豬細(xì)環(huán)病毒i型和ii型的雙重實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法
【專利摘要】本申請(qǐng)公開了一種豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型雙重檢測(cè)的引物及雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本申請(qǐng)為豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的雙重檢測(cè)提供了一種全新的檢測(cè)引物,該引物中包括了豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的特異性檢測(cè)引物,并且具有很強(qiáng)的靈敏度,能夠滿足豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的日常檢驗(yàn)檢疫需求;為豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的檢疫、流行病學(xué)調(diào)查,以及為生產(chǎn)中指導(dǎo)豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的檢測(cè)提供了技術(shù)幫助。
【專利說明】豬細(xì)環(huán)病毒I型和I I型的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本申請(qǐng)涉及分子檢測(cè)領(lǐng)域,特別是涉及一種豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】[0002]TTV是一種無包被的單股環(huán)狀負(fù)義的DNA病毒,由于最初是在肝炎患者中分離得到,猜測(cè)與肝炎有關(guān),受到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。豬源TTV的中文名字被定義為豬細(xì)環(huán)病毒(Torque Teno Sus Virus,TTSuV)。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn),TTV通過輸血、性行為、糞-口途徑等方式進(jìn)行傳播,同時(shí)血液、唾液、糞便、乳汁、膽汁均可帶毒,通過不同人群的TTV的感染率的研究結(jié)果顯示:一般人群的感染率多在10%以上,呈無癥狀攜帶。除了人可感染TTV以外,貓、狗、豬、牛、雞、羊、老鼠等動(dòng)物也是TTV的宿主。Okamota H等根據(jù)人TTV非編碼區(qū)的DNA序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增了豬、狗和貓血清中的TTV基因片段,發(fā)現(xiàn)在這幾個(gè)不同種屬中TTV基因序列和長(zhǎng)度差異極大,核酸同源性較小,具有物種專一性。美國學(xué)者Leary等應(yīng)用巢式PCR方法從豬血清中檢測(cè)到TTV (Sd-TTV31),基因組長(zhǎng)度為2878bp。2005年,Niel C等利用多重引導(dǎo)滾環(huán)式擴(kuò)增法(Multiply primed rolling-circle amplification, RCA)檢測(cè)到豬TTV的另一種亞型:Sd-TTV2p,基因組長(zhǎng)度為2735bp,與之前發(fā)現(xiàn)的Sd_TTV31的同源性非常低,只有45.1%,于是將TTSuV分為兩種基因型,TTSuVl型以Sd_TTV31為原型,TTSuV2型以Sd-TTV2p為原型。目前,統(tǒng)一的將TTSuVl型稱為豬細(xì)環(huán)病毒I型(簡(jiǎn)寫TTSuV
I),TTSuV2型稱為豬細(xì)環(huán)病毒II型(簡(jiǎn)寫TTSuV II)。
[0003]TTSuV和人TTV基因組結(jié)構(gòu)組成相似,由非編區(qū)(UTR)和編碼區(qū)兩部分組成,非編區(qū)由一個(gè)富含GC的區(qū)域、一個(gè)啟動(dòng)子和一個(gè)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子組成,兩末端的GC區(qū)域形成具莖環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu),在病毒復(fù)制中可能有重要調(diào)控作用;TTV編碼區(qū)包含3個(gè)開放閱讀框(0RF1~0RF3)、一個(gè)PolyA和一個(gè)TATA盒,變異率較高。ORFl的N端富含精氨酸(Arg)蛋白質(zhì),該蛋白質(zhì)有可能是復(fù)制相關(guān)的蛋白-Rep蛋白;0RF2編碼與復(fù)制相關(guān)的蛋白;0RF3編碼結(jié)合蛋白,分為兩段,其中隔著一個(gè)類似于真核生物編碼區(qū)中內(nèi)含子的序列。編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄時(shí)產(chǎn)生3種不同的mRNA,能翻譯表達(dá)6種不同的蛋白。兩種基因型TTV編碼蛋白具有相似的序列和功能。
[0004]國外已有許多相關(guān)報(bào)道,表明TTSuV的感染在全球分布很廣且其流行率很高。Segales等對(duì)西班牙豬場(chǎng)1985-2005年采集的162份豬血清進(jìn)行追溯性調(diào)查,結(jié)果在所有年份均檢出TTSuV病毒,TTSuVl和TTSuV2的感染率分別是33.3%(54/162)和55.6%(90/162),兩種基因型共感染率為23.5% (38/162),證實(shí)了 TTSuV的感染早在最初發(fā)現(xiàn)這病毒(Learyet al.,1999)的14年前就存在了。
