綠色熒光蛋白標(biāo)記的椰子莖瀉血病菌原生質(zhì)體的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子植物病理學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種綠色熒光蛋白標(biāo)記的椰子莖瀉血病菌原生質(zhì)體的制備方法。本發(fā)明確定了形成原生質(zhì)體的合適條件，選擇以1mol/L的甘露醇為穩(wěn)滲劑，以7.5mg/mL的崩潰酶為裂解酶，制備高質(zhì)量的原生質(zhì)體，并將GFP轉(zhuǎn)入到椰子莖瀉血病菌，獲得穩(wěn)定遺傳的GFP病原菌菌株，為該病菌的GFP轉(zhuǎn)化、基因表達(dá)等遺傳操作夯實(shí)基礎(chǔ)，且節(jié)約成本，并能大大提高工作效率，縮短研究時(shí)間。同時(shí)，綠色熒光蛋白標(biāo)記后的椰子莖瀉血病菌便于該病害進(jìn)行組織病理學(xué)和病害流行學(xué)等方面的研究。
【專利說明】綠色熒光蛋白標(biāo)記的椰子莖瀉血病菌原生質(zhì)體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子植物病理學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種綠色熒光蛋白標(biāo)記的椰子莖瀉血病菌原生質(zhì)體的制備方法。
【背景技術(shù)】
椰子莖丨寫血病(coconut stem bleeding disease)在我國尤其在海南發(fā)生越來越嚴(yán)重，在瓊海，萬寧，屯昌一帶發(fā)病率有逐年上升的趨勢。該病主要危害椰子莖基部，在病灶部位有鐵銹狀液體流出，嚴(yán)重影響觀賞價(jià)值，最終導(dǎo)致植物死亡；也危害果實(shí)，使果實(shí)變黑脫落，使得椰果產(chǎn)量嚴(yán)重降低，給海南人民帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。其病原是奇異長喙殼菌iCeratocystis parat/iora)的無性世代奇異根串珠霉菌(?ie7aKiparadoxa )。
[0002]綠色突光蛋白(Green Fluorescent Protein,簡稱GFP)是1962年在美國西海岸所盛產(chǎn)的水母中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，它不僅無毒，而且不必借助其他輔酶就能自身發(fā)光，標(biāo)記了 GFP，就可以在分子水平上研究活細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程。
[0003]將GFP轉(zhuǎn)入到椰子莖瀉血病菌，獲得穩(wěn)定遺傳的GFP病原菌菌株，為進(jìn)一步研究該病原菌的侵染方式、擴(kuò)展過程、傳播途徑等提供了保障，為該病害的防治奠定了基礎(chǔ)。
[0004]原生質(zhì)體的制備是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的前提和關(guān)鍵，對病菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，構(gòu)建病菌的突變體，是探討致病機(jī)制，克隆致病基因，尋找控制該病害的有效途徑。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法與根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化(REMI)、電擊轉(zhuǎn)化、限制性內(nèi)切酶轉(zhuǎn)化(ATMT)、基因槍法相比，不受限于昂貴的儀器設(shè)備 ，只需簡單常規(guī)的儀器，操作簡便易行。由于不同種、屬真菌細(xì)胞壁的組分差異，因此酶解細(xì)胞壁的酶、所用酶量、菌絲的培養(yǎng)時(shí)間、所需穩(wěn)滲劑等不盡相同，制備高質(zhì)量的原生質(zhì)體可以提高轉(zhuǎn)化效率與實(shí)驗(yàn)成功率的保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種綠色熒光蛋白標(biāo)記的椰子莖瀉血病菌原生質(zhì)體的制備方法，為該病菌的GFP轉(zhuǎn)化、基因表達(dá)等遺傳操作夯實(shí)基礎(chǔ)，且節(jié)約成本，并能大大提高工作效率，縮短研究時(shí)間。
