一種檢測11種常見感染性腹瀉病原體的基因芯片及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基因芯片及其應(yīng)用，屬于生物檢測領(lǐng)域。本發(fā)明針對11種臨床常見感染性腹瀉病原微生物設(shè)計(jì)了一組檢測探針，以及含有該組探針的基因芯片。本發(fā)明的檢測探針包括副溶血弧菌探針、創(chuàng)傷弧菌探針、霍亂弧菌探針、溶藻弧菌探針、弗尼斯弧菌探針、志賀氏菌探針、大腸桿菌探針、氣單胞菌探針、沙門氏菌探針、彎曲菌探針，以及變形桿菌探針；前述探針序列如SEQ?ID?NO：1-117所示。本發(fā)明的基因芯片及探針能夠檢測11種臨床常見致腹瀉病原菌，檢測通量高，特異性強(qiáng)，靈敏度高，檢測快速有效。
【專利說明】一種檢測11種常見感染性腹瀉病原體的基因芯片及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基因芯片，尤其涉及一種用于區(qū)分和檢測11種臨床常見感染性腹瀉致病菌的基因芯片，屬于生物檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]腹瀉是一種發(fā)病率高并流行于世界各地的胃腸道傳染病，其發(fā)病率僅次于上呼吸道感染，在我國感染性腹瀉發(fā)病率居所有傳染病首位。感染性腹瀉是我國的常見病和多發(fā)病，病因比較復(fù)雜，可由病毒、細(xì)菌和原蟲引起，近年來時(shí)有暴發(fā)流行，已經(jīng)成為當(dāng)前世界上不斷增多的公共衛(wèi)生問題之一，因此亟需建立多種常見腹瀉致病菌快速高效的診斷方法。
[0003]目前，腹瀉致病菌的傳統(tǒng)檢測方法主要包括以下幾種:(1)糞便常規(guī)檢查；(2)病原學(xué)檢查；(3)血清學(xué)檢查；(4)分子生物學(xué)——PCR檢測方法；(5)分子生物學(xué)——基因芯片法。其中，基因芯片是通過微加工技術(shù)，將數(shù)以萬計(jì)、乃至百萬計(jì)的特定序列的DNA片段(基因探針)，有規(guī)律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構(gòu)成的一個(gè)二維DNA探針陣列，利用這類芯片與標(biāo)記的生物樣品進(jìn)行雜交，可對樣品的基因表達(dá)譜生物信息進(jìn)行快速定性和定量分析?；蛐酒夹g(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于:1)高通量并行檢測:當(dāng)一個(gè)樣品同時(shí)需要檢測多種病原菌時(shí)，一次實(shí)驗(yàn)即可得出全部結(jié)果；2)操作簡便快速:整個(gè)檢測只需4-8小時(shí)基本可以出結(jié)果；但同時(shí)基因芯片技術(shù)也存在重復(fù)性差，靈敏度較低等問題。
[0004]16s rRNA在細(xì)菌及其他微生物(真菌中為18s rRNA)的進(jìn)化過程中高度保守，被稱之為細(xì)菌的“分子化石”，同時(shí)其序列保守性又是相對的，在保守區(qū)之間又存在著9個(gè)高變區(qū)，不同細(xì)菌的科、屬、種之間存在著不同程度的差異，故16s rRNA可以作為細(xì)菌分類的標(biāo)志，又可以作為細(xì)菌檢測和鑒定的靶分子。而且，隨著微生物研究的不斷發(fā)展，16s rRNA的數(shù)量也在不斷的增加，更加完整，采用16s rRNA分類鑒定微生物也更加可靠。
[0005]16s rRNA序列對微生物進(jìn)行分類鑒定存在一定的局限性，16s rRNA對于親緣關(guān)系較近的細(xì)菌可能分辨率不夠，常不能反映關(guān)系較近的種間關(guān)系。因此，需要采用其他基因進(jìn)行微生物分類鑒定分析，與16s rRNA起到相互補(bǔ)充的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，蛋白編碼基因gyrB是用于細(xì)菌鑒定和分類的又一理想的靶基因。gyrB基因是編碼DNA解旋酶B亞基的基因，該基因進(jìn)化速率較快，堿基替換頻率較高，能比16s rRNA基因更好地區(qū)分相似種。
[0006]由于出血性大腸桿菌0157:H7和志賀氏菌兩種微生物的16s rRNA與gyrB基因與普通大腸桿菌的基因序列相似度極高，無法根據(jù)這兩種基因序列設(shè)計(jì)探針。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研得知，出血性大腸埃希氏菌0157:H7的wzy基因與志賀氏菌的ipaH基因?yàn)閮煞N微生物所特有的功能基因，可以用來特異性檢測兩種微生物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種復(fù)合基因芯片，用于同時(shí)檢測11種臨床上常見的感染性腹瀉病原體。[0008] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:一組針對十一種感染性腹瀉病原體的基因芯片檢測探針，包括副溶血弧菌探針、創(chuàng)傷弧菌探針、霍亂弧菌探針、溶藻弧菌探針、弗尼斯弧菌探針、志賀氏菌屬探針、大腸桿菌探針、氣單胞菌探針、沙門氏菌探針、彎曲菌探針，以及變形桿菌探針；其中，所述副溶血弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:1-10中的任意一種或多種，所述創(chuàng)傷弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:11-18中的任意一種或多種，所述霍亂弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:19-30中的任意一種或多種，所述溶藻弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:31-40中的任意一種或多種，所述弗尼斯弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:41-51中的任意一種或多種，所述志賀氏菌探針的序列選自SEQ ID NO:52-64中的任意一種或多種，所述大腸桿菌探針的序列選自SEQ ID NO:65-76中的任意一種或多種，所述氣單胞菌探針的序列選自SEQ ID NO:77-86中的任意一種或多種，所述沙門氏菌探針的序列選自SEQ ID NO:87-96中的任意一種或多種，所述彎曲菌探針的序列選自SEQ ID NO =97-107中的任意一種或多種，所述變形桿菌探針的序列選自SEQ ID NO:108-117中的任意一種或多種。
