一種紅木心材基因組dna的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種紅木心材基因組DNA的提取方法，該提取方法包括以下步驟：將紅木心材在液氮中研磨成粉末；在所得粉末中加入CTAB裂解液進(jìn)行裂解；在所得裂解產(chǎn)物中加入纖維素酶繼續(xù)裂解，將所得裂解物離心取上清，加入苯酚∶氯仿∶異戊醇混合溶液離心取上清；將所得上清轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱離心棄下清，用乙醇洗滌吸附柱，離心棄下清；在DNA吸附柱中加入常規(guī)的用于溶解DNA的試劑靜置，離心即得。所述紅木基因組DNA的提取方法解決了現(xiàn)有的提取基因組DNA的方法從紅木心材中提取的基因組DNA質(zhì)量不高的缺陷，能夠從紅木心材中提取并制備高質(zhì)量的基因組DNA，所得基因組DNA的污染極低，能用于PCR擴(kuò)增鑒定等用途。
【專利說(shuō)明】—種紅木心材基因組DNA的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種紅木心材基因組DNA的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]紅木是一類外表呈紅色的優(yōu)質(zhì)硬木的統(tǒng)稱，歷來(lái)就受到世界各地人民的青睞。近十幾年來(lái)，隨著中國(guó)古典家具和木雕工藝品收藏的升溫，紅木身價(jià)一翻再翻，市場(chǎng)上出現(xiàn)了大量的假冒紅木現(xiàn)象。傳統(tǒng)的紅木鑒定方法主要從紅木的心材顏色、氣味、管孔弦向直徑、氣干密度、射線等指標(biāo)進(jìn)行鑒定，這種方法只能分辨到“類”，而通過(guò)基因識(shí)別技術(shù)則有望實(shí)現(xiàn)對(duì)紅木“種”和產(chǎn)地的高分辨率鑒定。實(shí)現(xiàn)基因識(shí)別技術(shù)的關(guān)鍵前提是如何從紅木樹種的心材部分提取出高質(zhì)量的DNA。
[0003]心材是由樹木的死細(xì)胞組成，由于紅木的心材部分含有大量的色素,傳統(tǒng)的CTAB方法所提取的DNA往往混有大量難以去除的雜蛋白；又由于心材部分的DNA降解嚴(yán)重，僅僅采用試劑盒中的純化柱方法又難以獲得足量的基因組DNA，因此如何從紅木的心材中提取到高質(zhì)量DNA —直是本領(lǐng)域一個(gè)難以克服的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)目前現(xiàn)有的普通DNA提取方法難以從紅木的心材中提取到高質(zhì)量的基因組DNA這一缺陷，提供了一種紅木心材提取基因組DNA的方法。
[0005]為解決上述技 術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案之一為:一種紅木心材基因組DNA的提取方法，其所述提取方法包括以下步驟:
[0006]( I)將紅木心材在液氮中研磨成粉末；
[0007](2)在步驟(1)所得粉末中加入CTAB裂解液，60~70°C裂解3~6小時(shí)；
[0008](3)在步驟(2)所得裂解產(chǎn)物中加入纖維素酶，在48~55°C裂解0.5~2小時(shí)；
[0009](4)將步驟(3)所得裂解混合液9000~IlOOOrpm離心4~7分鐘，取上清，并加入I倍體積~1.5倍體積的苯酚:氯仿:異戊醇的混合溶液，所述混合溶液中苯酚:氯仿:異戊醇的體積比為23: 22: 0.8~25: 24: 1，充分混勻后，9000~15000rpm離心4~7分鐘，取上清；
[0010](5)將步驟(4)所得上清轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱離心棄下清，用體積百分比70~80%的乙醇洗滌吸附柱，離心棄下清；
[0011](6)在步驟(5)所得DNA吸附柱中加入常規(guī)的用于溶解DNA的試劑，靜置，離心即得。
[0012]本發(fā)明所述紅木心材選自本領(lǐng)域常規(guī)的紅木的心材，所述紅木較佳地是紅酸枝木類，所述紅酸枝木類較佳地選自巴里黃檀、賽州黃檀、絨毛黃檀、中美洲黃檀、奧氏黃檀、微凹黃檀或交趾黃檀中的一種或幾種，所述紅木心材最優(yōu)地選自交趾黃檀。