[0006]本發(fā)明采取的技術(shù)方案包括以下步驟:
步驟一:將椰子莖瀉血病菌菌塊接種到CM培養(yǎng)基上26°C培養(yǎng)24h，然后研磨菌絲接種到液體酵母淀粉培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120rpm，26°C培養(yǎng)36h，用滅菌的微細(xì)絨布過濾菌絲，然后用無菌水沖洗菌絲，再用lmol/L的甘露醇充分洗滌，用滅菌濾紙吸干水分；
步驟二:用已滅菌三角瓶盛裝已過濾除菌的7.5mg/mL崩潰酶液IOmL和1.0g步驟一中洗滌并吸干的菌絲，用槍頭輕輕吸打吹散均勻，將該三角瓶放入31°C恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)I小時(shí)_4h，轉(zhuǎn)速90rpm，結(jié)束后，用三層滅菌的微細(xì)絨布過濾菌液于離心管中，轉(zhuǎn)速4000rpm、4°C、離心IOmin,棄上清，用20mLSTC輕輕吸打混勻，進(jìn)行二次離心，棄上清，以lmL-3mLSTC溶解即可得到6.15X 108_3.05 X IO9個(gè)/mL的原生質(zhì)體懸液，再加入10%的DMS0,分裝，150yL /管，置于_80°C冰箱保存；其中所述崩潰酶液以lmol/L的甘露醇配制；
步驟三:取2 μ g綠色熒光蛋白pCT74-sGFP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入步驟二 150 μ L原生質(zhì)離心管中，輕輕彈勻，靜止30min，力卩600 μ L PTC混勻，靜止20min，加入6mL TB3溶液，于26°C、90rpm復(fù)蘇12h，然后將復(fù)蘇液倒入100mL、45~55°C含40-100 μ g/ml潮霉素B的TB3固體培養(yǎng)基中混勻，26°C倒置培養(yǎng)3-4天，連續(xù)轉(zhuǎn)接3代到含40-100 μ g/ml潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上篩選性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，再連續(xù)培養(yǎng)4代在無潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上以確保其遺傳穩(wěn)定性，即獲得了具有綠色熒光蛋白標(biāo)記的椰子莖瀉血病菌菌株；
以上試劑及培養(yǎng)基配制如下:(I)液體酵母淀粉培養(yǎng)基:酵母粉2 g/L，可溶性淀粉10g/L，蔗糖 3g/L ；(2) STC:1.2M 山梨醇，50mM Tris-Cl, ρΗ8.0, 50mM CaCL2 ；(3)PTC:40% 聚乙二醇 3350，1.2M 山梨醇，50mM Tris_Cl、pH8.0, 50mM CaCL2 ； (4) TB3 溶液即 TB3 培養(yǎng)基:蔗糖200 g/L，酸水解酪蛋白6 g/L，酵母提取物6 g/L ；TB3固體培養(yǎng)基:含1.5%瓊脂粉的TB3培養(yǎng)基。
[0007]本發(fā)明一種椰子莖瀉血病菌的原生質(zhì)體的制備方法，其意義在于:確定了適宜原生質(zhì)體形成的條件，為椰子莖瀉血病菌原生體轉(zhuǎn)化，基因表達(dá)等遺傳操作奠定了基礎(chǔ)，且大大縮短了研究時(shí)間，提高了工作效率。同時(shí)，綠色熒光蛋白標(biāo)記后的椰子莖瀉血病菌便于該病害進(jìn)行組織病理學(xué)和病害流行學(xué)等方面的研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為以甘露醇為穩(wěn)滲劑，以崩潰酶液裂解I小時(shí)30min后椰子瀉血病菌原生質(zhì)體在20 X物鏡下的效果圖。
