一種產(chǎn)n-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。其中所述工程菌是通過(guò)將編碼UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因引入枯草芽孢桿菌中表達(dá)，同時(shí)加強(qiáng)枯草芽孢桿菌自身的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶表達(dá)，在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建成從葡萄糖或甘油到N-乙酰神經(jīng)氨酸的完整代謝通路，從而能利用葡萄糖或甘油為底物進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。本發(fā)明所采用的枯草芽孢桿菌在食品工業(yè)上已得到廣泛的應(yīng)用，已被證明安全無(wú)害，適合于生產(chǎn)食品和保健品所需的N-乙酰神經(jīng)氨酸。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，屬生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]唾液酸，又稱(chēng)燕窩酸，廣泛存在于自然界的各種生物體內(nèi)，唾液酸是一系列含有9個(gè)碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖的統(tǒng)稱(chēng)，其中最主要的組分是N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)。
[0003]N-乙酰神經(jīng)氨酸目前的應(yīng)用主要有兩個(gè)領(lǐng)域，一個(gè)是作為醫(yī)藥中間體，用于合成抗流感藥物扎那米韋；另一個(gè)是作為食品添加劑，用于嬰幼兒奶粉中，以使其接近母乳，促進(jìn)嬰兒神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。
[0004]作為醫(yī)藥中間體的N-乙酰神經(jīng)氨酸，可以用生物催化法和發(fā)酵法生產(chǎn)，其中生物催化法是以N-乙酰氨基葡萄糖和丙酮酸鈉為原料，以高表達(dá)神經(jīng)氨酸醛縮酶和N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶的大腸桿菌菌體或細(xì)菌破碎液為催化劑，轉(zhuǎn)化生成N-乙酰神經(jīng)氨酸。發(fā)酵法生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸是對(duì)大腸桿菌進(jìn)行代謝工程改造，使其能從葡萄糖或甘油直接合成N-乙酰神經(jīng)氨酸。
[0005]用作食品添加劑的N-乙酰神經(jīng)氨酸目前主要還是從含有N-乙酰神經(jīng)氨酸的天然原料(如雞蛋、乳清、燕窩等)中直接提取，該方法生產(chǎn)的產(chǎn)品為天然來(lái)源，安全可靠，但由于含量太低和成分復(fù)雜導(dǎo)致提取工藝復(fù)雜，成本高昂。而目前生物轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法都是以大腸桿菌進(jìn)行生產(chǎn)，大腸桿菌由于發(fā)酵過(guò)程中會(huì)有內(nèi)毒素產(chǎn)生，對(duì)于其生產(chǎn)出的終產(chǎn)品可能會(huì)有不利的影響，因此，大腸桿菌生產(chǎn)出的N-乙酰神經(jīng)氨酸在食品添加劑領(lǐng)域的應(yīng)用尚未得到權(quán)威認(rèn)可。
[0006]枯草芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)品已在人類(lèi)食品和保健品中得到廣泛的應(yīng)用，目前尚未發(fā)現(xiàn)毒副作用，被美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)認(rèn)證為一般認(rèn)為安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)類(lèi)微生物,具有安全無(wú)害的優(yōu)點(diǎn),可用于人類(lèi)食品保健品領(lǐng)域的生產(chǎn)。但相比大腸桿菌，枯草芽孢桿菌的遺傳改造比較復(fù)雜，代謝背景不清晰，尚未見(jiàn)改造后用于N-乙酰神經(jīng)氨酸合成生產(chǎn)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明選擇枯草芽孢桿菌作為生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的出發(fā)菌株，但分析枯草芽孢桿菌的代謝途徑可知，其從葡萄糖開(kāi)始可以合成到UDP-N-乙酰氨基葡萄糖，但缺乏從UDP-N-乙酰氨基葡萄糖合成到N-乙酰神經(jīng)氨酸的途徑，無(wú)法達(dá)到以葡萄糖為底物，發(fā)酵法直接合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的目的。[0009]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明在枯草芽孢桿菌中外源表達(dá)編碼UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶編碼基因neuC和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶編碼基因neuB，補(bǔ)足從UDP-N-乙酰氨基葡萄糖到N-乙酰神經(jīng)氨酸合成所需的酶，架構(gòu)起從葡萄糖到N-乙酰神經(jīng)氨酸的完整代謝途徑，從而實(shí)現(xiàn)利用葡萄糖直接發(fā)酵合成N-乙酰神經(jīng)氨酸的目的。
[0010]為進(jìn)一步提高N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量，本發(fā)明高表達(dá)枯草芽孢桿菌自身編碼6-磷酸氨基葡萄糖合成酶的glmS基因，打通從葡萄糖或甘油到N-乙酰神經(jīng)氨酸合成的瓶頸，增加代謝流量，從而增加N-乙酰神經(jīng)氨酸的產(chǎn)量。
[0011]為此，本發(fā)明提供了一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌是通過(guò)將m)P-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因?qū)肟莶菅挎邨U菌中進(jìn)行外源表達(dá)而構(gòu)建得到的。
[0012]本發(fā)明所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因neuC和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因neuB來(lái)源于空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)或能表達(dá)相同功能酶的微生物，基因的獲得可根據(jù)GenBank N0.AF400048中neuB和neuC基因序列全基因合成，或利用空腸彎曲菌(如菌株ATCC43438)的基因組DNA為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得，或采用過(guò)類(lèi)似手段從其他生物體獲得。由于來(lái)源于空腸彎曲菌的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因neuC和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因neuB連鎖在一起，因此外源表達(dá)是可以將兩個(gè)基因一起表達(dá),也可以將兩個(gè)基因分開(kāi)表達(dá)。[0013]所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因來(lái)源于枯草芽孢桿菌或能表達(dá)相同功能酶的微生物，基因的獲得可根據(jù)枯草芽孢桿菌168菌株基因組序列GenBank N0.AL009126.3中的glmS基因及其上游的SD序列全基因合成，或利用枯草桿菌168菌株的基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增獲得，或采用過(guò)類(lèi)似手段從其他生物體獲得。