[0013]本發(fā)明所述CTAB裂解液為本領(lǐng)域常規(guī)使用的CTAB裂解液，所述CTAB裂解液配方較佳地為:CTABI ~2%, PVP3 ~5%, NaC18 ~9%, Na2EDTA.2Η200.7 ~0.8%, β -巰基乙醇I~2%，Tris-HCl0.8~lmol/L，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0014]其中所述CTAB裂解液的配方優(yōu)選地為:CTAB2%，PVP5%，NaC18.18%，Na2EDTA.2Η200.74%, β -巰基乙醇 2%, Tris-HCllmol/L,所述 Tris-HCl 的 pH 值較佳地為7.0~8.0，更佳地為8.0，所述百分比為質(zhì)量百分比。
[0015]其中步驟(2)所述CTAB裂解液加入量為:所得CTAB裂解液的紅木心材的濃度較佳地為290mg/ml~570mg/ml,更佳地為360mg/ml~500mg/ml,優(yōu)選地為430mg/ml。加入CTAB裂解液后裂解的溫度較佳地為60~70°C，更佳地為62~68°C，優(yōu)選地為65°C，裂解的時(shí)間較佳地為3~6小時(shí)，更佳地為4~5小時(shí)，優(yōu)選地為5小時(shí)。[0016]其中步驟(3)纖維素酶為本領(lǐng)域常規(guī)的纖維素酶，其制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，市售可得。所述纖維素酶的添加量較佳地為40~60U/g，更佳地為45~55U/g優(yōu)選地為50U/g。
[0017]其中所述纖維素酶的裂解的溫度較佳地為48~55°C，更佳地為50~53°C，優(yōu)選地為50°C，所述纖維素酶的裂解的時(shí)間較佳地為0.5~2小時(shí)，更佳地為I~1.5小時(shí)，優(yōu)選地為I小時(shí)。
[0018]其中步驟(4)所述離心的速度較佳地為9000~llOOOrpm，更佳地為9500~1000Orpm,優(yōu)選地為lOOOOrpm，離心的時(shí)間較佳地為4~7分鐘，更佳地為5~6分鐘，優(yōu)選地為5分鐘。
[0019]其中步驟(4)所述苯酚:氯仿:異戊醇的混合溶液中苯酚:氯仿:異戊醇的體積比較佳地為23: 22: 0.8~25: 24:1，優(yōu)選地為25: 24: I，該苯酚:氯仿:異戊醇混合溶液的添加量較佳地為I倍體積~1.5倍體積，更佳地為I倍體積,加入所述苯酹:氯仿:異戍醇混合溶液后，離心的速度較佳地為9000~15000rpm,更佳地為10000~13000rpm,優(yōu)選地為12000rpm，所述離心的時(shí)間較佳地為4~7分鐘，更佳地為5~6分鐘，優(yōu)選地為5分鐘。
[0020]其中步驟(5)所述DNA吸附柱為本領(lǐng)域常規(guī)的DNA吸附柱，其制備方法也是本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，所述DNA吸附柱市售可得。所述離心的速度較佳地為9000~15000rpm，更佳地為10000~13000rpm，優(yōu)選地為12000rpm，離心的時(shí)間較佳地為I~5分鐘，更佳地為2~3分鐘，優(yōu)選地為2分鐘。其中所述乙醇的體積百分比濃度范圍較佳地為70~80%，優(yōu)選地為75%。
[0021]其中步驟(6)所述常規(guī)的用于溶解DNA的試劑較佳地為ddH20或TE。所述ddH20的加入量較佳地為40~60 μ 1，優(yōu)選地為50 μ 1，所述靜置的時(shí)間較佳地為3~10分鐘，優(yōu)選地為5分鐘。
[0022]在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0023]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0024]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:本發(fā)明所述紅木心材基因組DNA的提取方法可以從多種紅木心材中抽提基因組DNA，利用本發(fā)明所述提取方法制備所得基因組DNA具有污染少，質(zhì)量高的優(yōu)點(diǎn)。該提取方法制備所得基因組DNA可以用于各種DNA檢測(cè)方法，可以作為PCR擴(kuò)增檢測(cè)的底物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為以實(shí)施例1制備的基因組DNA為模板所得PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖。其中泳道I和泳道2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，M為Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。實(shí)施例中所述的“室溫”是指進(jìn)行試驗(yàn)的操作間的溫度，一般為25°C。
