重組多刺激分子細(xì)胞及其制備方法和在nkt細(xì)胞擴(kuò)增中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了重組多刺激分子細(xì)胞ME64/CD137L/mIL-18及其制備方法和在NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用；該細(xì)胞以MEG-01細(xì)胞為載體，轉(zhuǎn)染CD64真核表達(dá)載體，經(jīng)篩選，分選，獲得ME64細(xì)胞；再制備雙表達(dá)CD137L和mIL-18的真核表達(dá)載體；將該載體轉(zhuǎn)染ME64細(xì)胞，獲得ME64/CD137L/mIL-18細(xì)胞；該細(xì)胞易于大量制備、成本低、重復(fù)性好、能夠穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白。該細(xì)胞用于NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增中可刺激NKT細(xì)胞的大量擴(kuò)增，提高NKT細(xì)胞的增殖次數(shù)及腫瘤細(xì)胞殺傷毒性。
【專利說(shuō)明】重組多刺激分子細(xì)胞及其制備方法和在NKT細(xì)胞擴(kuò)增中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】及疾病免疫治療領(lǐng)域，具體涉及一種重組多刺激分子細(xì)胞及其制備方法和在NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]重組多刺激分子細(xì)胞的制備原理是模擬T細(xì)胞活化的雙重信號(hào)機(jī)制，在一定的載體表面展現(xiàn)抗原肽-MHC分子復(fù)合物及共刺激分子、黏附分子的配體或抗體構(gòu)建而成，它能有效活化和擴(kuò)增抗原特異性T細(xì)胞，而且效率高、可行性好。
[0003]目前用于制備重組多刺激分子細(xì)胞的載體主要有磁珠、細(xì)胞和脂質(zhì)體三類，以磁珠為載體構(gòu)建重組多刺激分子細(xì)胞雖然來(lái)源方便，但價(jià)格昂貴，應(yīng)用于體內(nèi)，會(huì)引起鐵中毒，約束了其醫(yī)療應(yīng)用前景；以脂質(zhì)體為載體制備過(guò)程較為繁瑣，成本較高，涉及脂質(zhì)材料的購(gòu)買、不同孔徑大小脂質(zhì)體的形成及確定等等步驟，且每次應(yīng)用時(shí)必須從頭開始制備，限制其廣泛應(yīng)用。[0004]⑶64是特異性的細(xì)胞毒劑的傳遞者，⑶64組成性表達(dá)于單核細(xì)胞、ΜΦ及DC細(xì)胞；IFN-y可明顯上調(diào)單核細(xì)胞⑶64的表達(dá)，并可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞⑶64的表達(dá)KD64是高親和力的Ig Fc-gamma受體(Fe Y R )，可介導(dǎo)ADCC，通過(guò)IgG的調(diào)理促進(jìn)對(duì)顆粒性抗原的吞噬作用，增加吞噬細(xì)胞釋放IL-l\IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子；OT64結(jié)合Ig Fe段后參與信號(hào)的傳遞。
[0005]⑶137是腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族成員，主要參與T細(xì)胞的擴(kuò)增，生成與發(fā)育，也可以誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞的增殖，在TCR/CD3誘導(dǎo)下可促進(jìn)T細(xì)胞的凋亡，同時(shí)可以調(diào)節(jié)與CD28共刺激的Thl細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。TRAF受體蛋白可以與它相互作用，引導(dǎo)信號(hào)通路轉(zhuǎn)向NF- κΒ的激活KD137L就是與⑶137相互作用的蛋白，利用外源表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ME64細(xì)胞，使⑶137L蛋白以及IL-18得以表達(dá)，獲得的重組多刺激分子細(xì)胞，可以很好的與NKT細(xì)胞相互作用，增強(qiáng)NKT細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞靶向殺傷性。
[0006]在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中，mIL-18可以抑制癌癥發(fā)生，它可以與mIL-12協(xié)同作用，誘導(dǎo)Thl細(xì)胞生成INF-Y作用于腫瘤細(xì)胞；同時(shí)，協(xié)同mIL-15或者單獨(dú)作用，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的殺傷作用或殺傷性T淋巴細(xì)胞的活化；與mIL-12 —起可以誘導(dǎo)mIL-13或者其它T淋巴細(xì)胞因子的生成。
[0007]NKT細(xì)胞(natural killer T細(xì)胞，一群細(xì)胞表面既有T細(xì)胞受體TCR，又有NK細(xì)胞受體的特殊T細(xì)胞亞群)是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子(如抗CD3單克隆抗體、IL-2和IFN-Y等)共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，由于該種細(xì)胞同時(shí)表達(dá)CD3+和CD56+兩種膜蛋白分子，故稱之為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)；因此，應(yīng)用NKT細(xì)胞被認(rèn)為是新一代抗腫瘤過(guò)繼細(xì)胞免疫治療的首選方案。
