重組人dkk1多表位核酸疫苗、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種新型的重組人DKK1多表位核酸疫苗，其核酸序列為編碼人DKK1的4段（110-144aa、153-181aa、182-216aa、228-253aa）免疫原性較高的片段與T細(xì)胞表位片段的融合序列。實驗表明，重組人DKK1多表位核酸疫苗免疫小鼠產(chǎn)生的抗體能夠拮抗DKK1的生物學(xué)活性，發(fā)揮拮抗骨破壞的作用，有可能經(jīng)開發(fā)用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病。本發(fā)明提供的核酸疫苗屬于治療性疫苗，可為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病提供一種新的治療途徑和思路。該疫苗制備簡單、成本低廉、穩(wěn)定性好、貯存方便，且具有良好的免疫原性，適于規(guī)?；a(chǎn)。
【專利說明】重組人DKK1多表位核酸疫苗、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說，涉及重組人DKKl多表位核酸疫苗、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以侵蝕性滑膜炎及對稱性、破壞性關(guān)節(jié)病變?yōu)橹饕±韺W(xué)特征。最終可導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，是造成人群勞動力喪失與致殘的主要病因之一，給個人和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。
[0003]由RA慢性、持續(xù)性炎癥最終導(dǎo)致骨侵蝕的機制尚不清楚。因此，研究RA發(fā)病及骨損害的分子機制至關(guān)重要。近年來，越來越多的研究表明，fct信號通路在RA發(fā)病過程中起重要作用。fct信號可直接影響多潛能的前體細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞(Osteoblast, 0B)分化的過程，并且通過上調(diào)0PG/RANKL/RANK系統(tǒng)中0PG/RANKL的比率影響破骨細(xì)胞(Osteoclast, 0C)的發(fā)育成熟。目前，Wnt信號通路主要由兩條途徑調(diào)節(jié)骨代謝:(O經(jīng)典途徑:Wnt/ β -catenin信號通路，主要通過富集細(xì)胞內(nèi)的β -catenin,進而促進β-catenin進入細(xì)胞核，調(diào)控下游成骨細(xì)胞靶基因的表達，促進成骨細(xì)胞分泌I型膠原而加速骨組織礦化，促進間充質(zhì)前體和骨-軟骨細(xì)胞前體增殖分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，延長成骨細(xì)胞的存活時間；并且抑制成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的偶聯(lián)，調(diào)節(jié)骨保護素(osteoprtegerin, 0PG)和核因子-κ B 受體活化因子配體(Receptor activator ofnuclear factor- κ B ligand, RANKL)的表達,影響骨吸收；使包埋在骨基質(zhì)中的骨細(xì)胞最終分化為成骨細(xì)胞，并改變0B/0C的胞外基質(zhì)以及在骨表面的定位，刺激骨折修復(fù)和影響骨重塑。(2)旁路途經(jīng):Wnt/Ca2+信號通路，主要通過調(diào)節(jié)G蛋白激活胞質(zhì)中多種對Ca2+敏感的酶，包括磷脂酶 C (phospholipase C, PLC),蛋白激酶 C (protein kinase C, PKC)和鈣離子-1丐調(diào)素依賴性蛋白激酶II (calcium-calmodulin dependent kinase II, CamKII)等，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放；Wnt/PCP(Planar Cell Polarity)信號通路,主要通過小G蛋白RhoA和Cdc42等激活JNK (Jun N-terminal kinase),促進軟骨細(xì)胞的去分化。目前為止，這些途徑在骨和骨細(xì)胞的作用尚不很清楚。