[0027]CTAB (hexadecyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨)購(gòu)買自北京索萊寶科技有限公司，PVP (聚乙烯吡咯烷酮)購(gòu)買自北京索萊寶科技有限公司，β-巰基乙醇購(gòu)買自北京索萊寶科技有限公司。
[0028]纖維素酶購(gòu)買自蘇柯漢生物技術(shù)有限公司，DNA吸附柱購(gòu)買自Promega公司。苯酚、氯仿、異戊醇、Na2EDTA.2Η20以及其他化學(xué)制劑均購(gòu)買自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司，所用化學(xué)試劑均為分析純。
[0029]實(shí)施例1提取紅木交趾黃檀心材基因組DNA
[0030]提取過(guò)程的試劑配制及使用要求如下:
[0031]CTAB裂解液配方為:2g CTAB，5g PVP,8.18g NaCl，0.74g Na2EDTA.2H20，2mL3 -巰基乙醇，lOmLlmol/L 的 Tris-HCl (pH8.0)，加水定容到 100mL。 [0032]研磨缽:洗凈后高溫滅菌。
[0033]將苯酚:氯仿:異戊醇按照體積比為25: 24:1的體積比例混合配制IOml溶液。
[0034]紅木交趾黃檀基因組DNA的提取方法包括以下步驟:
[0035](I)稱取300mg的紅木交趾黃檀心材木片，待研磨冷卻后放入稱量好的木片，在液氮中研磨成粉末。
[0036](2)在粉末中加入700 μ I的65°C預(yù)熱CTAB裂解液，至于65°C放置5小時(shí)，期間每隔30min顛倒一次EP管。
[0037](3)加入終濃度為50U/g的纖維素酶，50°C水浴I小時(shí)，期間不斷地顛倒EP管。
[0038](4)室溫冷卻后1000Orpm離心5min，小心吸取上清并量取上清體積,加入相同體積的苯酹:氯仿:異戍醇混合溶液=25: 24:1,充分混勻后12000rpm離心7min。
[0039](5)將上清分批次全部轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱，12000rpm離心Imin棄下清。
[0040](6)用體積百分比濃度為75%的乙醇洗除吸附柱上的蛋白質(zhì)，重復(fù)二次后棄下清，自然晾干。
[0041](7)加入50μ I的ddH20，靜置5min后，12000rpm離心2min即得紅木交趾黃檀的
基因組DNA溶液。
[0042]實(shí)施例2紅木交趾黃檀基因組DNA的質(zhì)量驗(yàn)證
[0043]1、驗(yàn)證過(guò)程的試劑配制及其和過(guò)程如下所述:
[0044]1%的瓊脂糖:稱取0.1g的瓊脂糖溶解于IOml的I X TAE中。
[0045]50 X TAE 緩沖液配方為:Tris242g，Na2EDTA.2H2037.2g，加入 800ml 的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠹尤?7.1ml的醋酸。[0046]根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的紅木交趾黃檀ITS2序列，設(shè)計(jì)PCR鑒定上游擴(kuò)增引物和下游擴(kuò)增引物，擴(kuò)增引物的序列分別如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為364bp。
[0047]合成PCR鑒定引物:PCR鑒定上游擴(kuò)增引物序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)為:5， -CTTGCATCGATGAAGAACGTAG-3，；
[0048]PCR鑒定下游擴(kuò)增引物序列(如序列表中SEQ ID NO: 2所示)為:5， -GCCTGACCTGAGGTCGCGTCAAG-3，。
[0049]上述兩種PCR鑒定引物均由上海生工生物科技有限公司合成，將引物配制成IOpM濃度的溶液備用。