[0009]圖2為PCR驗(yàn)證 圖，其中1-8代表8個(gè)轉(zhuǎn)化子，9為陰性對照(以椰子瀉血病菌野生菌株DNA進(jìn)行擴(kuò)增)，10為陽性對照(以pCT74-sGFP質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增)，所用引物為ToxAsGFPF: 5’ TGGAATCCATGGAGGAGTTC 3’ ； ToxAsGFPR: 5’ CTTGTACAGCTCGTCCATGC3，。
[0010]圖3為帶有GFP熒光蛋白標(biāo)記的菌株熒光效果圖，椰子瀉血病菌的菌絲和孢子被標(biāo)記為綠色。
【具體實(shí)施方式】
[0011]為了進(jìn)一步闡述該發(fā)明一種椰子莖瀉血病菌原生質(zhì)體的制備方法，舉例如下 實(shí)施例一
I病原菌對潮霉素B的抗性檢測
設(shè)潮霉素 B 的濃度分別 SlOyg /mL, 20 μ g/mL, 30 μ g /mL, 40 μ g /mL, 50 μ g /mL, 100 μ g /mL, 150 μ g /mL,每9cm培養(yǎng)皿倒入IOmLCM培養(yǎng)基(鹿糖10 g/L,酸水解酪蛋白6 g/L，酵母提取物6 g/L,瓊脂粉15 g/L)，分別加入原始濃度為lg/20mL的潮霉素B
2μ L, 4 μ L, 6 μ L, 8 μ L, 10 μ L, 20 μ L, 30 μ L,三次重復(fù)，接種菌絲塊于皿中央，封口倒置于26°C培養(yǎng)箱。每天觀察菌落長勢，5天后測量菌落直徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，病菌在40 μ g/mL的潮霉素B平板上完全不能生長，低于這個(gè)濃度時(shí)也只有慢速稀薄生長。因此，用于椰子莖瀉血病菌轉(zhuǎn)化時(shí)所用到選擇培養(yǎng)基中潮霉素B的濃度40-100 μ g/mL。
[0012]2制備原生質(zhì)體的菌源準(zhǔn)備從生長5天的菌落平板上，切一小菌塊接種到CM培養(yǎng)基上，26°C培養(yǎng)24h，備用。
[0013]3實(shí)驗(yàn)試劑
所選用的溶壁酶(Lysing Enzymes)和崩潰酶(Drislase),購自SIGMA公司。設(shè)三個(gè)酶組合，分別是單獨(dú)使用溶壁酶、崩潰酶及同時(shí)使用溶壁酶和崩潰酶。設(shè)置濃度梯度為2.5 mg/mL, 5.0mg/mL, 7.5 mg/mL, 10 mg/mL的酶液,其中兩酶同加時(shí)等量配置。酶液用不同滲透劑配置，所選滲透壓穩(wěn)定劑有5種,分別lmol/L甘露醇(Manitol)，lmol/L山梨醇(Sorbitol)，0.7mol/L NaCl, 0.7mol/L KCL, 0.7mol/L MgSO4.7H20。
[0014]原生質(zhì)體的制備過程
步驟一:研磨幼嫩病原菌絲接種到液體酵母淀粉培養(yǎng)基(酵母粉2 g/L，可溶性淀粉10g/L，蔗糖3g/L)震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120rpm，26°C培養(yǎng)36h。用滅菌的微細(xì)絨布(Microcloth)過濾菌絲，然后用無菌水沖洗菌絲，再用lmol/L的甘露醇充分洗滌，用滅菌濾紙吸干水分。
[0015]步驟二:用已滅菌的50mL三角瓶盛裝已過濾除菌的的7.5mg/mL崩潰酶液(以lmol/L的Manitol配制)IOmL,取1.0g步驟一中洗漆并吸干的菌絲,用槍頭輕輕吸打吹散均勻，將該三角瓶放入31°C恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)I小時(shí)，轉(zhuǎn)速90rpm。結(jié)束后，用三層滅菌Microcloth過濾菌液于50mL尖底離心管中，轉(zhuǎn)速4000rpm, 4°C,離心IOmin,棄上清,用20mLSTC (1.2M山梨醇，50mM Tris-Cl, pH8.0, 50mM CaCL2)輕輕吸打混勻，仍于上述轉(zhuǎn)速，溫度，時(shí)間進(jìn)行二次離心，棄上清，以3mLSTC溶解即可得到3.05 X IO9個(gè)/mL的原生質(zhì)體，再加入10%的DMS0，分裝，150 μ L /管，置于_80°C冰箱長期保存。