[0004]DKKl是Wnt信號通路的抑制因子，屬于DKK家族中的一員。DKK家族是在進化過程中很保守的一個基因家族，在脊椎動物中包括DKK1、2、3、4四個成員，都是分泌型糖蛋白，其中DKK1、2、4可以參與調(diào)控Wnt信號通路，尤其以DKKl抑制Wnt通路而介導(dǎo)骨破壞的途徑及其拮抗劑的研究最為重視。人類DKKl基因位于10號染色體IOqll.2，其編碼的分泌性糖蛋白由266個氨基酸組成，結(jié)構(gòu)上包括三個部分:(I)一個N端的信號序列，介導(dǎo)DKKl肽鏈穿越粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并分泌至細(xì)胞外。(2)兩個保守的半胱氨酸富集區(qū)域。(3)靠近蛋白質(zhì)C端的N-糖基化位點。DKKl是成骨細(xì)胞生長和分化的重要調(diào)節(jié)因子，DKKl與Wnt蛋白競爭性結(jié)合膜受體LRP5/6,并與膜受體Kremen結(jié)合,形成DKKl-LRP-Kremen復(fù)合體,經(jīng)由吞飲作用進入胞衆(zhòng)并被溶酶體分解，從而減少了 Wnt膜表面受體的數(shù)量,抑制Wnt/ β -catenin信號通路活性，下調(diào)胞漿β -catenin水平，抑制成骨細(xì)胞生長和分化的轉(zhuǎn)錄因子，使成骨細(xì)胞數(shù)量減少、活性降低、壽命縮短。同時，成骨細(xì)胞fct/ β -catenin通路被阻斷后，下調(diào)骨保護素的表達水平，從而促進破骨細(xì)胞的分化?？梢?，過表達的DKKl可抑制骨的形成并促進骨的吸收。研究表明，RA患者的血清和滑液中DKKl水平升高，并與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，是介導(dǎo)RA骨損傷的重要致病因子。應(yīng)用抗DKKl抗體治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，可增加成骨細(xì)胞數(shù)量、提高血清骨鈣素水平，增加小梁骨體積，促進膜內(nèi)成骨，減少骨吸收。
[0005]目前臨床上治療RA的藥物主要包括非甾體抗炎藥(non-steroidalant1-1nflammatory drugs, NSAIDs)、改善病情抗風(fēng)濕藥(disease modifyingantirheumatic drug, DMARDs)及生物制劑等。這些藥物在一定程度上緩解了 RA病情,但并不能完全抑制骨結(jié)構(gòu)破壞的放射學(xué)進展，因此開發(fā)抑制RA骨破壞的藥物顯得尤為重要。而DKKl作為Wnt信號通路的抑制因子在RA發(fā)病機制及骨侵蝕中起關(guān)鍵作用，可能成為RA治療新的分子靶點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種新型的重組人DKKl多表位核酸疫苗。其及應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的另一目的是提供所述核酸疫苗的制備方法。
[0008]本發(fā)明的再一目的是提供所述核酸疫苗在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
[0009]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0010]本發(fā)明還提供編碼上述融合蛋白的基因。
[0011]本發(fā)明還提供一種重組人DKKl多表位核酸疫苗，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所
/Jn ο
[0012]本發(fā)明還提供含有上述基因或所述核酸疫苗的載體。
[0013]本發(fā)明還提供含有上述基因或所述核酸疫苗的宿主細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明還提供含有上述基因或所述核酸疫苗的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0015]本發(fā)明還提供含有上述基因或所述核酸疫苗的工程菌。
[0016]本發(fā)明還提供制備所述核酸疫苗的方法，包括如下步驟^fSEQ ID N0.2所示的基因序列克隆到真核表達載體，將獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，經(jīng)菌體擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，即得重組人DKKl多表位核酸疫苗。
[0017]優(yōu)選使用的真核表達載體為PCMV6-XL5。
[0018]本發(fā)明還提供所述核酸疫苗在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明進一步提供一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物，其有效成分包括所述核酸疫苗。