[0005]近年來,國內(nèi)也陸續(xù)開展了對(duì)TTSuV感染情況的研究。這些研究顯示,TTSuV在豬群中的感染在國內(nèi)外已經(jīng)非常普遍,是一個(gè)不容忽視的新病原。而目前對(duì)TTSuV的了解還非常有限,綜合國內(nèi)外檢測(cè)TTSuV的方法主要有血清免疫學(xué)法和分子生物學(xué)法,血清免疫學(xué)法有酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法,ELISA是用于疫病檢測(cè)和監(jiān)控的常用方法,但由于TTSuV具有高度基因變異性,不同基因亞型抗體間存在交叉反應(yīng),用它對(duì)基因變異進(jìn)行分析時(shí)準(zhǔn)確率較低,不能完全反映體內(nèi)基因變異情況,更重要的是ELISA法的漏檢率較高。除此之外,由于感染時(shí)間較短而尚未產(chǎn)生抗體也可造成ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陰性。
[0006]目前用于TTSuV檢測(cè)的分子生物學(xué)方法主要有普通PCR、套式PCR、半套式PCR和滾環(huán)擴(kuò)增等方法。常規(guī)PCR和套式PCR方法均根據(jù)目前已知的TTSuV基因序列的最保守的非編碼區(qū)來設(shè)計(jì)引物,對(duì)核酸進(jìn)行檢測(cè)。滾環(huán)擴(kuò)增法是以任意的寡核苷酸作為引物,在恒溫下以滾環(huán)擴(kuò)增待測(cè)環(huán)狀DNA。由于血清中TTSuV病毒滴度較低,用普通PCR—輪難以擴(kuò)增出目的片段,需加大循環(huán)數(shù),但這樣會(huì)使引物非特異性結(jié)合或者聚合酶活性下降。巢氏PCR克服了單次擴(kuò)增“平臺(tái)期效應(yīng)”的限制且保證了反應(yīng)的特異性,但是需要進(jìn)行第二次PCRjI起交叉污染的幾率較大。普通PCR敏感性較差,巢氏PCR、半巢氏PCR和滾環(huán)擴(kuò)增耗時(shí)較長(zhǎng),且這些傳統(tǒng)的PCR技術(shù)只能對(duì)基因的檢測(cè)做定性分析,無法精確的定量所檢測(cè)出的基因數(shù)量,大大制約了 PCR技術(shù)的應(yīng)用。
[0007]Taqman熒光定量PCR是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)核酸檢測(cè)技術(shù),可以快速、敏感地檢測(cè)出核酸中的目的基因。采用引物和探針相結(jié)合,對(duì)基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,其特異性更強(qiáng),檢測(cè)更準(zhǔn)確。利用熒光信號(hào)與PCR產(chǎn)物的對(duì)應(yīng)關(guān)系來對(duì)檢測(cè)樣本進(jìn)行定性及定量分析,敏感性極高,可以檢測(cè)到幾個(gè)拷貝/μ L的病毒核酸。在檢測(cè)過程中熒光定量PCR方法無需進(jìn)行凝膠電泳,用儀器收集熒光進(jìn)行判斷結(jié)果,避免了人為主觀因素的影響。而且與常規(guī)PCR技術(shù)相比,其檢測(cè)速度更具有優(yōu)勢(shì),可以在4-6h內(nèi)完成。而目前針對(duì)用于檢測(cè)TTSuV的高通量、快速、靈敏的Taqman熒光定量PCR檢測(cè)方法的研究較少;遠(yuǎn)不能滿足檢驗(yàn)檢疫實(shí)踐應(yīng)用的需求。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本申請(qǐng)的目的是提供一種全新的用于豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的,本申請(qǐng)的一方面公開了一種用于豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的雙重檢測(cè)的引物,該引物包括第一引物對(duì)和第二引物對(duì),第一引物對(duì)的上游引物和下游引物分別含有Seq ID N0.1和Seq ID N0.2所示序列,第二引物對(duì)的上游引物和下游引物分別含有Seq ID N0.4和Seq ID N0.5所示序列;
[0010]Seq ID N0.1:5,-GGTTCAGGAGGCTCAATTTGG-3’
[0011]Seq ID N0.2:5’ -TTTGAATTTAACGGTTTTCAGTCTTC-3’
[0012]Seq ID N0.4:5,-TATCGGGCAGGCGGTAATC-3’
[0013]Seq ID N0.5:5’ -TACGCTACCGTCAGCCATCTTT-3’。
[0014]其中,第一引物對(duì)為檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒I型的引物對(duì),第二引物對(duì)為檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒II型的引物對(duì)。
[0015]本申請(qǐng)的另一面公開了一種用于豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的雙重檢測(cè)的探針,該探針包括第一探針和第二探針,第一探針含有Seq ID N0.3所示序列,第二探針含有Seq IDN0.6所示序列;
[0016]Seq ID N0.3:5,-TCGCTTCGCTCGCACCACGT-3,
[0017]Seq ID N0.6:5,-AACCGGGCCCCCCTCGATG-3,。[0018]其中,第一探針為檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒I型的探針,第二探針為檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒II型的探針。
[0019]優(yōu)選的,第一探針和第二探針的5’端都標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán),3’端都標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
[0020]更優(yōu)選的,第一探針的5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM,3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQl ;第二探針的5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX,3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQ1。