[0008]NKT細(xì)胞中的效應(yīng)細(xì)胞⑶3+和⑶56+細(xì)胞在正常人外周血中極其罕見(jiàn)，僅1%—5%，因此如何在體外有效的擴(kuò)增出大量殺傷力強(qiáng)、數(shù)量多的NKT細(xì)胞成為臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。目前，現(xiàn)有的NKT細(xì)胞的體外擴(kuò)增主要應(yīng)用外源性細(xì)胞因子，如抗CD3McAb和IL-2等，而在腫瘤細(xì)胞殺傷過(guò)程中，增強(qiáng)NKT細(xì)胞的靶向殺傷性以及殺傷效力，顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種重組多刺激分子細(xì)胞及其制備方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中重組多刺激分子細(xì)胞制備過(guò)程復(fù)雜、成本高及重復(fù)性差的問(wèn)題。
[0010]本發(fā)明的另一目的是提供上述重組多刺激分子細(xì)胞在NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用，該重組多刺激分子細(xì)胞可刺激NKT細(xì)胞的大量擴(kuò)增，抑制NKT細(xì)胞的凋亡，提高NKT細(xì)胞的增殖次數(shù)及腫瘤細(xì)胞殺傷毒性。
[0011]為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
提供一種重組多刺激分子細(xì)胞，其為能在人急性髓系白血病細(xì)胞MEG-OI細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá) CD64、CD137L 和 mIL_18 的細(xì)胞，即 ME64/CD137L/mIL_18 細(xì)胞。
[0012]制備上述重組多刺激分子細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
a、構(gòu)建CD64真核表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)染MEG-Ol細(xì)胞，再經(jīng)篩選，分選，獲得能夠在MEG-Ol細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)CD6 4的細(xì)胞，即ME64細(xì)胞；
b、制備雙表達(dá)⑶137L和mIL-18共刺激信號(hào)的真核表達(dá)載體；
C、將步驟b制得的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述ME64細(xì)胞，再經(jīng)篩選，分選，獲得能夠在ME64細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)CD137L和mIL-18的細(xì)胞，即ME64/CD137L/mIL_18細(xì)胞。
[0013]步驟a具體為:獲取CD64的cDNA，再將CD64 cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得CD64 cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；將所述CD64 cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT載體連接，構(gòu)建pGEMT_CD64原核表達(dá)載體；再分別對(duì)pGEMT-⑶64和pcDNA3.1 (+)進(jìn)行Not I和Apa I雙酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建pcDNA3.1 (+)-⑶64真核表達(dá)載體，即⑶64真核表達(dá)載體；再將⑶64真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MEG-Ol細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，F(xiàn)ACS分選，獲得ME64細(xì)胞；
其中，擴(kuò)增⑶64 cDNA的引物序列為:
上游序列:5’ - TATGCGGCCGCATGGATTTCACTGCTCCCACC-3’
下游序列:5’_ GGGGGGCCCAATAGATAGACCGTCACCCTT-3’。
[0014]所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，94°C 30秒，55°C I分鐘，72°C 90秒，最終72 °C延伸30分鐘。
[0015]步驟b具體為:獲取CD137L的cDNA，再將CD137L cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得CD137L cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；將所述CD137L cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT載體連接，構(gòu)建PGEMT-CD137L原核表達(dá)載體；其中，擴(kuò)增CD137L cDNA的引物的序列為:
上游序列:5’ - GGCCGCCATGGAATACGCCTCTGA -3’ ；