[0020]本發(fā)明提供的重組人DKKl多表位核酸疫苗，其核酸序列為編碼人DKKl的4段(110-144aa、153-181aa、182-216aa、228-253aa)免疫原性較高的片段與T細(xì)胞表位片段的融合序列。DKKl是介導(dǎo)RA骨損傷的重要致病因子，由于DKKl為自體成分，自然狀態(tài)下很難產(chǎn)生抗體。為了增強其免疫原性并降低其生物學(xué)活性，本發(fā)明在疫苗中引入編碼泛DR輔助T細(xì)胞表位(PADRE)的序列來增強其免疫原性；同時，本發(fā)明還突變了候選表位(110-144aa、153-181aa、182-216aa、228-253aa)中 4 個氨基酸位點(R203E、H204E、K211E、R236E)來降低其生物學(xué)活性。為保證蛋白酶能在各個表位之間進行適當(dāng)?shù)那懈?，在串?lián)的表位之間加入間隔肽一ΑΑΥ,ΑΑΥ是一種廣泛的蛋白酶作用位點。并在疫苗的N端加入天然人DKKl的信號肽(SPl-31aa)，使其在真核細(xì)胞中以分泌型表達。
[0021]真核表達載體是制備核酸疫苗的主體，其表達抗原蛋白能力的強弱，主要取決于其啟動子的強弱。一般認(rèn)為含有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子的載體表達水平高，因此應(yīng)用的最為廣泛。本發(fā)明選用的真核表達載體PCMV6-XL5，含有CMV啟動子，保證了目的基因在肌肉細(xì)胞中的高效表達。
[0022]實驗表明，本發(fā)明的重組人DKKl多表位核酸疫苗能夠有效刺激小鼠產(chǎn)生特異性的抗體，該抗體可以中和DKKl的生物學(xué)活性，減輕膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(Collagen-1nducedarthritis, CIA)小鼠骨破壞的程度，可用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等骨破壞性疾病。
[0023]本發(fā)明的重組人DKKl多表位核酸疫苗為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病提供了一種新的治療途徑和思路。該核酸疫苗制備簡單、成本低廉、穩(wěn)定性好、貯存方便，且具有良好的免疫原性，適于規(guī)?；a(chǎn)
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1 (a)為本發(fā)明實施例1中B細(xì)胞表位預(yù)測軟件分析人DKKl全長氨基酸序列的免疫原性，其中，下劃線所示的部位為本發(fā)明所選取的4段免疫原性較高的片段；圖1(b)為重組人DKKl多表位核酸疫苗的全基因序列以及載體示意圖，其中，串聯(lián)的表位之間用連接子AAY連接，兩端各引入一段編碼泛DR輔助T細(xì)胞表位(PADRE)的序列，在疫苗的N端加入天然人DKKl 信號肽。
[0025]圖2 Ca)為本發(fā)明實施例1中重組質(zhì)粒pCMV_DP PCR以及雙酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，其中，泳道1:分子量Marker ;泳道2:重組質(zhì)粒pCMV_DP ;泳道3:重組質(zhì)粒pCMV-DP雙酶切鑒定(EcoR1、Xbal I);泳道4:重組質(zhì)粒pCMV-DP PCR鑒定;圖2 (b)為重組質(zhì)粒pCMV-DP測序鑒定圖譜。
[0026]圖3為本發(fā)明實施例3中Western Blot分析重組質(zhì)粒pCMV_DP體外表達情況，其中，泳道1:未轉(zhuǎn)染pCMV-DP的C0S7細(xì)胞；泳道2:轉(zhuǎn)染pCMV-DP的C0S7細(xì)胞。
[0027]圖4為本發(fā)明實施例3中免疫組化檢測重組質(zhì)粒pCMV-DP體內(nèi)表達情況(100倍顯微鏡下)。
[0028]圖5為本發(fā)明實施例4中重組人DKKl多表位核酸疫苗刺激機體產(chǎn)生的抗體的滴度以及持續(xù)時間(均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差)。
[0029]圖6為本發(fā)明實施例5中重組人DKKl多表位核酸疫苗刺激機體產(chǎn)生抗體對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠保護作用的評估；其中，圖6 (a)是陽性對照組小鼠和疫苗組小鼠Micro-CT的骨侵蝕程度變化；圖6 (b)是陽性對照組小鼠和疫苗組小鼠總的骨密度的統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果；圖6 (c)是陽性對照組小鼠和疫苗組小鼠甲苯胺蘭染色軟骨的侵蝕程度變化(50倍顯微鏡下)。
【具體實施方式】[0030] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0031]實施例1重組人DKKl多表位核酸疫苗真核表達載體的構(gòu)建
