尿毒癥外周血單個(gè)核細(xì)胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因模型的構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及尿毒癥外周血單個(gè)核細(xì)胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因模型的構(gòu)建方法與應(yīng)用，構(gòu)建方法包括以下步驟：設(shè)置尿毒癥組與正常對(duì)照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的全血標(biāo)本，分別分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞；測定標(biāo)本核糖核酸的含量、質(zhì)量與完整性；采用超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子芯片分析人體超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子表達(dá)水平，檢測基因特異性探針標(biāo)記的超保守區(qū)域基因；進(jìn)行核糖核酸標(biāo)記和芯片雜交；分析獲得的芯片掃描結(jié)果；過濾鑒定差異表達(dá)的潛在的超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子及與其重疊超保守區(qū)域的核糖核酸轉(zhuǎn)錄子；比較尿毒癥組與正常對(duì)照組中各標(biāo)本間的倍數(shù)變化，篩選出表達(dá)差異的核糖核酸；選取表達(dá)差異超過預(yù)設(shè)差異閾值的核糖核酸構(gòu)建基因模型。
【專利說明】尿毒癥外周血單個(gè)核細(xì)胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因模型的構(gòu)建方法與應(yīng)用
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及尿毒癥領(lǐng)域，尤其涉及一種尿毒癥外周血單個(gè)核細(xì)胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達(dá)的構(gòu)建方法與應(yīng)用。
【【背景技術(shù)】】
[0002]尿毒癥(Uremia)并非一種單一疾病，而是由于腎功能衰竭致使代謝產(chǎn)物和其他有毒物質(zhì)在體內(nèi)蓄積而起的一種自身中毒綜合癥，是腎功能衰竭最嚴(yán)重的表現(xiàn)。有尿毒癥的患者患心血管疾病的患病率和死亡率高出普通人的好幾倍。在目前的臨床實(shí)踐中，對(duì)于診斷尿毒癥，從臨床癥狀，實(shí)驗(yàn)室檢查或圖像進(jìn)行分析，當(dāng)慢性腎功能衰竭的在終末期時(shí)，需要腎臟替代治療法，如血液透析或腎移植，而腎臟替代治療方面，仍然使用水溶性小分子物質(zhì)測定作為指標(biāo)，對(duì)尿毒癥患者的預(yù)測性較差。
[0003]最近研究發(fā)現(xiàn)，在人、小鼠和大鼠基因中極度保守的長段非編碼基因區(qū)域，命名為超保守區(qū)域(ultra-conserved regions, UCRs)。UCR為長約200~779bp的序列，最初于2004年由Bejerano發(fā)現(xiàn)。UCR常位于腫瘤相關(guān)的基因區(qū)域或脆性位點(diǎn)。UCR編碼的一群特殊的非編碼RNA (ncRNA),稱為超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子(transcribed ultraconservedregions, T-UCRs)，在人腫瘤中其表達(dá)發(fā)生變化。T-UCR是長鏈非編碼核糖核酸(Long-noncoding RNA, IncRNA)重要組成部分,轉(zhuǎn)錄自人類基因組中481個(gè)極度保守區(qū)域(Ultraconserved regions),在白血病、肝癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等多種癌癥中會(huì)改變表達(dá)模式。這表明，T-UCRs參與癌癥生物學(xué)和腫瘤發(fā)生，并有可能作為疾病診斷，預(yù)后和預(yù)測的指標(biāo)，以及一類新的治療靶點(diǎn)。
[0004]但是，T-UCRs尚未有應(yīng)用于尿毒癥的研究。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0005]有鑒于此，有必要提出尿毒癥外周血單個(gè)核細(xì)胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達(dá)的構(gòu)建方法與應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的一個(gè)技術(shù)方案是尿毒癥外周血單個(gè)核細(xì)胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因模型的構(gòu)建方法，其包括以下步驟:Si，設(shè)置尿毒癥組與正常對(duì)照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的全血標(biāo)本，分別分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞；S2，測定標(biāo)本核糖核酸的含量、質(zhì)量與完整性，確定可用，則執(zhí)行下一步驟；S3，采用超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子芯片分析人體超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子表達(dá)水平，檢測基因特異性探針標(biāo)記的超保守區(qū)域基因；S4，進(jìn)行核糖核酸標(biāo)記和芯片雜交；S5，采用特征提取方法，分析獲得的芯片掃描結(jié)果；S6，采用倍數(shù)變化方法過濾鑒定差異表達(dá)的潛在的超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子及與其重疊超保守區(qū)域的核糖核酸轉(zhuǎn)錄子；S7，比較所述尿毒癥組與所述正常對(duì)照組中各標(biāo)本間的倍數(shù)變化，篩選出表達(dá)差異的核糖核酸；S8、選取表達(dá)差異超過預(yù)設(shè)差異閾值的核糖核酸構(gòu)建基因模型。
[0007] 優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，步驟S2中，采用全波長超微量分光光度計(jì)測定標(biāo)本核糖核酸的含量與質(zhì)量，采用瓊脂凝膠電泳方法評(píng)估標(biāo)本核糖核酸的完整性。
[0008]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，步驟S3中，在各超保守區(qū)域基因的兩端分別添加Ikb的片段，然后用40bp的特異性探針標(biāo)記。
[0009]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，步驟S4中，采用單色芯片基底基因表達(dá)分析方案進(jìn)行核糖核酸標(biāo)記和芯片雜交。