[0009]本發(fā)明第二方面公開了一種檢測十一種感染性腹瀉病原體的基因芯片，所述基因芯片上整合了前述基因芯片檢測探針。
[0010]進(jìn)一步，所述基因芯片還包括芯片基片。
[0011]所述芯片基片可選自氣基基片(玻片表面為氣基基團(tuán)修飾)、醒基基片(玻片表面為醒基基團(tuán)修飾)、疏基基片(玻片表面為疏基基團(tuán)修飾)、瓊脂糖基片(玻片表面以瓊脂糖覆蓋)、葡聚糖基片(玻片表面以葡聚糖覆蓋)等。
[0012]更進(jìn)一步，所述基因芯片為氨基基片。
[0013]本發(fā)明第三方面公開了一種檢測十一種感染性腹瀉病原體的方法，包括以下步驟:
[0014]1)提取待測樣本的模板DNA ；
[0015]2 )模板DNA的擴(kuò)增與標(biāo)記；
[0016]3)擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物與前述基因芯片雜交；
[0017]4)雜交后的芯片掃描和結(jié)果判讀。
[0018]進(jìn)一步，步驟2)所述模板DNA的擴(kuò)增采用通用PCR引物，所述通用PCR引物的序列如 SEQ ID NO:118-119 所示。
[0019]進(jìn)一步，步驟2)所述模板DNA的擴(kuò)增，其擴(kuò)增的聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)體系如下:
[0020]
【權(quán)利要求】
1.一組針對十一種感染性腹瀉病原體的基因芯片檢測探針，包括副溶血弧菌探針、創(chuàng)傷弧菌探針、霍亂弧菌探針、溶藻弧菌探針、弗尼斯弧菌探針、志賀氏菌屬探針、大腸桿菌探針、氣單胞菌探針、沙門氏菌探針、彎曲菌探針，以及變形桿菌探針；其中，所述副溶血弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:1-10中的任意一種或多種，所述創(chuàng)傷弧菌探針的序列選自SEQID NO:11-18中的任意一種或多種，所述霍亂弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:19-30中的任意一種或多種，所述溶藻弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:31-40中的任意一種或多種，所述弗尼斯弧菌探針的序列選自SEQ ID NO:41-51中的任意一種或多種，所述志賀氏菌探針的序列選自SEQ ID NO:52-64中的任意一種或多種，所述大腸桿菌探針的序列選自SEQ IDNO:65-76中的任意一種或多種，所述氣單胞菌探針的序列選自SEQ ID NO:77-86中的任意一種或多種，所述沙門氏菌探針的序列選自SEQ ID NO:87-96中的任意一種或多種，所述彎曲菌探針的序列選自SEQ ID NO:97-107中的任意一種或多種，所述變形桿菌探針的序列選自SEQ ID NO =108-117中的任意一種或多種。
2.一種檢測十一種感染性腹瀉病原體的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片上整合了權(quán)利要求1所述的基因芯片檢測探針。
3.如權(quán)利要求2所述的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片還包括芯片基片。
4.如權(quán)利要求3所述的基因芯片，其特征在于，所述芯片基片為氨基基片。
5.一種檢測十一種感染性腹瀉病原體的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)提取待測樣本的模板DNA； 2)模板DNA的擴(kuò)增與標(biāo)記； 3)擴(kuò)增標(biāo)記產(chǎn)物與權(quán)利要求2-4任一權(quán)利要求所述基因芯片雜交； 4)雜交后的芯片掃描和結(jié)果判讀。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)所述模板DNA的擴(kuò)增采用通用PCR引物，所述通用PCR引物的序列如SEQ ID NO:118-119所示。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)所述模板DNA的擴(kuò)增，其擴(kuò)增的聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)體系如下:組分體積模板 DΝΑI μ L
10χPCR buffer2 μ L上游引物(IOmM)0.5 μL下游引物(10 11Μ)0.SpLDNTP ( 10 DiM)0.4 ML
rtaq ( 511/ul )0.2 μ L
加水至總體積20 μ L,
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)所述模板DNA的擴(kuò)增，其擴(kuò)增的聚合酶鏈反應(yīng)程序?yàn)?94°C 5min;然后按94°C 30s, 55 °C 30s, 72 °C 90s做35個(gè)循環(huán)；最后72°C 1Omin。
9.權(quán)利要求1所述針對十一種感染性腹瀉病原體的基因芯片檢測探針，以及權(quán)利要求2-4任一權(quán)利要求所述檢測十一種感染性腹瀉病原體的基因芯片在制備腹瀉病原體檢測制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103911443SQ201410101768
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】孫成銘, 欒材富, 劉杰, 伊茂禮, 李少君, 吳金英, 張守信, 段麗君, 孫雋, 龔磊, 張成林 申請人:煙臺(tái)毓璜頂醫(yī)院