[0016]步驟三:
取2yg綠色熒光蛋白？074-$--質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入15(^1^原生質(zhì)離心管中，輕輕彈勻，靜止 30min,加 1200 μ L PTC (40% 聚乙二醇 3350，1.2Μ 山梨醇，50mM Tris-Cl, pH8.0, 50mMCaCL2)混勻，靜止20min,轉(zhuǎn)入50mL離心管中，加入6mL TB3溶液于26°C, 90rpm,復(fù)蘇12h。然后將復(fù)蘇液倒入IOOmL 50°C左右含有160 μ L潮霉素B (lg/20mL)的TB3固體培養(yǎng)基中混勻，倒入直徑15cm的培養(yǎng)皿中，冷凝，封口。26°C倒置3_4天，待轉(zhuǎn)化子長出連續(xù)轉(zhuǎn)接3代到含有160 μ L潮霉素B (lg/20mL)的PDA上篩選性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，再連續(xù)培養(yǎng)4代在無潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上以確保其遺傳穩(wěn)定性，即獲得了具有綠色熒光蛋白標(biāo)記的椰子莖瀉血病菌菌株，菌絲及孢子都具會(huì)發(fā)出綠色熒光如圖3所示。
[0017]為了進(jìn)一步驗(yàn)證，椰子莖瀉血病菌株里確實(shí)已經(jīng)插入了 GFP基因，根據(jù)TOX-A-GFP序列設(shè)計(jì)特異引物，對具有熒光的8個(gè)轉(zhuǎn)化子提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以質(zhì)粒pCT74-sGFPPCR為陽性對照，以未轉(zhuǎn)入GFP的菌株DNA為陰性對照，得到與陽性對照大小一致的條帶即表明確已轉(zhuǎn)入了 GFP基因，如圖2所示。
[0018]以下僅對實(shí)施過程中的相異處進(jìn)行說明，重復(fù)部分不再贅述。
[0019]實(shí)施例二
本實(shí)施與實(shí)施例一相比的相異之處在于:在步驟一中用滅菌的0.7mol/LMgS04.7H20溶液充分洗滌菌絲；步驟二中震蕩培養(yǎng)時(shí)間為I小時(shí)30min，以MgSO4.7H20為穩(wěn)滲劑，以溶壁酶(Lysing Enzymes)和崩潰酶(Drislase)為裂解酶時(shí),各酶量均為7.5mg/mL時(shí),二次離心獲得的原生質(zhì)體的濃度是1.81 X IO9個(gè)/mL。
[0020]實(shí)施例三
本實(shí)施例與實(shí)施例一的不同點(diǎn)是:在步驟一分別以lmol/L山梨醇(Sorbitol)，.0.7mol/L NaCl充分洗滌菌絲；步驟二中震蕩培養(yǎng)的時(shí)間是4h，以NaCL為穩(wěn)滲劑，以IOmg/mL的溶壁酶(Lysing Enzymes)和崩潰酶(Drislase)為裂解酶時(shí),二次離心可獲得原生質(zhì)體的濃度是6.15X IO8個(gè)/mL ;若步驟二中以山梨醇(Sorbitol)為滲透劑，以溶壁酶IOmg/mL (Lysing Enzymes)為裂解酶時(shí),二次離心可獲得1.73X IO9個(gè)/mL的原生質(zhì)體。綜上所述，本發(fā)明確定了形成原生質(zhì)體的合適條件，且穩(wěn)滲劑和酶可以選擇。綜合時(shí)效和節(jié)約的原貝U，選擇以lmol/L的甘露醇為穩(wěn)滲劑，以7.5mg/mL的崩潰酶為裂解酶最好。表現(xiàn)為原生質(zhì)體的得率最高，且用時(shí)最短。而在原生質(zhì)體再生率方面，上述三個(gè)實(shí)施案例差異不大。此發(fā)明為椰子莖瀉血病菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、致病性缺陷突變體的篩選等提供了可靠的來源，為菌種改良、有用基因克隆或基因的功能研究提供了重要途徑，且顯著地縮短了研究時(shí)間，提高了轉(zhuǎn)化效率。