[0010]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，步驟S5中，過濾低強(qiáng)度表達(dá)的探針，將原始信號(hào)探針的強(qiáng)度進(jìn)行歸一化。
[0011]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，步驟S7中，設(shè)置所述倍數(shù)變化的閾值> 2.0。
[0012]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，步驟S8中，所述基因模型中，包括若干超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子，并且，各所述超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子均為外顯子。
[0013]優(yōu)選的，所述構(gòu)建方法中，所述基因模型中，包括表達(dá)上調(diào)的21個(gè)超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子以及表達(dá)下調(diào)的49個(gè)超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子；其中，表達(dá)上調(diào)的21個(gè)超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子包括 uc.1ll+、uc.16_、uc.162+、uc.166-、uc.189+、uc.208-、uc.209-、uc.221-、uc.234+、uc.285+、uc.290_、uc.324_、uc.33+、uc.341+、uc.342+、uc.455_、uc.477+、uc.61_、uc.77-、uc.90+以及uc.95+ ;表達(dá)下調(diào)的49個(gè)超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子包括uc.101_、uc.102_、uc.138-、uc.141-、uc.144-、uc.151-、uc.166-、uc.173+、uc.185-、uc.186-、uc.203+、uc.208-、uc.209-、uc.210-、uc.233+、uc.266+、uc.267+、uc.268-、uc.276+、uc.280+、uc.28+、uc.282+、uc.313-、uc.338+、uc.341 +、uc.356+、uc.36+、uc.414-、uc.418-、uc.419-、uc.419+、uc.420_、uc.45_、uc.46_、uc.453_、uc.454_、uc.455_、uc.456+、uc.457_、uc.46-、uc.475+、uc.477+、uc.50-、uc.61+、uc.63-、uc.77-、uc.84-、uc.89+ 以及 uc.97+。
[0014]本發(fā)明的又一個(gè)技術(shù)方案是釆用任一上述構(gòu)建方法所得到的尿毒癥外周血單個(gè)核細(xì)胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因模型在獲取尿毒癥標(biāo)志物的應(yīng)用。
[0015]優(yōu)選的，所述應(yīng)用中，所述基因模型包括基因RBF0X2。
[0016]上述方案獲得了外周血單個(gè)核細(xì)胞的T-UCRs的差異表達(dá)情況相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵基因，可能作為尿毒癥的潛在的生物標(biāo)志物或是治療靶點(diǎn)，并且由于標(biāo)本量小而且結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，對(duì)于臨床方面的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控研究具有特別重要的意義。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0017]圖1是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的示意圖。
【【具體實(shí)施方式】】
[0018]為了便于理解本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說明。附圖中給出了本發(fā)明的較佳的實(shí)施例。但是，本發(fā)明可以采用許多不同的形式來實(shí)現(xiàn)，并不限于本說明書所描述的實(shí)施例。相反地，提供這些實(shí)施例的目的是使對(duì)本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。
[0019]除非另有定義，本說明書所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與屬于本發(fā)明的【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本說明書中在本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施例的目的，不是用于限制本發(fā)明。本說明書所使用的術(shù)語“和/或”包括一個(gè)或多個(gè)相關(guān)的所列項(xiàng)目的任意的和所有的組合。[0020]本發(fā)明旨在通過對(duì)尿毒癥的單個(gè)核細(xì)胞的T-UCRs的表達(dá)水平研究，發(fā)現(xiàn)其臨床病理特征，以及新的可能的診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物。如圖1所示，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例是，尿毒癥外周血單個(gè)核細(xì)胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因模型的構(gòu)建方法，其包括以下步驟:SI，設(shè)置尿毒癥組與正常對(duì)照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的全血標(biāo)本，分別分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞；S2，測定標(biāo)本核糖核酸的含量、質(zhì)量與完整性，確定可用，則執(zhí)行下一步驟；S3，采用超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子芯片分析人體超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子表達(dá)水平，檢測基因特異性探針標(biāo)記的超保守區(qū)域基因；S4，進(jìn)行核糖核酸標(biāo)記和芯片雜交；S5，采用特征提取方法，分析獲得的芯片掃描結(jié)果；S6，采用倍數(shù)變化方法過濾鑒定差異表達(dá)的潛在的超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子及與其重疊超保守區(qū)域的核糖核酸轉(zhuǎn)錄子；S7，比較所述尿毒癥組與所述正常對(duì)照組中各標(biāo)本間的倍數(shù)變化，篩選出表達(dá)差異的核糖核酸；S8、選取表達(dá)差異超過預(yù)設(shè)差異閾值的核糖核酸構(gòu)建基因模型。