[0032]應(yīng)用B細(xì)胞表位預(yù)測軟件分析人DKKl全長氨基酸序列，從中選擇4段(110-144aa、153-181aa、182-216aa、228_253aa)免疫原性較高的片段，見圖1 (a)。將其中發(fā)揮DKKl生物學(xué)活性的氨基酸(R203、H204、K211、R236)突變?yōu)楦着cMHC II類分子結(jié)合的谷氨酸。將篩選到的表位之間用連接子AAY連接，兩端引入T細(xì)胞表位的氨基酸序列。人工合成多表位核酸疫苗的全基因序列，命名為DP。相應(yīng)的重組基因序列如SEQ ID N0.2所示。PCR擴增目的片段DP，擴增所用的引物序列如下:
[0033]上游引物:5’ -CGGAATTCATGATGGCTCTGGGCGCAGCGG-3 ’
[0034]下游引物:5，-TGCTCTAGATTAAGCGGCTGCTTTCAG-3’
[0035]PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收。分別用EcoRI和XbalI雙酶切經(jīng)凝膠純化的目的基因產(chǎn)物及PCMV6-XL5載體DNA。用T4連接酶處理，室溫2h，見圖1 (b)。取5 μ I連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α菌株。挑取單菌落抽提質(zhì)粒，通過對重組質(zhì)粒的PCR鑒定和雙酶切鑒定，見圖2 (a)，PCR擴增出現(xiàn)預(yù)期大小的目的條帶，且雙酶切鑒定重組質(zhì)粒含有目的基因片段為預(yù)期大小，測序結(jié)果見圖2(b)，表明成功構(gòu)建了含有重組人DKKl多表位核酸疫苗的真核表達載體，將其命名為pCMV-DP。
[0036]實施例2重組人DKKl多表位核酸疫苗在大腸桿菌中的擴增與提取
[0037]將轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的大腸桿菌接種于IOmL LB培養(yǎng)基(含100mg/L氨芐青霉素)，37°C、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。次日將IOmL過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于ImL LB培養(yǎng)基(含100mg/L的氨芐青霉素)，371:，250印111培養(yǎng)至00600值2.0左右。離心收集菌體。依次加入懸浮液、裂解液和中和液，加入裂解液后輕輕翻轉(zhuǎn)混勻6-8次，室溫放置2-3min (不要超過5min)。離心后，將上清過柱子，Washing Buffer洗柱子兩遍,然后用預(yù)熱(50°C )的洗脫液將重組質(zhì)粒洗下來。異丙醇沉淀后，70%乙醇洗一遍，最后加入適量無菌生理鹽水溶解沉淀。
[0038]紫外分光光度計測定DNA的濃度以及純度，確保提取的質(zhì)粒A260/A280比值在
1.8-2.0 之間。
[0039]實施例3重組人DKKl多表位核酸疫苗體內(nèi)、外表達情況的鑒定
[0040]重組質(zhì)粒pCMV-DP瞬時轉(zhuǎn)染非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞C0S7，DMEM培養(yǎng)基(10%FBS，100U/ml青霉素，100 μ g/ml鏈霉素)，37°C、5%C02孵箱孵育。待轉(zhuǎn)染后72h，收集細(xì)胞，用濃度12%SDS-PAGE膠電泳分離；半干法轉(zhuǎn)入硝酸纖維素(NC)膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，TBST洗三次；山羊抗人DKKl抗體1:1000稀釋，4°C過夜孵育，TBST洗三次；HRP標(biāo)記的驢抗山羊抗體1:10000稀釋，室溫孵育lh，TBST洗三次；化學(xué)發(fā)光底物覆蓋膜顯色lmin，暗室內(nèi)曝光，顯影、定影。Western Blot分析表明真核細(xì)胞C0S7能表達目的蛋白(圖3)。
[0041 ] 將重組質(zhì)粒pCMV-DP肌肉注射BALB/c小鼠，7d后，取注射部位肌肉組織進行免疫組化染色。冰凍切片8-1(^111，丙酮固定51^11，PBS洗滌3次；滅活內(nèi)源性酶及封閉內(nèi)源性生物素后，將山羊抗人DKKl抗體稀釋為5 μ g/mL，4°C，過夜孵育，用PBS洗3次；加入I滴生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育lh，PBS洗3次；加入I滴HSS-HRP，室溫孵育30min，PBS洗3次；DAB顯色20min，復(fù)染細(xì)胞核；脫水、透明、封片后，置于顯微鏡下觀察。注射了 pCMV-DP的肌肉組織內(nèi)可以見到目的蛋白的表達(圖4 )。
[0042]實施例4動物免疫實驗