[0014]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因在同一個(gè)載體中一起克隆表達(dá)。作為本領(lǐng)域的科研人員，利用常規(guī)的分子克隆技術(shù)，也可以將三個(gè)基因在不同載體中分開(kāi)克隆表達(dá)或以類(lèi)似方式完成外源表達(dá)，從而達(dá)到同樣目的。
[0015]在一個(gè)實(shí)施方案中,所述枯草芽孢桿菌宿主為枯草芽孢桿菌164或枯草芽孢桿菌168，并且所得到的基因工程菌已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址在中國(guó)武漢大學(xué)，保藏號(hào)分別為 CCTCC NO:M2013731 和 CCTCC N0:M2014038，保藏號(hào)為 CCTCC N0:M2013731 的分類(lèi)號(hào)為:枯草芽孢桿菌CASOV — 3Bacillus subtilis CASOV — 3，CCTCC N0:M2014038 的分類(lèi)號(hào)為:枯草芽孢桿菌CASOV — 4Bacillus subtilis CASOV — 4。本實(shí)施方案也可以選擇其他枯草芽孢桿菌菌株，達(dá)到類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br> [0016]本發(fā)明還公開(kāi)了一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，即利用上述工程菌以葡萄糖或甘油進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸，所述應(yīng)用包括以下步驟:
[0017]I)活化培養(yǎng)工程菌種子；
[0018]2)將培養(yǎng)好的種子逐級(jí)放大，并在相應(yīng)的發(fā)酵罐中進(jìn)行好氣培養(yǎng)；以及補(bǔ)充合適的碳氮源；
[0019]3)加入異丙基_β-D-硫代吡喃半乳糖苷，誘導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達(dá)。本發(fā)明通過(guò)基因工程技術(shù)對(duì)枯草芽孢桿菌進(jìn)行改造，使其可以以葡萄糖或甘油直接合成N-乙酰神經(jīng)氨酸，具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)本發(fā)明采用的枯草芽孢桿菌作為生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的宿主，所生產(chǎn)的N-乙酰神經(jīng)氨酸沒(méi)有內(nèi)毒素污染的威脅，安全可靠，可用于食品保健品領(lǐng)域，具有工業(yè)化生產(chǎn)的價(jià)值。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]下面結(jié)合附圖與【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明:
[0021]圖1是枯草芽孢桿菌中葡萄糖或甘油到N-乙酰神經(jīng)氨酸的合成改造途徑。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下實(shí)施例中使用的質(zhì)粒、PCR試劑等采用商業(yè)產(chǎn)品，具體操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。其他未注明的實(shí)驗(yàn)操作按照常規(guī)分子操作方法進(jìn)行。
[0023]實(shí)施例1:neuBC和glmS基因串聯(lián)表達(dá)載體的構(gòu)建
[0024]一、neuBC基因表達(dá)載體pHTOl-neuBC的構(gòu)建
[0025]I)根據(jù)neuBC的基因序列(GenBank N0.AF400048)全基因合成neuBC基因，兩端加BamHI和XbaI位點(diǎn)，具體序列如下所示(SEQ ID N0.1)。
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌是通過(guò)將UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因?qū)肟莶菅挎邨U菌中進(jìn)行外源表達(dá)而構(gòu)建得到的。
2.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因和N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因來(lái)源于空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)或能表達(dá)相同功能酶的微生物。
3.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因來(lái)源于枯草芽孢桿菌或能表達(dá)相同功能酶的微生物。
4.如權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向異構(gòu)酶基因、N-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因在同一個(gè)載體中一起克隆表達(dá)，或克隆在不同的載體后轉(zhuǎn)入同一菌株后中分開(kāi)表達(dá)。
5.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌宿主為枯草芽孢桿菌164或枯草芽孢桿菌168或其他類(lèi)似菌株。
6.如權(quán)利要求5所述的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌是保藏號(hào)為CCTCC N0:M2013731或CCTCC N0:M2014038的菌株。
7.如權(quán)利要求1所述的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌工程菌的用途，其特征在于利用所述工程菌生產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸，其步驟包括: 1)活化培養(yǎng)工程菌種子； 2)將培養(yǎng)好的種子逐級(jí)放大，并在相應(yīng)的發(fā)酵罐中進(jìn)行好氣培養(yǎng)；培養(yǎng)過(guò)程中補(bǔ)充合適的碳氮源；以及 3)加入異丙基_β-D-硫代吡喃半乳糖苷，誘導(dǎo)相關(guān)蛋白的表達(dá)。
8.權(quán)利要求7的產(chǎn)N-乙酰神經(jīng)氨酸的枯草芽孢桿菌工程菌的用途，其特征在于利用葡萄糖或甘油作為碳源進(jìn)行發(fā)酵。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK103923869SQ201410102633
【公開(kāi)日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】柳鵬福, 孫立潔, 王紀(jì), 袁麗霞, 劉洋, 吳金勇, 陳祥松, 史吉平, 姚建銘 申請(qǐng)人:武漢中科光谷綠色生物技術(shù)有限公司