[0021]又一個(gè)實(shí)施例是，尿毒癥外周血單個(gè)核細(xì)胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因模型的構(gòu)建方法，其包括以下步驟。
[0022]SI，設(shè)置尿毒癥組與正常對(duì)照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的全血標(biāo)本，分別分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞；
[0023]例如，本發(fā)明各實(shí)施例采用兩組全血標(biāo)本，采集時(shí)間為2011年I月-9月，分別來自15名尿毒癥患者和15名健康正常對(duì)照組，對(duì)應(yīng)作為尿毒癥組與正常對(duì)照組。如表1所示，這兩組全血標(biāo)本均來自中國廣西桂林第一八一醫(yī)院，標(biāo)本分離得到所需外周血單個(gè)核細(xì)胞后放置于_80°C保存。需要說明的是，標(biāo)本收集的方案與執(zhí)行，均獲得廣西代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和第一八一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。
[0024]表1尿毒癥標(biāo)本特征(n=15)
【權(quán)利要求】
1.尿毒癥外周血單個(gè)核細(xì)胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因模型的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟: SI，設(shè)置尿毒癥組與正常對(duì)照組，每組包括若干份相異人體的已經(jīng)脫離人體的全血標(biāo)本，分別分離得到外周血單個(gè)核細(xì)胞； S2，測定標(biāo)本核糖核酸的含量、質(zhì)量與完整性，確定可用，則執(zhí)行下一步驟； S3，采用超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子芯片分析人體超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子表達(dá)水平，檢測基因特異性探針標(biāo)記的超保守區(qū)域基因； S4，進(jìn)行核糖核酸標(biāo)記和芯片雜交； S5，采用特征提取方法，分析獲得的芯片掃描結(jié)果； S6，采用倍數(shù)變化方法過濾鑒定差異表達(dá)的潛在的超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子及與其重疊超保守區(qū)域的核糖核酸轉(zhuǎn)錄子； S7，比較所述尿毒癥組與所述正常對(duì)照組中各標(biāo)本間的倍數(shù)變化，篩選出表達(dá)差異的核糖核酸； S8、選取表達(dá)差異超過預(yù)設(shè)差異閾值的核糖核酸構(gòu)建基因模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S2中，采用全波長超微量分光光度計(jì)測定標(biāo)本核糖核酸的含量與質(zhì)量，采用瓊脂凝膠電泳方法評(píng)估標(biāo)本核糖核酸的完整性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S3中，在各超保守區(qū)域基因的兩端分別添加Ikb的片段，然后用40bp的特異性探針標(biāo)記。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S4中，采用單色芯片基底基因表達(dá)分析方案進(jìn)行核糖核酸標(biāo)記和芯片雜交。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S5中，過濾低強(qiáng)度表達(dá)的探針，將原始信號(hào)探針的強(qiáng)度進(jìn)行歸一化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S7中，設(shè)置所述倍數(shù)變化的閾值^ 2.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述構(gòu)建方法，其特征在于，步驟S8中，所述基因模型中，包括若干超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子，并且，各所述超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子均為外顯子。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述構(gòu)建方法，其特征在于，所述基因模型中，包括表達(dá)上調(diào)的21個(gè)超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子以及表達(dá)下調(diào)的49個(gè)超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子；其中， 表達(dá)上調(diào)的21個(gè)超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子包括uc.1ll+、uc.16-、uc.162+、uc.166-、uc.189+、uc.208-、uc.209-、uc.221-、uc.234+、uc.285+、uc.290-、uc.324-、uc.33+、uc.341+、uc.342+、uc.455-、uc.477+、uc.61_、uc.77_、uc.90+ 以及 uc.95+ ； 表達(dá)下調(diào)的49個(gè)超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄子包括uc.101-、uc.102-、uc.138-、uc.141-、uc.144-、uc.151-、uc.166-、uc.173+、uc.185-、uc.186-、uc.203+、uc.208-、uc.209-、uc.210-、uc.233+、uc.266+、uc.267+、uc.268-、uc.276+、uc.280+、uc.28+、uc.282+、uc.313-、uc.338+、uc.341 +、uc.356+、uc.36+、uc.414-、uc.418-、uc.419-、uc.419+、uc.420_、uc.45_、uc.46_、uc.453_、uc.454_、uc.455_、uc.456+、uc.457_、uc.46_、uc.475+、uc.477+、uc.50-、u c.61+、uc.63-、uc.77-、uc.84-、uc.89+ 以及 uc.97+。
9.采用如權(quán)利要求1至8任一所述構(gòu)建方法所得到的尿毒癥外周血單個(gè)核細(xì)胞超保守區(qū)域轉(zhuǎn)錄表達(dá)基因模型在獲取尿毒癥標(biāo)志物的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要 求9所述應(yīng)用，其特征在于，所述基因模型包括基因RBFOX2。
【文檔編號(hào)】C12N5/0786GK103937879SQ201410093685
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】眭維國, 戴勇, 曹翠輝, 薛雯 申請(qǐng)人:眭維國, 戴勇