一種基因單堿基變異的cras-pcr檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基因單堿基變異的CRAS-PCR檢測方法。在該檢測方法中，同時使用了能夠特異性識別單堿基變異野生型和突變型核酸序列的單鏈型或雙鏈型等位基因特異性蝎形引物，以及等位基因特異性蝎形引物的共用引用。通過分析PCR擴增過程中各個競爭性等位基因特異性蝎形引物所產(chǎn)生的熒光信號種類與強度，可在單個PCR反應管內定性和定量檢測單堿基變異的不同基因型，檢測結果準確可靠，并且具有良好的線性范圍和靈敏度，無非特異性擴增所導致的假陽性結果，也能完全避免假陰性結果。
【專利說明】—種基因單堿基變異的CRAS-PCR檢測方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬生命科學和生物【技術領域】，是一種基因單堿基變異(即:基因型)的檢測方法，可以對基因的單核苷酸多態(tài)性和單堿基突變等基因型進行準確檢測。

【背景技術】
[0002]單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotide polymorphisms, SNP)是指基因組 DNA 序列中某個特定堿基發(fā)生了轉換、顛換、缺失和插入等變化而引起的序列多態(tài)性，而且，任何一種等位基因的群體頻率不小于1%。SNP在人類基因組中分布廣泛，并且，某些SNP可直接影響蛋白質功能和遺傳穩(wěn)定性等。對基因組SNP的分析是研究個體、系譜和人種特征、疾病風險預測和預防、多種疾病個體化治療的重要線索。據(jù)估計，大約有15個SNP分子標記被用于基因功能及疾病相關性的關聯(lián)研究。2001個，SNP協(xié)會(The SNP Consortium)構建了 1.42xl06個SNP、密度達到I個SNP/1.9kb的人類遺傳圖譜，這對開展致病基因的定位和人類起源與進化研究非常重要?；螯c突變(genetic point mutat1ns)是指基因組DNA序列中某個特定堿基突然發(fā)生的、可遺傳的變異現(xiàn)象。從分子水平上看，基因點突變同樣包括某個特定堿基的轉換、顛換、缺失和插入等變化?；螂m然穩(wěn)定，能在細胞分裂時精確地復制自己，但這種穩(wěn)定性是相對的，在一定條件下的基因也可從原來存在的形式突變改變成另一種新的存在形式，就是在一個位點上，突然出現(xiàn)了一個新基因，代替了原有基因，這種基因叫做突變基因，于是后代的表現(xiàn)中也就突然地出現(xiàn)在祖先從未有的新性狀。SNP與基因點突變的區(qū)別在于:多態(tài)性是一個群體性概念，多態(tài)性在群體中的頻率不小于1%，否則就叫突變(小于1%) ;SNP是多態(tài)性中的一種，只是進一步限定了差異是單堿基；一般來說，SNP是全部體細胞一樣的基因型，而基因突變則往往只是部分體細胞或少量體細胞的變化；如果突變發(fā)生在生殖細胞，則可以遺傳，但是，只要這個突變群沒有達到總群體的1%，它就只是一個突變株/系，達到1%就是多態(tài)性了?？梢?，SNP和基因點突變均是基因組DNA特定堿基發(fā)生了轉換、顛換、缺失和插入等變化，二者在基因組DNA序列的變化上具有共性，只是二者在群體中具有不同的發(fā)生頻率，前者不小于1%，后者則小于1%。正是由于SNP和基因點突變在序列變化上的相似性，因此，SNP和基因點突變統(tǒng)稱為基因變異(geneticvariat1ns)或基因單喊基變異(genetic single-base variat1ns)。但是，在文獻報道中，SNP也往往被部分研究者稱之為基因突變。SNP及基因點突變等基因單堿基變異與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后相關，目前，上述基因單堿基變異的檢測已經(jīng)廣泛應用于疾病預防和預測、個體化治療、預后判斷等生命科學的多個領域，在上述應用領域中，基因單堿基變異檢測技術的方法學特征，如準確度、特異性、靈敏度和線性范圍等方法學參數(shù)直接決定其臨床實際應用價值。
[0003]目前，基因單堿基變異檢測的基本方法已多達20余種，根據(jù)其基本檢測原理，可分為DNA鏈構象分析、限制性內切酶片段分析、等位基因特異性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)、核酸測序、生物芯片與生物傳感器等技術。上述各種檢測原理均演變出多種方法，每種方法均具有各自的優(yōu)缺點。例如，基于DNA鏈構象變化的單鏈構象多態(tài)性(PCR-SSCP)和變性高效能液相層析(Denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)等方法的優(yōu)點在于檢測成本低，適用于大樣本篩選。但是，上述方法操作煩瑣，需要PCR擴增和凝膠電泳等多個步驟，易導致樣本交叉污染；DNA片段長度增加，檢測靈敏度急劇下降；易出現(xiàn)假陰性和假陽性結果；無法獲得堿基變異的具體位置和堿基變異類型，必須通過后續(xù)技術手段確認上述變異信息(如:核酸測序)。核酸測序、生物芯片和生物傳感器等技術則需要事先對待分析物進行PCR擴增，同時，存在檢測成本高或通量低等問題。限制片段長度多態(tài)性(Restrict1n Fragment Length Polymorphism,RFLP)為代表的限制性內切酶片段分析方法則受到限制性內切酶位點存在與否的限制，同時需要凝膠電泳方式判斷結果。在上述多種檢測方法中，AS-PCR方法是最常用的方法之一。