[0021]本申請(qǐng)的再一面還公開了一種豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,包括采用本申請(qǐng)的引物與本申請(qǐng)的帶熒光標(biāo)記的探針配對(duì)進(jìn)行Taqman熒光定量PCR檢測(cè)。
[0022]優(yōu)選的,第一引物對(duì)與第一探針配對(duì)用以檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒I型,第二引物對(duì)與第二探針配對(duì)用以檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒II型。[0023]本申請(qǐng)的再一面還公開了一種豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的雙重檢測(cè)的試劑盒,該試劑盒中含有本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)的引物。
[0024]優(yōu)選的,檢測(cè)試劑盒中還含有本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)的探針。
[0025]由于采用以上技術(shù)方案,本申請(qǐng)的有益效果在于:
[0026]本申請(qǐng)為豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的雙重檢測(cè)提供了一種全新的檢測(cè)引物,該引物中包括了豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的特異性檢測(cè)引物,并且具有很強(qiáng)的靈敏度,能夠滿足豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的日常檢驗(yàn)檢疫需求;為豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的檢疫、流行病學(xué)調(diào)查,以及為生產(chǎn)中指導(dǎo)豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的檢測(cè)提供了技術(shù)幫助。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1:是本申請(qǐng)實(shí)施例中巢式PCR電泳結(jié)果圖,其中A為樣品擴(kuò)增結(jié)果,B為克隆后的菌落PCR電泳結(jié)果;
[0028]圖2:是本申請(qǐng)實(shí)施例中提取質(zhì)粒的酶切結(jié)果圖;
[0029]圖3:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuVl標(biāo)準(zhǔn)品(10’退火溫度優(yōu)化結(jié)果;
[0030]圖4:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuVl標(biāo)準(zhǔn)品(I(T1-KTe)退火溫度優(yōu)化結(jié)果;
[0031]圖5:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuV2標(biāo)準(zhǔn)品(10’退火溫度優(yōu)化結(jié)果;
[0032]圖6:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuV2標(biāo)準(zhǔn)品(I(T1-KTe)退火溫度優(yōu)化結(jié)果;
[0033]圖7:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuVl實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果;
[0034]圖8:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuV2實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果;
[0035]圖9:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuVl實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度測(cè)試結(jié)果;
[0036]圖10:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuV2實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度測(cè)試結(jié)果;
[0037]圖11:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuVl標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線;
[0038]圖12:是本申請(qǐng)實(shí)施例中TTSuV2標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線;
[0039]圖13:是本申請(qǐng)實(shí)施例中雙重實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性結(jié)果;
[0040]圖14:是本申請(qǐng)實(shí)施例中雙重實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)TTSuVl的靈敏度檢測(cè);
[0041]圖15:是本申請(qǐng)實(shí)施例中雙重實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)TTSuV2的靈敏度檢測(cè);