下游序列:5’_ CAGCTGTGGGTGAGGAAGGGGTTC-3’ ；
I1、獲取 mlL-18 的 cDNA，再將 mlL-18 cDNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得 mlL-18 cDNA 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；將所述mIL-18 cDNA與pGEMT載體連接，構(gòu)建pGEMT- mIL_18原核表達(dá)載體；其中，擴(kuò)增mIL-18 cDNA的引物的序列為:
上游序列:5’_ GAATTCGCCTGGACAGTCAGCAAG-3’
下游序列:5’_ GAGCTCTCTAACGTGGTAACGCGA-3’ ；II1、用NotI和Sal I酶分別對(duì)pGEMT-⑶137L和pVitro_2進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建pV⑶137L真核表達(dá)載體；
IV、用EcoRI和XhoI酶分別對(duì)pGEMT-mIL_18和pVCD137L進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，制得雙表達(dá)CD137L和mIL-18的真核表達(dá)載體pVCD137L- mIL -18。
[0016]步驟III中，所述PGEMT-⑶137L的酶切產(chǎn)物與pVitro_2的酶切產(chǎn)物按照3:1的比例進(jìn)行連接；
步驟IV中，所述pGEMT-mIL-18的酶切產(chǎn)物與pV⑶137L的酶切產(chǎn)物按照3:1的比例進(jìn)行連接。
[0017]上述重組多刺激分子細(xì)胞在NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用，具體為:
將重組多刺激分子細(xì)胞ME64/⑶137L/ mIL-18進(jìn)行致死性照射或絲霉素處理后，再與人外周血單個(gè)核細(xì)胞按照1:1的比例混合，在RPM1640培養(yǎng)基中共培養(yǎng)5-10天后，再加入與處理前相同數(shù)量的重組多刺激分子細(xì)胞ME64/⑶137L/ mIL-18繼續(xù)培養(yǎng)10-20天后，收集NKT細(xì)胞。
[0018]將ME64/CD137L/ mIL-18進(jìn)行絲霉素處理，具體步驟為:
取ME64/CD137L/ mIL_18細(xì)胞用濃度為10 μ g/ml的絲裂霉素在37°C下作用2小時(shí)后，無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗2遍，用RPM 1640培養(yǎng)基懸浮，再加入⑶3單克隆抗體，使ME64/CD137L/ mIL-18細(xì)胞的終濃度為100ng/ml，室溫下作用60分鐘即可。
[0019]綜上所述，本發(fā)明具有以下有益效果:
I)本發(fā)明的重組多刺激分子細(xì)胞易于制備、成本低、重復(fù)性好、效力高，能夠穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白；該重組多刺激分子細(xì)胞用于NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增中可刺激NKT細(xì)胞的大量擴(kuò)增，抑制NKT細(xì)胞的凋亡，提高NKT細(xì)胞的增殖次數(shù)及腫瘤細(xì)胞殺傷毒性。
[0020]2)本發(fā)明所選用的人急性髓系白血病細(xì)胞MEG-Ol細(xì)胞是很好的轉(zhuǎn)染載體，它能夠高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因，同時(shí)具備流動(dòng)性膜結(jié)構(gòu)，因此能更好地傳遞刺激信號(hào)；并且，在用于NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增共培養(yǎng)前，加入絲裂霉素或致死性照射便可抑制其增殖，共培養(yǎng)時(shí)由于NKT細(xì)胞的殺傷作用而凋亡，保證了其體內(nèi)應(yīng)用的安全性。
[0021]3)本發(fā)明的制備方法以細(xì)胞為載體構(gòu)建重組多刺激分子細(xì)胞，在腫瘤過(guò)繼免疫治療中應(yīng)用，比以磁珠和脂質(zhì)體為載體等方法更具穩(wěn)定性、特異性以及高效性；并且，本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建雙信號(hào)刺激通 路，用于NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增當(dāng)中可刺激NKT細(xì)胞的大量增殖，縮短培養(yǎng)周期，同時(shí)抑制NKT細(xì)胞的凋亡，提高NKT細(xì)胞的殺傷毒性。
[0022]4)本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞系，能夠很好地將mIL _18蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)折疊，而通過(guò)在細(xì)胞膜表面進(jìn)行表達(dá)能夠更有效地對(duì)NKT細(xì)胞進(jìn)行刺激，得到的細(xì)胞可以表達(dá)更高的穿孔素和顆粒酶，細(xì)胞毒性更強(qiáng)，殺瘤性更強(qiáng)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0023]圖1為本發(fā)明-實(shí)施例的⑶64 cDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖；
