥。SLE的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及家族遺傳，免疫和環(huán)境因素等，可能會導(dǎo)致組織和器官的損害，其中最復(fù)雜的是腎功能損害。
[0003]最近研究發(fā)現(xiàn)，在人、小鼠和大鼠基因中極度保守的長段非編碼基因區(qū)域，命名為超保守區(qū)域(ultra-conserved regions, UCRs)。UCR 為長約 200 ~779bp 的序列，最初于2004年由Be j erano發(fā)現(xiàn)。UCR常位于腫瘤相關(guān)的基因區(qū)域或脆性位點。UCR編碼的一群特殊的非編碼核糖核酸(ncRNA),稱為超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子(transcribedultraconserved regions, T-UCRs),在人腫瘤中其表達發(fā)生變化。T-UCR是長鏈非編碼核糖核酸(Long-noncoding RNA, IncRNA)重要組成部分,轉(zhuǎn)錄自人類基因組中481個極度保守區(qū)域(Ultraconserved regions),在白血病、肝癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)母細胞瘤等多種癌癥中會改變表達模式。這表明，T-UCRs參與癌癥生物學和腫瘤發(fā)生，并有可能作為疾病診斷，預(yù)后和預(yù)測的指標，以及一類新的治療靶點。
[0004]但是，T-UCRs尚未有應(yīng)用于SLE的研究。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005]有鑒于此，有必要提出系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€核細胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達基因模型的構(gòu)建方法與應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的一個技術(shù)方案是系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€核細胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達基因模型的構(gòu)建方法，其包括以下步驟:SI，設(shè)置系統(tǒng)性紅斑狼瘡組與正常對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的全血標本，分別分離得到外周血單個核細胞；S2，測定標本核糖核酸的含量、質(zhì) 量與完整性，確定可用，則執(zhí)行下一步驟；S3，采用超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子芯片分析人體超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子表達水平，檢測基因特異性探針標記的超保守區(qū)域基因；S4，進行核糖核酸標記和芯片雜交；S5，采用特征提取方法，分析獲得的芯片掃描結(jié)果，過濾低強度表達的探針，將原始信號探針的強度進行歸一化；S6，采用倍數(shù)變化方法過濾鑒定差異表達的潛在的超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子及與其重疊超保守區(qū)域的核糖核酸轉(zhuǎn)錄子，并采用基因本體論方法分析測定與超保守區(qū)域相關(guān)聯(lián)的差異性的信使核糖核酸在生物進程中的作用；S7，比較所述系統(tǒng)性紅斑狼瘡組與所述正常對照組中各標本間的倍數(shù)變化，篩選出表達差異的核糖核酸。
[0007]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，步驟S2中，采用全波長超微量分光光度計測定標本核糖核酸的含量與質(zhì)量，用瓊脂凝膠電泳評估標本核糖核酸的完整性。
[0008]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，步驟S3中，在各超保守區(qū)域基因的兩端分別添加Ikb的片段，然后用40bp的特異性探針標記。
[0009]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，步驟S4中，采用單色芯片基底基因表達分析方案進行核糖核酸標記和芯片雜交，把信使核糖核酸和長鏈非編碼核糖核酸在去除核糖體核糖核酸后從總核糖核酸中純化出來。
[0010]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，步驟S5中，篩選出至少1/3樣本的信使核糖核酸和長鏈非編碼核糖核酸。
[0011]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，步驟S7中，設(shè)置所述倍數(shù)變化的閾值> 2.0。
[0012]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，所述基因模型中，包括表達上調(diào)的8個超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子，以及表達下調(diào)的29個超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子，并且，各所述超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子均為外顯子。
[0013]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，表達上調(diào)的8個超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子包括uc.285+、uc.234+、uc.102+、uc.341+、uc.267+、uc.221-、uc.290-以及 uc.90+，表達下調(diào)的 32 個超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子包括 uc.101-、uc.138-、uc.141-、uc.144-、uc.151-、uc.166-、uc.173+、uc.185-、uc.186-、uc.208-、uc.209-、uc.266+、uc.267+、uc.268-、uc.276+、uc.280+、uc.28+、uc.324_、uc.36+、uc.418-、uc.419-、uc.420_、uc.45_、uc.455-、uc.457-、uc.46_、uc.475+、uc.50_、uc.61_、uc.63_、uc.77-以及 uc.97+。
[0014]本發(fā)明的又一個技術(shù)方案是采用任一上述構(gòu)建方法所得到的系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€核細胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達基因模型在獲取系統(tǒng)性紅斑狼瘡標志物的應(yīng)用。
[0015]優(yōu)選的，所述應(yīng)用中，所述基因模型包括基因HNRNPH1。
[0016]上述方案獲得了外周血單個核細胞的T-UCRs的差異表達情況相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因，可能作為SLE的潛在的生物標志物或是治療靶點，并且由于標本量小而且結(jié)果的穩(wěn)定性和準確性，對于臨床方面的轉(zhuǎn)錄表達調(diào)控研究具有特別重要的意義。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0017]圖1是本發(fā)明一個實施例的示意圖。
【【具體實施方式】】
[0018]為了便于理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實施例，對本發(fā)明進行更詳細的說明。附圖中給出了本發(fā)明的較佳的實施例。但是，本發(fā)明可以采用許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本說明書所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。
[0019] 除非另有定義，本說明書所使用的所有的技術(shù)和科學術(shù)語與屬于本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本說明書中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不是用于限制本發(fā)明。本說明書所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。