[0043]重組質(zhì)粒pCMV-DP免疫6_8w雌性BALB/c小鼠(SPF級)，按體重將小鼠分為生理鹽水組和pCMV-DP組，于0、2、4周，肌肉注射小鼠，100 μ g/只，共免疫3次。從初次免疫開始，每隔兩周眼眶采血，收集血清后用間接ELISA法檢測小鼠體內(nèi)的抗人DKKl抗體的滴度以及持續(xù)時間。用rhDKKl (200ng/mL)包被ELISA板，4°C過夜，并用1%BSA37°C封閉lh，PBST洗4次；待檢血清1:200稀釋，4°C過夜孵育，PBST洗4次；HRP標(biāo)記的抗體1:10000稀釋，37°C孵育Ih ;加入底物，37°C孵育20min后，加入終止液，測450nm處吸光度。血清抗體滴度測定結(jié)果顯示，PCMV-DP組抗體產(chǎn)生水平明顯高于生理鹽水組(圖5)。
[0044]實施例5疫苗對膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎小鼠保護作用的實驗
[0045]用重組人DKKl多表位核酸疫苗免疫5w雄性DBA/1小鼠(SPF級)，方法及免疫流程參照實施例4。末次免疫后lw，各組小鼠距尾根部1.5cm處皮內(nèi)免疫等量的牛II型膠原與完全弗氏佐劑的乳化物(100 μ I/只)，3w后用等量的牛II型膠原與不完全弗氏佐劑的乳化物(100 μ I/只)，以同樣的方法加強免疫。末次免疫后20d斷頸處死小鼠，MiciO-CT斷層掃描，評估各組小鼠的骨侵蝕程度。結(jié)果顯示，與陽性對照組(空質(zhì)粒組)相比，pCMV-DP組小鼠的骨結(jié)構(gòu)相對完整，骨破壞程度明顯減輕，見圖6 (a)。
[0046]對兩組小鼠總的骨密度進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示，pCMV-DP組小鼠總的骨密度要高于陽性對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P < 0.05)，見圖6 (b)。
[0047]選取小鼠后肢足爪，固定、脫鈣后包埋于石蠟中切片，進行甲苯胺蘭染色:將組織切片浸入1%甲苯胺蘭染色液中染色40s，ddH20漂洗Imin ;脫水、透明、封片后鏡下觀察。陽性對照組小鼠關(guān)節(jié)面不完整，關(guān)節(jié)腔狹窄，大部分關(guān)節(jié)軟骨被侵蝕；pCMV-DP組小鼠關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)相對完好，關(guān)節(jié)面光滑，關(guān)節(jié)軟骨相對完整，厚度接近正常水平，見圖6 (C)。
[0048]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
[0049]參考文獻
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【權(quán)利要求】
1.一種融合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述融合蛋白的基因。
3.重組人DKKl多表位核酸疫苗，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.含有權(quán)利要求2所述基因或權(quán)利要求3所述核酸疫苗的載體。
5.含有權(quán)利要求2所述基因或權(quán)利要求3所述核酸疫苗的宿主細(xì)胞。
6.含有權(quán)利要求2所述基因或權(quán)利要求3所述核酸疫苗的工程菌。
7.制備權(quán)利要求3所述核酸疫苗的方法，其特征在于，包括如下步驟:將SEQID N0.2所示的基因序列克隆到真核表達載體，將獲得的重組表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，經(jīng)菌體擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，即得重組人DKKl多表位核酸疫苗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述真核表達載體為PCMV6-XL5。
9.權(quán)利要求3所述核酸疫苗在制備治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物中的應(yīng)用。
10.一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物 ，其有效成分包括權(quán)利要求3所述的核酸疫苗。
【文檔編號】C12N1/21GK103910801SQ201410101801
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月18日
【發(fā)明者】袁慧慧, 張曉清, 趙文明, 李慎濤 申請人:首都醫(yī)科大學(xué)