圖2為本發(fā)明-實(shí)施例的pGEMT-CD64的雙酶切結(jié)果電泳圖；
圖3為本發(fā)明-實(shí)施例的pcDNA3.1 ( + )-⑶64雙酶切結(jié)果電泳圖；
圖4-1和圖4-2為本發(fā)明-實(shí)施例的⑶64在MEG-Ol細(xì)胞中表達(dá)的熒光顯微圖；
圖5-1和圖5-2為本發(fā)明-實(shí)施例的流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD64在MEG-Ol細(xì)胞表達(dá)的示意圖；
圖6為本發(fā)明-實(shí)施例的pGEMT-⑶137L雙酶切鑒定圖；
圖7為本發(fā)明-實(shí)施例的pGEMT- mIL -18雙酶切鑒定圖；
圖8為本發(fā)明-實(shí)施例的pV⑶137L雙酶切圖；
圖9為本發(fā)明-實(shí)施例的pVitro- mIL -18雙酶切圖；
圖10-1、圖10-2、圖10-3和圖10-4為本發(fā)明-實(shí)施例的FACS檢測(cè)三種外源性分子在MEG-Ol細(xì)胞表面表達(dá)率的示意圖。
[0024]圖11-1和圖11-2為本發(fā)明-實(shí)施例的重組多刺激分子細(xì)胞刺激NKT細(xì)胞的殺傷效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，但它們不是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限制。
[0026]1、ME64細(xì)胞的制備:獲取CD64 cDNA,對(duì)CD64 cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得CD64cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再構(gòu)建原核表達(dá)載體PGEMT-CD64，進(jìn)一步構(gòu)建其真核表達(dá)載體pcDNA3.1 ( + )_CD64，將重組質(zhì)粒 pcDNA3.1 ( + ) -CD64 轉(zhuǎn)染 MEG-Ol 細(xì)胞，G418 篩選，F(xiàn)ACS分選獲得ME64細(xì)胞； 具體為:
(I)⑶64 cDNA的獲取及目的片段擴(kuò)增:取對(duì)數(shù)期U937細(xì)胞，用Trizol常規(guī)抽提RNA，以01igod(T)n為引物，反轉(zhuǎn)錄mRNA生成cDNA ;再將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得CD64cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，片段大小為1000pb左右，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的949 bp大致相符；如圖1所示，I為CD64cDNA 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物;2 為 DNA ladder ；
其中，用primer5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增CD64 cDNA的引物,兩端分別加Not I和Apa I的酶切位點(diǎn)及保護(hù)型堿基；擴(kuò)增CD64 cDNA的引物的序列為:
上游序列:5’_ TATGCGGCCGCATGGATTTCACTGCTCCCACC-3’
下游序列:5’_ GGGGGGCCCAATAGATAGACCGTCACCCTT-3’。
[0027]PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，94°C 30秒，55°C I分鐘，72°C 90秒，最終72°C延伸30分鐘。
[0028](2) CD64 真核表達(dá)載體 pcDNA3.1( + ) -CD64 的構(gòu)建
a、⑶64 cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化，定量Marker確定濃度后，與pGEMT載體按3:1比例4°C連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a的感受態(tài)菌株中，次日挑取中等大小的白色菌落，在含AMP抗生素液體培養(yǎng)基中搖過(guò)夜，抽提pGEMT-CD64重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后，顯示為3kb和Ikb左右的片段(見(jiàn)圖2)，獲得pGEMT-⑶64真核表達(dá)載體；酶切純化后測(cè)序，比對(duì)證明為⑶64的正確目的片段序列；圖2中，I為pGEMT-⑶64雙酶切產(chǎn)物；2 為 DNA ladder。
[0029]b、用Not I和Apa I酶分別對(duì)pGEMT_CD64和pcDNA3.1 (+)進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物純化后，進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5CI的感受態(tài)菌株中，次日挑取中等大小的白色菌落，在含AMP抗生素液體培養(yǎng)基中搖過(guò)夜，抽提pcDNA3.1 (+)-⑶64重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定后，獲得顯示為5.4kb和Ikb左右的片段(見(jiàn)圖3)，獲得pcDNA3.1 (+)-⑶64真核表達(dá)載體；試驗(yàn)證實(shí)⑶64已經(jīng)成功地克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1 (+)-⑶64中；圖3中，I為DNA ladder, 2 為 pcDNA3.1 (+) -CD64 雙酶切產(chǎn)物。[0030](3)穩(wěn)定表達(dá)外源CD64的MEG-Ol細(xì)胞系及ME64細(xì)胞系的建立