[0042]圖16:是本申請(qǐng)實(shí)施例中雙重實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)TTSuVl標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線;
[0043]圖17:是本申請(qǐng)實(shí)施例中雙重實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)TTSuVl標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線;[0044]圖18:是本申請(qǐng)實(shí)施例中雙重實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)TTSuV2標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線;
[0045]圖19:是本申請(qǐng)實(shí)施例中雙重實(shí)時(shí)熒光PCR對(duì)TTSuV2標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0046]本申請(qǐng)以TTSuV不同基因型的保守序列為目的片段進(jìn)行研究,設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物及Taqman探針,最終獲得分別針對(duì)TTSuVl和TTSuV2的非編碼區(qū)(UTR)設(shè)計(jì)的特異性引物和Taqman探針,分別建立檢測(cè)TTSuVl和TTSuV2的單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。另外,考慮到臨床檢測(cè)的工作量和檢驗(yàn)檢疫業(yè)務(wù)快速準(zhǔn)確的要求,本申請(qǐng)?jiān)诮⒌膯沃貙?shí)時(shí)熒光PCR方法的基礎(chǔ)上,建立了同時(shí)檢測(cè)TTSuVl和TTSuV2雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法。
[0047]本申請(qǐng)?jiān)诂F(xiàn)有研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究,從而獲得了一對(duì)全新的檢測(cè)引物和探針,為豬細(xì)環(huán)病毒I型和豬細(xì)環(huán)病毒II型的檢測(cè)提供了一種新的方案,從而提高了檢驗(yàn)檢疫的質(zhì)量和工作效率,對(duì)檢驗(yàn)檢疫和實(shí)踐生產(chǎn)都具有重要的意義。需要說明的是,本申請(qǐng)的引物和探針都是針對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)而設(shè)計(jì)的,具體的是特別針對(duì)雙重實(shí)時(shí)熒光PCR方法而設(shè)計(jì)的;因此,本申請(qǐng)的引物和探針都具有很好的特異性??梢岳斫猓诒旧暾?qǐng)的基礎(chǔ)上,完全可以單獨(dú)將本申請(qǐng)的引物直接用于常規(guī)PCR檢測(cè)或者其它基于PCR擴(kuò)增的檢測(cè);同樣的,本申請(qǐng)的探針也完全可以用于除了本申請(qǐng)的實(shí)時(shí)熒光PCR方法的其它檢測(cè)中,比如基因芯片檢測(cè),或者其它基于核苷酸片段的檢測(cè)。其中,基于PCR擴(kuò)增的檢測(cè)如基因芯片的靶標(biāo)片段擴(kuò)增、克隆、測(cè)序等。特別是在基因芯片檢測(cè)中,完全可以采用本申請(qǐng)的引物進(jìn)行雙重?cái)U(kuò)增,然后采用本申請(qǐng)的探針檢測(cè)TTSuVl和TTSuV2。
[0048]還需要說明的是,將本申請(qǐng)的探針用于實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)時(shí),根據(jù)探針法實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的原理,探針的5’端需要標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán),3’端需要標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán),可以理解,在雙重或多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)中,現(xiàn)有的熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)是可以隨意組合的,只要選擇的熒光基團(tuán)之間沒有相互干擾即可。另外,本申請(qǐng)的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法中,其關(guān)鍵在于采用了本申請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)的引物和探針,可以理解,檢測(cè)樣品可以是培養(yǎng)提純的病毒樣品、提取自疑似感染的生物的組織或分泌物的樣品或通過其它方式提取或保存的樣品。
[0049]在本申請(qǐng)的引物、探針和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上,本申請(qǐng)進(jìn)一步研究了用于檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的檢測(cè)試劑盒??梢岳斫?,直接將本申請(qǐng)的引物或探針制備成干粉或者高濃度的溶液即可作為試劑盒組分保存?zhèn)溆?。另外,如前面所提到的,本申?qǐng)的引物或者探針都是可以單獨(dú)的用于其它的檢測(cè)使用,因此,試劑盒中同樣可以只含有引物或探針;此外,對(duì)于涉及到的常規(guī)PCR檢測(cè)或?qū)崟r(shí)熒光PCR檢測(cè)等所需要的試劑,可以直接放置于本申請(qǐng)的試劑盒中,也可以在使用試劑盒時(shí),從市場(chǎng)購買相應(yīng)的試劑,在本申請(qǐng)中不做具體限定。