【權(quán)利要求】
1.一種綠色熒光蛋白標(biāo)記的椰子莖瀉血病菌原生質(zhì)體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:將椰子莖瀉血病菌菌塊接種到CM培養(yǎng)基上26°C培養(yǎng)24h，然后研磨菌絲接種到液體酵母淀粉培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速120rpm，26°C培養(yǎng)36h，用滅菌的微細(xì)絨布過濾菌絲，然后用無菌水沖洗菌絲，再用lmol/L的甘露醇充分洗滌，用滅菌濾紙吸干水分； 步驟二:用已滅菌三角瓶盛裝已過濾除菌的7.5mg/mL崩潰酶液IOmL和1.0g步驟一中洗滌并吸干的菌絲，用槍頭輕輕吸打吹散均勻，將該三角瓶放入31°C恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)I小時(shí)_4h，轉(zhuǎn)速90rpm，結(jié)束后，用三層滅菌的微細(xì)絨布過濾菌液于離心管中，轉(zhuǎn)速4000rpm、4°C、離心IOmin,棄上清，用20mLSTC輕輕吸打混勻，進(jìn)行二次離心，棄上清，以lmL-3mLSTC溶解即可得到6.15X 108_3.05 X IO9個(gè)/mL的原生質(zhì)體懸液，再加入10%的DMS0,分裝，150yL /管，置于_80°C冰箱保存；其中所述崩潰酶液以lmol/L的甘露醇配制； 步驟三:取2yg綠色熒光蛋白pCT74-sGFP質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入步驟二 150 μ L原生質(zhì)離心管中，輕輕彈勻，靜止30min，加600 μ L PTC混勻，靜止20min，加入6mL TB3溶液，于26°C、90rpm復(fù)蘇12h，然后將復(fù)蘇液倒入100mL、45~55°C含40-100 μ g/ml潮霉素B的TB3固體培養(yǎng)基中混勻，26°C倒置培養(yǎng)3-4天，連續(xù)轉(zhuǎn)接3代到含40-100 μ g/ml潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上篩選性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，再連續(xù)培養(yǎng)4代在無潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上以確保其遺傳穩(wěn)定性，即獲得了具有綠色熒光蛋白標(biāo)記的椰子莖瀉血病菌菌株； 以上試劑及培養(yǎng)基配制如下:(I)液體酵母淀粉培養(yǎng)基:酵母粉2 g/L，可溶性淀粉10g/L，蔗糖 3g/L ；(2) STC:1.2M 山梨醇，50mM Tris-Cl, ρΗ8.0, 50mM CaCL2 ；(3)PTC:40% 聚乙二醇 3350，1.2M 山梨醇，50mM Tris_Cl、pH8.0, 50mM CaCL2 ； (4) TB3 溶液即 TB3 培養(yǎng)基:蔗糖200 g/L，酸水 解酪蛋白6 g/L，酵母提取物6 g/L ；TB3固體培養(yǎng)基:含1.5%瓊脂粉的TB3培養(yǎng)基。
【文檔編號】C12N15/80GK103834581SQ201410106745
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】魯國東, 牛曉慶, 王宗華, 余鳳玉, 李亞, 鄭華偉, 朱輝, 宋薇薇, 唐慶華 申請人:福建農(nóng)林大學(xué), 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所