重組質(zhì)粒pcDNA3.1 ( + )-⑶64轉(zhuǎn)染MEG-Ol細(xì)胞:在無(wú)菌條件下抽提pcDNA3.1 ( + )-0)64重組質(zhì)粒,按照Invitrogen公司的說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,具體過(guò)程為:取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的MEG-Ol細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗兩遍，在24孔板的每個(gè)孔中加入I X IO5個(gè)細(xì)胞，共十孔；取16 μ g的pcDNA3.1 ( + )-⑶64質(zhì)粒用質(zhì)粒稀釋液稀釋至總量400 μ I，再取32μ I的脂質(zhì)體用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至總量400μ 1，二者混合，微混勻，室溫孵育10分鐘，制得混合物；八孔中的每個(gè)孔加入100μ I的混合物，另外兩孔作為陰性對(duì)照，37°C、5%C02培養(yǎng)4小時(shí)后加入完全培養(yǎng)基，48小時(shí)后加入潮霉素和G418進(jìn)行篩選；在此期間，每3-4天換夜一次，低速離心去除死細(xì)胞，3周后篩選出潮霉素及G418抗性的細(xì)胞；其中，潮霉素濃度為 200 μ g/mlo
[0031](4)熒光顯微鏡檢測(cè)CD64的表達(dá):取G418抗性的ME64細(xì)胞I X IO5,再用PE標(biāo)記的⑶64單抗4°C孵育30分鐘，PBS洗滌三遍后，再用PBS懸浮，熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)紅色的熒光細(xì)胞，見(jiàn)圖4-2 ;圖4-1為PE-CD64標(biāo)記MEG-Ol細(xì)胞；圖4_2為PE-CD64標(biāo)記ME64細(xì)胞。
[0032](5)流式細(xì)胞儀(FACS)分選CD64陽(yáng)性的細(xì)胞:取G418抗性的ME64細(xì)胞5X 106，PE-CD64單抗標(biāo)記，PBS洗滌；流式細(xì)胞儀分選后，繼續(xù)培養(yǎng)I周，再次用流式細(xì)胞儀定量檢測(cè)⑶64的表達(dá)情況；圖5-2顯示⑶64的表達(dá)率為97.5% ;圖5_1為轉(zhuǎn)染MEG-Ol表達(dá)⑶64的陽(yáng)性率；圖5-2為ME64表達(dá)⑶64的陽(yáng)性率。
[0033]2、制備雙表達(dá)⑶137L和mIL _18共刺激信號(hào)的真核表達(dá)載體，將該真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ME64細(xì)胞，再通過(guò)潮霉素篩選，流式細(xì)胞儀分選得到穩(wěn)定表達(dá)⑶137L和mIL -18的ME64 細(xì)胞，即為 ME64/ CD1 37L/ mIL -18 細(xì)胞；
(I)⑶137L基因片段的獲取及鑒定:取正常人外周血5ml，F(xiàn)icoll常規(guī)分離單個(gè)核細(xì)胞，加入PMA培養(yǎng)3天后，抽提RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得⑶137LcDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
其中，用primer5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增CD137L cDNA的引物，擴(kuò)增CD137L cDNA的引物的序列為:
上游序列:5’_ GGCCGC CATGGAATACGCCTCTGA-3’ ；
下游序列:5’_ CAGCTGTGGGTGAGGAAGGGGTTC-3’ ；
⑶137L cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后與pGEMT載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5 α的感受態(tài)菌株中，次日挑取中等大小的白色菌落，在含AMP抗生素液體培養(yǎng)基中搖過(guò)夜，抽提PGEMT-⑶137L重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)Not I和Sal I酶雙酶切鑒定正確后，獲得pGEMT-⑶137L原核表達(dá)載體；測(cè)序結(jié)果證實(shí)pGEMT-⑶137L的插入片段與人⑶137L分子有99%的同源性，見(jiàn)圖6 ;圖6中，I為DNA ladder ；2為pGEMT_CD137L雙酶切產(chǎn)物。
[0034](2)mIL_18基因的基因片段的獲取及鑒定:
無(wú)菌抽取健康人外周血，EDTA抗凝，用淋巴細(xì)胞分離液分離出外周血單核細(xì)胞，經(jīng)PHA刺激，37°C、0.5% CO2孵育30 h，使淋巴因子得以表達(dá)，按照Trizol說(shuō)明書提取mRNA，再反轉(zhuǎn)錄得到編碼mIL-18的cDNA ;再將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得mIL_18 cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