[0050]下面通過具體實(shí)施例并結(jié)合附圖對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實(shí)施例僅僅對(duì)本申請(qǐng)進(jìn)行進(jìn)一步的說明,不應(yīng)理解為對(duì)本申請(qǐng)的限制。
[0051]實(shí)施例一單重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)
[0052]一、試驗(yàn)材料和設(shè)備
[0053]1.主要試劑和試驗(yàn)儀器
[0054]MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit 購自 Roche。Premix ExTaqTM (Perfect Real Time)、Premix Ex Taq、Ex Taq > dNTP Mixture、2XGC buffer 1、DNA Marker DL2000、DNA Marker DL5000、凝膠 DNA 回收試劑盒、pMD18_T Vector、質(zhì)粒DNA小量純化試劑盒等購于大連寶生物公司。Jml09大腸桿菌、IPTG、X-Gal、甘油、NaCl均為分析純,購自上海生工。Ampicillin、CaC12購自Sigma。瓊脂糖購自Promega。胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉等購自廣東環(huán)凱微生物科技公司。膠紅購自Biotium。本實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器包括:Bio Rad實(shí)時(shí)突光PCR儀CFX96Real_time System、Eppendorf的梯度PCR AG22331Hamburg、Roche 自動(dòng)核酸提取儀 MagNA Pure LC2.0、Thermo 核酸蛋白紫外分析儀 NAN0DR0P1000、Haier 生物安全柜 HR40-1I A2、Eppendorf 離心機(jī) centrifuge5415R、Infors恒溫?fù)u床S-OOOl 13769Ecotron、SANYO恒溫培養(yǎng)箱MIR-162、北京六一廠的電泳儀ESP601 和電泳槽 DYCP31DN、Eppendorf 孵育器 Thermomixer compact、Genegenius 凝膠成像系統(tǒng)SYDR2/2144、北京賽多利斯的電子天平ALC-201.3、SANYO高壓滅菌鍋MLS-3780、IKA 渦旋混合儀器MS3basic ;Eppendorf 微量移液器包括:0.5-10 μ L、2-20 μ L、10-100 μ L、20-200 μ L、100-1000 μ L。[0055]2.溶液和培養(yǎng)基的配制
[0056]LB 培養(yǎng)基:稱蛋白腺(Tryptone) IOg,酵母提取物(Yeast extract) 5g, NaCllOg,溶于800mL去離子水中,用NaOH調(diào)pH至7.0,加去離子水至總體積1L,高壓蒸氣滅菌20min。4°C保存。固體培養(yǎng)基還需要加質(zhì)量份數(shù)1.5%的瓊脂。氨芐青霉素(Ampicillin)母液:配成lOOmg/mL水溶液,_20°C保存?zhèn)溆?。IPTG:在蒸餾水中溶解IPTG,配制成24mg/mL的貯存液,用0.22μπι過濾器除菌,用I mL EP管分裝,貯存于lOt^X-gal:用二甲基甲酰胺溶解X-gal,配制成20mg/mL的貯存液。保存于避光的EP管中,并貯存于_20°C。LB/Amp/X-Gal/IPTG平板培養(yǎng)基:稱取蛋白胨(Tryptone) IOg,酵母提取物(Yeast extract) 5g, NaCllOg,溶于800mL去離子水中,用NaOH調(diào)pH至7.0,加入15g瓊脂粉,高溫高壓滅菌后,冷卻至60°C左右。加入 ImL Ampicillin(100mg/mL)、ImL IPTG(24mg/mL)、2ml X-Gal (20mg/mL)后均勻混合,倒平板,30~35mL培養(yǎng)基/90mm培養(yǎng)皿,4°C避光保存。LB/Amp液體培養(yǎng)基:稱取酵母提取物(Yeast extract) 5g, NaClIOg,溶于800mL去離子水中,用NaOH調(diào)pH至7.0,加去離子水至總體積1L,高壓下蒸氣滅菌20min。冷卻至室溫,加入ImL Ampicillin (IOOmg/mL)后均勻混合,4°C保存。如果是固體培養(yǎng)基還需要加質(zhì)量份數(shù)1.5%的瓊脂。
[0057]3.試驗(yàn)樣本
[0058]本試驗(yàn)樣本均來自2011年第三季度江西地區(qū)各豬場(chǎng)采集的220個(gè)豬血清樣本。特異性實(shí)驗(yàn)所需的病毒包括:豬偽狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)、豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovlirus, PPV)、豬圓環(huán)病毒 2 型(Porcinecircovirus type2, PCV2)均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。
[0059]二、試驗(yàn)方法
[0060]1.豬TTSuVl和TTSuV2陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0061]TTSuV作為一種新發(fā)現(xiàn)的病毒,目前還沒有一種成熟的分離培養(yǎng)方法,所以在本實(shí)驗(yàn)中先用巢式PCR擴(kuò)增包含有TTSuV Taqman rt_PCR擴(kuò)增基因的片段,然后將這段基因連接到T載體中,構(gòu)建陽性的重組質(zhì)粒,作為TTSuV Taqman rt-PCR的陽性標(biāo)準(zhǔn)品。
[0062](I)樣品核酸提取
[0063]用Roche MagNA Pure LC2.0自動(dòng)核酸提取儀提取全基因組核酸。每個(gè)樣品取140 μ L 血清,按 MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit 說明操作,最后用100 μ L elution buffer 溶解 DNA,保存于 _20°C凍存?zhèn)溆谩?br>
[0064](2)巢式PCR擴(kuò)增