[0020]本發(fā)明旨在通過對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的單個核細胞的T-UCRs的表達水平研究，發(fā)現(xiàn)其臨床病理特征，以及新的可能的診斷或預(yù)后生物標志物。如圖1所示，本發(fā)明的一個實施例是，系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€核細胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達基因模型的構(gòu)建方法，其包括以下步驟:S1，設(shè)置系統(tǒng)性紅斑狼瘡組與正常對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的全血標本，分別分離得到外周血單個核細胞；S2，測定標本核糖核酸的含量、質(zhì)量與完整性，確定可用，則執(zhí)行下一步驟；S3，采用超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子芯片分析人體超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子表達水平，檢測基因特異性探針標記的超保守區(qū)域基因；S4，進行核糖核酸標記和芯片雜交；S5，采用特征提取方法，分析獲得的芯片掃描結(jié)果，過濾低強度表達的探針，將原始信號探針的強度進行歸一化；S6，采用倍數(shù)變化方法過濾鑒定差異表達的潛在的超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子及與其重疊超保守區(qū)域的核糖核酸轉(zhuǎn)錄子，并采用基因本體論方法分析測定與超保守區(qū)域相關(guān)聯(lián)的差異性的信使核糖核酸在生物進程中的作用；S7，比較所述系統(tǒng)性紅斑狼瘡組與所述正常對照組中各標本間的倍數(shù)變化，篩選出表達差異的核糖核酸。
[0021]又一個實施例是，系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€核細胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達基因模型的構(gòu)建方法，其包括以下步驟。
[0022]SI，設(shè)置系統(tǒng)性紅斑狼瘡組與正常對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的全血標本，分別分離得到外周血單個核細胞；優(yōu)選的，分離后置于_80°C保存。
[0023]例如，本發(fā)明各實施例采用兩組全血標本，采集時間為2011年I月-9月，分別來自15名系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者和15名健康正常對照組，對應(yīng)作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡組與正常對照組。如表1所示，這兩組全血標本均來自中國廣西桂林第一八一醫(yī)院，標本分離得到所需外周血單個核細胞后放置于_80°C保存。需要說明的是，標本收集的方案與執(zhí)行，均獲得廣西代謝性疾病重點實驗室和第一八一醫(yī)院倫理委員會的批準。
[0024]表1系統(tǒng)性紅斑狼瘡標本特征(n=15)
[0025]
【權(quán)利要求】
1.系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€核細胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達基因模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: S1，設(shè)置系統(tǒng)性紅斑狼瘡組與正常對照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的全血標本，分別分離得到外周血單個核細胞； S2，測定標本核糖核酸的含量、質(zhì)量與完整性，確定可用，則執(zhí)行下一步驟； S3，采用超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子芯片分析人體超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子表達水平，檢測基因特異性探針標記的超保守區(qū)域基因； S4，進行核糖核酸標記和芯片雜交； S5，采用特征提取方法，分析獲得的芯片掃描結(jié)果，過濾低強度表達的探針，將原始信號探針的強度進行歸一化； S6，采用倍數(shù)變化方法過濾鑒定差異表達的潛在的超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子及與其重疊超保守區(qū)域的核糖核酸轉(zhuǎn)錄子，并采用基因本體論方法分析測定與超保守區(qū)域相關(guān)聯(lián)的差異性的信使核糖核酸在生物進程中的作用； S7，比較所述系統(tǒng)性紅斑狼瘡組與所述正常對照組中各標本間的倍數(shù)變化，篩選出表達差異的核糖核酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S2中，采用全波長超微量分光光度計測定標本核糖核酸的含量與質(zhì)量，用瓊脂凝膠電泳評估標本核糖核酸的完整性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S3中，在各超保守區(qū)域基因的兩端分別添加Ikb的片段，然后用40bp的特異性探針標記。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S4中，采用單色芯片基底基因表達分析方案進行核糖核酸標記和芯片雜交，把信使核糖核酸和長鏈非編碼核糖核酸在去除核糖體核糖核酸后從總核糖核酸中純化出來。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S5中，篩選出至少1/3樣本的信使核糖核酸和長鏈非編碼核糖核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S7中，設(shè)置所述倍數(shù)變化的閾值^ 2.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述構(gòu)建方法，其特征在于，所述基因模型中，包括表達上調(diào)的8個超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子，以及表達下調(diào)的32個超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子，并且，各所述超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子均為外顯子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述構(gòu)建方法，其特征在于，表達上調(diào)的8個超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子包括uc.285+、uc.234+、uc.102+、uc.341+、uc.267+、uc.221-、uc.290-以及 uc.90+,表達下調(diào)的 32 個超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子包括 uc.101-、uc.138-、uc.141-、uc.144-、uc.151-、uc.166-、uc.173+、uc.185-、uc.186-、uc.208-、uc.209-、uc.266+、uc.267+、uc.268-、uc.276+、uc.280+、uc.28+、uc.324_、uc.36+、uc.418_、uc.419_、uc.420_、uc.45_、uc.455_、uc.457-、uc.46-、uc.475+、uc.50-、uc.61-、uc.63-、uc.77-以及 uc.97+。
9.采用如權(quán)利要求1至8任一所述構(gòu)建方法所得到的系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎獑蝹€核細胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達基因模型在獲取系統(tǒng)性紅斑狼瘡標志物的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述應(yīng)用，其特征在于，所述基因模型包括基因HNRNPH1。
【文檔編號】C12N5/0786GK103911437SQ201410093623
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】眭維國, 戴勇, 曹翠輝, 薛雯 申請人:眭維國, 戴勇