其中，用primer5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增mIL_18 cDNA的引物,擴(kuò)增mIL_18 cDNA的引物的序列為:
上游序列:5’ - GAATTCGCCTGGACAGTCAGCAAG-3’
下游序列:5’_ GAGCTCTCTAACGTGGTAACGCGA-3’ ；
mIL-18 cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后與pGEMT載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5 α的感受態(tài)菌株中，次日挑取中等大小的白色菌落，在含AMP抗生素液體培養(yǎng)基中搖過(guò)夜，抽提pGEMT- mIL-18重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和XhoI雙酶切鑒定正確后，獲得pGEMT- mIL-18真核表達(dá)載體；測(cè)序結(jié)果證實(shí)pGEMT-mIL-18的插入片段與人mIL_18有99%的同源性，見(jiàn)圖7 ;圖7中，I為pGEMT-mIL-18雙酶切產(chǎn)物；2為DNA ladder。
[0035](3)雙表達(dá)CD137L和mIL-18的真核表達(dá)載體pVCD137L-mIL_18的構(gòu)建
將用Not I和Sal I酶切下pGEMT-⑶137L原核表達(dá)載體的插入片段⑶137L，與經(jīng)同樣酶切處理的pVitro-2原核表達(dá)載體按3:1的比例4°C連接過(guò)夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5 α菌株后，次日挑取菌落，在含潮霉素的液體LB培養(yǎng)基中搖過(guò)夜，抽提pV⑶137L重組質(zhì)粒，酶切鑒定，獲得pV⑶137L真核表達(dá)載體；用EcoRI和XhoI酶切下pGEMT-mIL-18原核表達(dá)載體的片段mIL-18，與同樣經(jīng)過(guò)酶切處理的pV⑶137L真核表達(dá)載體按3:1的比例連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)菌株中，次日挑取菌落，抽取pVitro-⑶137L- mIL-18質(zhì)粒，酶切鑒定，獲得雙表達(dá)CD137L和mIL-18的載體pVitro-CD137L- mIL -18，命名為pV⑶137L-mIL-18真核表達(dá)載體(見(jiàn)圖8和圖9);其中，圖8和圖9分別顯示pV⑶137L和pV⑶137L- mIL -18雙酶切鑒定mIL -18和⑶137L的插入片段圖；圖8中，I為雙酶切的⑶137L目的片段和pV⑶137L真核表達(dá)載體；2為DNA marker ；圖9中，I為DNAmarker ；2為雙酶切的mIL -18目的片段和pV⑶137L-mIL_18真核表達(dá)載體。
[0036](4)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pVCD137L- mIL-18的ME64細(xì)胞系建立
在無(wú)菌條件下抽提pV⑶137L-mIL-18質(zhì)粒,按照Invitrogen公司的說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作具體過(guò)程為:取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ME64細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基洗兩遍，在24孔板的每個(gè)孔中加入I X IO5個(gè)細(xì)胞，共十孔；取16 μ g的pV⑶137L-mIL-18質(zhì)粒用質(zhì)粒稀釋液稀釋至總量400 μ 1，取32 μ I的脂質(zhì)體用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至總量400 μ 1，二者混合，微混勻，室溫孵育10分鐘，制得混合物；八孔中的每個(gè)孔加入100 μ I的混合物，另外兩孔作為陰性對(duì)照；37°C、5%C02培養(yǎng)4小時(shí)后加入完全培養(yǎng)基，48小時(shí)后加入潮霉素和G418篩選；在此期間，每3-4天換夜一次，低速離心去除死細(xì)胞，3周后篩選出潮霉素及G418抗性的細(xì)胞；其中，潮霉素濃度為200 μ g/ml O
[0037](5) FACS 分選 CD64、CD137L 和 mIL 陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞 ME64/CD137L/ mIL -18: 收集潮霉素和G418篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pVmIL-18-CD137L的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ME64細(xì)胞，
PBS洗滌后，PE-CD64單抗、FITC-1L-18及PE-CY5-CD137L單抗標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面⑶64、⑶137L和mIL-18蛋白表達(dá)，經(jīng)FACS分選的陽(yáng)性細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)I周，再次用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD64、CD137L和mIL-18的表達(dá)情況，如圖10-1、圖10-2、圖10-3和圖10-4所示，圖10-1和圖10-2顯示FACS檢測(cè)三種外源性分子在MEG-Ol細(xì)胞表面的表達(dá)情況；圖10-3和圖10-4顯示經(jīng)潮霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MEG-Ol細(xì)胞表面三種外源性分子的表達(dá)情況。