[0065]參考Kekarainen T報(bào)道的引物序列進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增,分別擴(kuò)增TTSuVl和TTSuV2部分片段,擴(kuò)增片段包含有TTSuV的高度保守的非編碼區(qū)。S1、S2為擴(kuò)增TTSuVl的外引物,S3、S4為擴(kuò)增TTVSul的內(nèi)引物;T1、Τ2為擴(kuò)增TTSuV2的外引物,T3、T4為擴(kuò)增TTSuV2的內(nèi)引物。引物委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列及相關(guān)信息見表
1
[0066]Kekarainen T 的報(bào)道具體參見:Kekarainen T, Sibila M, SegalesJ.Prevalence of swine Torque teno virus in post-weaning multisystemicwasting syndrome (PMWS)-affected and non-PMWS2affected pigs in Spain[J].J GenVirol, 2006, 87:833-837。
[0067]表1巢式PCR擴(kuò)增弓丨物
[0068]
【權(quán)利要求】
1.一種用于豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的雙重檢測(cè)的引物,其特征在于:所述引物包括第一引物對(duì)和第二引物對(duì),所述第一引物對(duì)的上游引物和下游引物分別含有Seq ID N0.1和Seq ID N0.2所述序列,所述第二引物對(duì)的上游引物和下游引物分別含有Seq ID N0.4和Seq ID N0.5所述序列;
Seq ID N0.1:5’ -GGTTCAGGAGGCTCAATTTGG-3’
Seq ID N0.2:5’ -TTTGAATTTAACGGTTTTCAGTCTTC-3’
Seq ID N0.4:5’ -TATCGGGCAGGCGGTAATC-3’
Seq ID N0.5:5’ -TACGCTACCGTCAGCCATCTTT-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物,其特征在于:所述第一引物對(duì)為檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒I型的引物對(duì),所述第二引物對(duì)為檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒II型的引物對(duì)。
3.一種用于豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的雙重檢測(cè)的探針,其特征在于:所述探針包括第一探針和第二探針,所述第一探針含有Seq ID N0.3所示序列,所述第二探針含有Seq IDN0.6所示序列;
Seq ID N0.3:5,-TCGCTTCGCTCGCACCACGT-3,
Seq ID N0.6:5,-AACCGGGCCCCCCTCGATG-3,。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的探針,其特征在于:所述第一探針為檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒I型的探針,所述第二探針為檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒II型的探針。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的探針,其特征在于:所述第一探針和第二探針的5’端都標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán),3’端都標(biāo)記有熒光淬`滅基團(tuán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的探針,其特征在于:所述第一探針的5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM,3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQl ;所述第二探針的5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為HEX,3’端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQl。
7.一種豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,包括采用權(quán)利要求1或2所述的引物與權(quán)利要求5或6所述的探針配對(duì)進(jìn)行Taqman熒光定量PCR檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法,其特征在于:所述第一引物對(duì)與所述第一探針配對(duì)用以檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒I型,所述第二引物對(duì)與所述第二探針配對(duì)用以檢測(cè)豬細(xì)環(huán)病毒II型。
9.一種豬細(xì)環(huán)病毒I型和II型的雙重檢測(cè)的試劑盒,其特征在于:所述試劑盒中含有權(quán)利要求1或2所述的引物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒,其特征在于:所述檢測(cè)試劑盒中還含有權(quán)利要求3-6任一項(xiàng)所述的探針。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103882149SQ201410105912
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】楊春華, 孫思揚(yáng), 胡婷, 石磊 申請(qǐng)人:江西出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫綜合技術(shù)中心