[0050]10 X PCR緩沖液、DNA聚合酶，dNTP以及ddH20取自PCR擴(kuò)增試劑盒，該P(yáng)CR擴(kuò)增試劑盒為采購(gòu)于天根生物科技有限公司的Golden Fast PCR KU。
[0051]所得PCR反應(yīng)體系及其組分如表1所示:
[0052]表1PCR鑒定體系
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種紅木心材基因組DNA的提取方法，其特征在于，所述提取方法包括以下步驟: (1)將紅木心材在液氮中研磨成粉末； (2)在步驟(1)所得粉末中加入CTAB裂解液，60~70°C裂解3~6小時(shí)； (3)在步驟(2)所得裂解產(chǎn)物中加入纖維素酶，在48~55°C裂解0.5~2小時(shí)； (4)將步驟(3)所得裂解混合液9000~11000rpm離心4~7分鐘，取上清，并加入I倍體積~1.5倍體積的苯酹:氯仿:異戍醇的混合溶液,所述混合溶液中苯酹:氯仿:異戊醇的體積比為23: 22: 0.8~25: 24: 1，充分混勻后，9000~15000rpm離心4~7分鐘，取上清； (5)將步驟(4)所得上清轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱離心棄下清，用體積百分比70~80%的乙醇洗滌吸附柱，離心棄下清； (6)在步驟(5)所得DNA吸附柱中加入常規(guī)的用于溶解DNA的試劑，靜置，離心即得。
2.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步驟(1)所述CTAB裂解液的配方為:CTAB1 ~2%，PVP3 ~5%，NaC18 ~9%，Na2EDTA.2H200.5 ~0.8%, β -巰基乙醇 I ~2%，Tris-HCl0.8~lmol/L，所述百分比為質(zhì)量百分比。
3.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步驟(2)所述的CTAB裂解液加入量為所得CTAB裂解液中紅木心材的濃度為290mg/ml~570mg/ml，所述CTAB裂解液的裂解的溫度為62~68°C，所述裂解的時(shí)間為4~5小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步驟(2)所述的CTAB裂解液加入量為所得CTAB裂解液的紅木心材濃度為430mg/ml。
5.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步驟(3)所述纖維素酶的添加量為40 ~60U/g。
6.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步驟(3)所述纖維素酶的裂解溫度為50~53°C，所述纖維素酶的裂解的時(shí)間為I~1.5小時(shí)。
7.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步驟(4)所述離心的速度為10000~13000rpm,離心的時(shí)間為5~6分鐘,其中所述苯酹:氯仿:異戍醇的混合溶液的加入量為與所得上清液的體積比為1: 1，該混合溶液中苯酚:氯仿:異戊醇的體積比為25: 24:10
8.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步驟(5)所述離心的速度為9000~15000rpm,離心的時(shí)間為I~5分鐘。
9.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步驟(5)所述乙醇的體積百分比濃度為75%。
10.如權(quán)利要求1所述的提取方法，其特征在于，其中步驟(6)所述常規(guī)的用于溶解DNA的試劑為ddH20或TE，所述ddH20或TE的加入量為40~60 μ 1，所述靜置的時(shí)間為3~10分鐘。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK103898094SQ201410095694
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】李瑤, 周佳海, 張穎, 壽勇明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所, 上?；瘜W(xué)工業(yè)區(qū)醫(yī)療中心