一株具有乙酸耐受性的工業(yè)釀酒酵母菌株的制作方法
【專利摘要】一株具有乙酸耐受性的工業(yè)釀酒酵母菌株（4126-YHB1），屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該菌株分類命名為Saccharomyces?cerevisiae，菌株的登記入冊編號CGMCC?No.8725，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期為2014年1月15日。本發(fā)明公開了重組菌株4126-YHB1的基因工程構(gòu)建方法，包括基因的獲得，染色體整合載體的構(gòu)建，以及菌株乙酸條件下的生長和發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。與整合空載體的對照菌株相比，重組菌株4126-YHB1可以在含有5g/L乙酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行快速乙醇發(fā)酵，可以耐受纖維素水解液中高濃度的乙酸，是環(huán)境脅迫條件下乙醇發(fā)酵的良好菌株。
【專利說明】一株具有乙酸耐受性的工業(yè)釀酒酵母菌株
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株具有乙酸耐受性的工業(yè)釀酒酵母菌株(4126-YHB1)，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]由于化石燃料的儲備量不斷減少和國際原油價格的不穩(wěn)定等因素，國內(nèi)外對于可再生清潔能源的需要日益增加，生物燃料是具有良好發(fā)展前景的可再生能源。除了具有可再生能源的一般優(yōu)點(diǎn)外，生物燃料還可以減輕由化石燃料所引起的一系列問題，尤其可降低氣體排放所引起的溫室效應(yīng)。在眾多類型的生物燃料中，燃料乙醇表現(xiàn)出了巨大優(yōu)勢(Applied Microbiology and Biotechnology, 2009，85:253-263)。乙醇不僅是一種優(yōu)良燃料，也是一種優(yōu)良的燃油品質(zhì)改善劑，同時又具有極好的抗爆性能。我國擁有豐富的纖維素生物質(zhì)資源，如果能夠充分有效地利用這些原料生產(chǎn)燃料乙醇，既可以保護(hù)環(huán)境，還可以解決利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)乙醇產(chǎn)生的與人爭糧，與糧爭地的弊端。利用纖維素為原材料生產(chǎn)乙醇有利于經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展，同時也可以降低我國對于進(jìn)口石油能源的依賴，保障國家的能源安全。
[0003]木質(zhì)纖維素生物煉制乙醇過程中，由于原料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素之間致密的結(jié)構(gòu)，不利于纖維素酶對纖維素的水解，因此，木質(zhì)纖維素在酶水解前必須經(jīng)過預(yù)處理以提高纖維素對纖維素酶的可及度。稀酸和蒸汽爆破預(yù)處理是目前研究較多的預(yù)處理方法，在稀酸和蒸汽爆破預(yù)處理過程中，由于酸和熱的作用，原料中部分碳水化合物發(fā)生降解和分解作用，產(chǎn)生甲酸、乙酸等一系列對后續(xù)發(fā)酵有害的物質(zhì)，其中乙酸是主要的發(fā)酵抑制物，含量較高(生 物工程學(xué)報(bào)，2014, 30:368-380)。木質(zhì)纖維素預(yù)處理所產(chǎn)生的抑制劑會影響酵母的正常生長和后續(xù)的發(fā)酵過程。為減小抑制劑的影響所采取的一些脫毒策略往往造成糖的損失和生產(chǎn)成本的增加，影響了生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性。因此，選育具有強(qiáng)的抑制劑耐受性，包括具有強(qiáng)的乙酸耐受性的釀酒酵母菌株對于提高纖維素乙醇產(chǎn)率十分重要。
[0004]通過尋找與細(xì)胞脅迫耐性相關(guān)的基因，對釀酒酵母菌進(jìn)行代謝工程改造，可提高細(xì)胞在環(huán)境脅迫條件下的細(xì)胞活性，從而提高發(fā)酵效率。YHBl基因參與編碼抑制一氧化氮毒性的黃素血紅蛋白(Proceedings of the National Academy ofSciences, 1992，89:5015-5019)，黃素血紅蛋白可以保護(hù)細(xì)胞免受硝酸化脅迫壓力。敲除了 YHBl基因的細(xì)胞無法清除一氧化氮，黃素血紅蛋白在無氧及有氧條件下均可保護(hù)細(xì)胞免受一氧化氮及硝酸鹽脅迫作用(Proceedings of the National Academy ofSciences, 2000, 97:4672-4676)。此外，黃素血紅蛋白不僅與氮化脅迫相關(guān)，其在消除氧化脅迫方面也有顯著作用(Journal of Biological Chemistry, 2005，280:7645-7653)。但是該基因在乙醇及乙酸耐受性方面的研究很少，目前未見到有關(guān)于該基因的表達(dá)可提高乙酸耐受性的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的在于構(gòu)建一株具有乙酸耐受性的重組釀酒酵母菌株，從而可以在高濃度乙酸抑制物存在條件下快速高效的進(jìn)行乙醇發(fā)酵。
[0006]本發(fā)明涉及一株具有乙酸耐受性的重組釀酒酵母菌株(4126-YHB1)，該菌株分類命名為Saccharomyces cerevisiae,菌株的登記入冊編號為CGMCC N0.8725,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2014年I月15日。