[0038]3、ME64/CD137L/mIL-18細(xì)胞與人單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)共培養(yǎng)，刺激NKT細(xì)胞的增殖與細(xì)胞殺傷毒性
(I)取ME64/CD137L/mIL-18細(xì)胞用濃度為10 μ g/ml的絲裂霉素在37°C作用2小時(shí)后，無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗2遍，用RPM 1640細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮，加入⑶3單克隆抗體，使ME64/CD137L/mIL-18細(xì)胞的終濃度為100ng/ml，室溫作用60分鐘備用；
(2)用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)并計(jì)數(shù)；
(3)經(jīng)過(guò)處理的重組多刺激分子細(xì)胞ME64/⑶137L/mIL-18與人單個(gè)核細(xì)胞按2:1的比例混合，加入自體血清，使ME64/CD137L/mIL-18細(xì)胞的終濃度為1%。37°C、5%C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于I周后加入與初次加入數(shù)量相等的相同方法制備的重組多刺激分子細(xì)胞ME64/CD137L/mIL-18，15 天后收集 NKT 細(xì)胞；
(4)將步驟(3)中收集的NKT細(xì)胞與A549細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)NKT細(xì)胞殺傷A549細(xì)胞的能力，見(jiàn)圖11-1和圖11-2;圖11-2為NKT細(xì)胞與A549共培養(yǎng)的殺傷效果。
[0039]結(jié)果表明:構(gòu)建的重組多刺激分子細(xì)胞ME64/⑶137L/mI L-18可以高效刺激NKT細(xì)胞的增殖，大大提高NKT細(xì)胞的殺傷毒性，提高了 NKT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向殺傷性；此外，ME64/⑶137L/mIL-18細(xì)胞可增強(qiáng)其余的T淋巴細(xì)胞，協(xié)同NKT同時(shí)殺傷靶細(xì)胞，加強(qiáng)對(duì)腫瘤的殺傷力。
[0040]雖然結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了詳細(xì)地描述，但并非是對(duì)本專利保護(hù)范圍的限定。在權(quán)利要求書所限定的范圍內(nèi)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員不經(jīng)創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或調(diào)整仍受本專利的保護(hù)。
[0041]以上所述僅為本申請(qǐng)的實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等， 均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.重組多刺激分子細(xì)胞，其特征是:其為能在人急性髓系白血病細(xì)胞MEG-Ol細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá) CD64、CD137L 和 mIL_18 的細(xì)胞，即 ME64/CD137L/mIL_18 細(xì)胞。
2.制備權(quán)利要求1所述的重組多刺激分子細(xì)胞的方法，其特征是，包括以下步驟: a、構(gòu)建CD64真核表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)染MEG-Ol細(xì)胞，再經(jīng)篩選，分選，獲得能夠在MEG-Ol細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)CD64的細(xì)胞，即ME64細(xì)胞； b、制備雙表達(dá)⑶137L和mIL-18共刺激信號(hào)的真核表達(dá)載體； C、將步驟b制得的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述ME64細(xì)胞，再經(jīng)篩選，分選，獲得能夠在ME64細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)CD137L和mIL-18的細(xì)胞，即ME64/CD137L/mIL_18細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，步驟a具體為:獲取CD64的cDNA，再將CD64cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得CD64 cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；將所述CD64 cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT載體連接，構(gòu)建pGEMT-CD64原核表達(dá)載體；再分別對(duì)pGEMT_CD64和pcDNA3.1 (+)進(jìn)行Not I和Apa I雙酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建pcDNA3.1 (+)-⑶64真核表達(dá)載體，即⑶64真核表達(dá)載體；再將⑶64真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MEG-Ol細(xì)胞，經(jīng)G418篩選，F(xiàn)ACS分選，獲得ME64細(xì)胞； 其中，擴(kuò)增⑶64 cDNA的引物的序列為: 上游序列:5’_ TATGCGGCCGCATGGATTTCACTGCTCCCACC-3’ 下游序列:5’_ GGGGGGCCCAATAGATAGACCGTCACCCTT-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是:所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5分鐘，94°C 30 #,55°C I分鐘，72°C 90秒，最終72°C延伸30分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，步驟b具體為: 1、獲取CD137L 的 cDNA，再將 CD137L cDNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得 CD137L cDNA 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；將所述⑶137L cDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與pGEMT載體連接，構(gòu)建pGEMT-⑶137L原核表達(dá)載體；其中，擴(kuò)增⑶137L cDNA的引物的序列為: 上游序列:5’_ GGCCGCCATGGAATACGCCTCTGA-3’ 下游序列:5’_ CAGCTGTGGGTGAGGAAGGGGTTC-3’ ； I1、獲取mlL-18 的 cDNA，再將 mlL-18 cDNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得 mlL-18 cDNA 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；將所述mIL-18 cDNA與pGEMT載體連接，構(gòu)建pGEMT- mIL_18原核表達(dá)載體；其中，擴(kuò)增mIL-18 cDNA的引物的序列為: 上游序列:5’_ GAATTCGCCTGGACAGTCAGCAAG-3’ 下游序列:5’_ GAGCTCTCTAACGTGGTAACGCGA-3’ ； II1、用NotI和Sal I酶分別對(duì)pGEMT-⑶137L和pVitro_2進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建pV⑶137L真核表達(dá)載體； IV、用EcoRI和XhoI酶分別對(duì)pGEMT-mIL_18和pVCD137L進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，制得雙表達(dá)CD137L和mIL-18的真核表達(dá)載體pVCD137L- mIL -18。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是:步驟III中，所述pGEMT-CD137L的酶切產(chǎn)物與pVitro-2的酶切產(chǎn)物按照3:1的比例進(jìn)行連接； 步驟IV中，所述pGEMT- mIL-18的酶切產(chǎn)物與pV⑶137L的酶切產(chǎn)物按照3:1的比例進(jìn)行連接。
7.權(quán)利要求1或2所述的重組多刺激分子細(xì)胞在NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組多刺激分子細(xì)胞在NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用，具體為: 將重組多刺激分子細(xì)胞ME64/⑶137L/ mIL-18進(jìn)行致死性照射或絲霉素處理后，再與人外周血單個(gè)核細(xì)胞按照1:1的比例混合，在RPM1640培養(yǎng)基中共培養(yǎng)5-10天后，再加入與處理前相同數(shù)量的重組多刺激分子細(xì)胞ME64/⑶137L/ mIL-18繼續(xù)培養(yǎng)10-20天后，收集NKT細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組多刺激分子細(xì)胞在NKT細(xì)胞體外擴(kuò)增中的應(yīng)用，其特征是:將ME64/CD137L/ mIL_18進(jìn)行絲霉素處理，具體步驟為: 取ME64/CD137L/ mIL_18細(xì)胞用濃度為10 μ g/ml的絲裂霉素在37°C下作用2小時(shí)后，無(wú)血清1640培養(yǎng)基洗2遍，用RPM 1640培養(yǎng)基懸浮，再加入⑶3單克隆抗體，使ME64/CD137L/ mIL-18細(xì)胞 的終濃度為100ng/ml，室溫下作用60分鐘即可。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103937747SQ201410102175
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】申重陽(yáng), 朱姣蓮, 陳潔 申請(qǐng)人:成都康景生物科技有限公司