[0007]所述菌株基因來源于實(shí)驗(yàn)室模式釀酒酵母S288c，將PCR擴(kuò)增得到的YHBl基因連接到PHO組成型整合表達(dá)載體，線性化后轉(zhuǎn)入工業(yè)釀酒酵母，實(shí)現(xiàn)整合表達(dá)。
[0008]所述具有耐乙酸的重組釀酒酵母菌(4126-YHB1)過表達(dá)黃素血紅蛋白YHBl基因，YHBl基因序列的GenBank登錄號為NC_001139。PGKl啟動子序列GenBank登錄號為FJ415226.1，CYCl終止子序列GenBank登錄號為EF210198.1。通過基因工程手段在酵母的 HO 整合載體(NCB1:#AF324728,美國 Utah 大學(xué) David J.Stillman 惠贈；Nucleic acidsresearch, 2001, 29:e59)的基礎(chǔ)上連接PGKl強(qiáng)啟動子和CYCl終止子構(gòu)成pHO組成型表達(dá)載體(Applied Energy, 2012, 110:33_40)。然后把PCR擴(kuò)增獲得的YHBl基因連接在PGKl啟動子和CYCl終止子之間，線性化后電轉(zhuǎn)導(dǎo)入工業(yè)釀酒酵母4126中，進(jìn)行插入基因的過表達(dá)。
[0009]本發(fā)明采用釀酒酵母的pHO組成型表達(dá)載體進(jìn)行重組菌株的整合表達(dá)，pHO載體可以通過同源重組的方式在釀酒酵母的HO位點(diǎn)進(jìn)行整合表達(dá)，該載體含有遺傳霉素G418抗性標(biāo)記可進(jìn)行篩選。
[0010]本發(fā)明的有益成果是:本發(fā)明的重組釀酒酵母4126-YHB1能在培養(yǎng)基中含有高濃度乙酸的條件下進(jìn)行快速高效的乙醇發(fā)酵，在進(jìn)行纖維素乙醇發(fā)酵時，可節(jié)省調(diào)整pH的步驟，直接在較低PH條件下和較高乙酸存在條件下進(jìn)行乙醇發(fā)酵。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1是YHBl基因片段的PCR擴(kuò)增。
[0012]圖2是載體的酶切驗(yàn)證。
[0013]圖3是重組酵母的PCR鑒定。
[0014]圖4是含空載體的對照酵母菌株4126-H0和重組釀酒酵母4126-YHB1在含有乙醇和乙酸的固體平板上的生長比較。
[0015]圖5是對照酵母4126-H0和重組釀酒酵母4126-YHB1在含有5g/L乙酸的液體培養(yǎng)基中的生長結(jié)果。
[0016]圖6是對照酵母4126-H0和重組釀酒酵母4126-YHB1在含有5g/L乙酸的液體培養(yǎng)基中的乙醇發(fā)酵結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1:過表達(dá)黃素血紅蛋白基因YHBl的重組釀酒酵母的構(gòu)建和轉(zhuǎn)化
[0018]本發(fā)明涉及的黃素血紅 蛋白基因YHBl序列來自于NCBI公共數(shù)據(jù)庫，該基因的GenBank登錄號為NC_001139?；虻膯幼佑肞GKl啟動子，用CYCl終止子作為終止子，通過酶切連接的方式在PGKl啟動子和CYCl終止子之間插入YHBl基因。然后通過酶切位點(diǎn)Not I把構(gòu)建的質(zhì)粒酶切成線性，轉(zhuǎn)化到工業(yè)釀酒酵母4126中表達(dá)。
[0019]1.1釀酒酵母基因組DNA提取
[0020](I)將過夜培養(yǎng)的酵母菌液離心，12000rpm, 2min,去上清；
[0021 ] (2)向沉淀加入480 μ L TE溶液(ρΗ8.0)，20 μ L溶菌酶(2mg/mL),震蕩混勻后放入37°C搖床1.5小時；
[0022](3)加入適量RNase A，再次放入37°C搖床0.5小時；
[0023](4)從搖床中拿出，加入50 μ L20%SDS溶液，5 μ L蛋白酶K (濃度為20 μ g/mL)混合震蕩，55°C水浴鍋中放置Ih以上；
[0024](5)離心將管蓋上附著的液體收集到管底；加入500yL苯酚:氯仿:乙戊醇(25:24:1)，震蕩混勻后，12000卬!11離心10分鐘，取上清液，轉(zhuǎn)新管；
[0025](6)加入等體積異丙醇，放入_20°C冰箱I小時以上，沉淀DNA ；
[0026](7)12000rpm離心10分鐘，去上清液,加入lmL70%乙醇,洗沉淀I一2次，12000rpm離心8分鐘，棄上清；
[0027](8) 37°C干燥后加入 TE (ρΗ8.0) 50 μ L 溶解 DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0028]1.2PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因條帶
[0029]以S.cerevisiae S288c基因組DNA作為模板擴(kuò)增基因YHB1。引物序列如下:
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一株具有乙酸耐受性的工業(yè)釀酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae),其特征在于:所述菌株的登記入冊編號為CGMCC N0.8725，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期為2014年I月15日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有乙酸耐受性的工業(yè)釀酒酵母菌株，其特征在于:所述菌株基因來源于實(shí)驗(yàn)室模式釀酒酵母S288c，將PCR擴(kuò)增得到的YHBl基因連接到pHO組成型整合表達(dá)載體，線性化后轉(zhuǎn)入`工業(yè)釀酒酵母，實(shí)現(xiàn)整合表達(dá)。
【文檔編號】C12R1/865GK103820347SQ201410102837
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月19日
【發(fā)明者】趙心清, 魏小文, 白鳳武 申請人:大連理工大學(xué)