[0004]AS-PCR方法檢測基因型的基本技術原理主要有兩類，分別是等位基因特異性引物(allele-specific primers)和等位基因特異性探針(allele-specific probes)。
[0005]依賴于等位基因特異性引物的AS-PCR通過等位基因特異性引物擴增產(chǎn)物的有無來判斷是否存在相應的基因型，該方法最初被稱之為擴增阻滯突變系統(tǒng)(amplificat1nrefractory mutat1n system, ARMS)或序列特異性引物 PCR(PCR with sequencespecific primers, PCR-SSP) (Newton CR, et al.Analysis of any point mutat1n inDNA.The amplificat1n refractory mutat1n system (ARMS).Nucleic Acids Res.1989; 17(7): 2503-16; Wu DY, et al.Allele-specific enzymatic amplificat1n ofbeta-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anemia.Proc Natl AcadSci USA.1989; 86 (8):2757-60; Sommer SS, et al.A novel method for detectingpoint mutat1ns or polymorphisms and its applicat1n to populat1n screeningfor carriers of ph enylketonuria.Mayo Clin Proc.1989; 64(11): 1361-72)。等位基因特異性引物的設計是ARMS技術特異性識別基因型的關鍵所在，其特征是通過等位基因特異性引物3’ -末端堿基識別基因型。理論上，當?shù)任换蛱禺愋砸锱c特定基因型完全匹配時才能產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，而對于其它基因型，則由于3’ -末端堿基的錯配而無法形成擴增產(chǎn)生。但是，由于不同基因型之間僅存在一個堿基的差異，等位基因特異性引物往往會產(chǎn)生非特異性擴增，即其它基因型也會產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，從而產(chǎn)生假陽性結果。同時，由于不同基因型的擴增產(chǎn)物片段大小基本一致，因此，不同的基因型往往都需要一個獨立的PCR反應管。盡管采用高保真耐熱DNA聚合酶、在等位基因特異性引物3’ -末端倒數(shù)第2位或第3位堿基進一步引入錯配堿基、提高退退火溫度等技術能夠在一定程度上緩解等位基因特異性引物3’ -末端堿基錯配所導致的非特異性擴增，但是，非特異性擴增往往都難以避免。同時，由于PCR擴增體系中的耐熱DNA聚合酶的熱動力學特征，即總是努力試圖擴增出產(chǎn)物，因此，當反應體系中存在與等位基因特異性引物不相匹配的靶分子時，等位基因特異性引物極易產(chǎn)生非特異性擴增。可以說，耐熱DNA聚合酶的上述熱動力學特征是ARMS技術產(chǎn)生非特異性擴增的根本原因之一。
[0006]依賴于等位基因特異性探針的AS-PCR技術通常應用了實時熒光PCR技術。該PCR擴增體系中的引物不具備等位基因特異性，因此能夠擴增所有基因型，基因型的識別依賴于等位基因特異性探針(Livak KJ.Allelic discriminat1n using fluorogenicprobes and the 5，nuclease assay.Genet Anal.1999 Feb; 14 (5-6): 143-9.)。例如，等位基因特異性探針通常在其5’-和3’-末端分別標記熒光報告基團(reporter)和淬滅基團(quencher ;即:TaqMan 探針，也叫水解探針(hydrolysis probes) ；Livak KJ, etal.0ligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenchedprobe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridizat1n.PCR Methods App1.1995; 4: 357-62.Bustin SA, et al.The MIQE guidelines:minimum informat1n for publicat1n of quantitative real-time PCR experiments.Clin Chem.2009; 55: 611-622)。當檢測體系中存在相應的基因型時，等位基因特異性探針與特定基因型擴增產(chǎn)物形成分子間雜交，隨后被Taq DNA聚合酶5’->3’外切酶活性水解而產(chǎn)生熒光信號，反之則不產(chǎn)生。由于不同基因型之間僅有一個堿基的差異，等位基因特異性探針極易與其它基因型產(chǎn)生非特異性雜交而產(chǎn)生熒光信號，最終導致其它基因型的假陽性結果。但是，該技術的非特異性熒光信號，或者說假陽性率仍然較高，往往需要對探針進行特定的修飾(如引入鎖核酸(locked nucleic acids, LNA)、DNA小溝結合物(minorgroove binder, MGB)和特定的分析軟件才能夠較為準確地分析基因型。
[0007]蝎形引物(scorp1nprimer)是在發(fā)夾式引物(sunrise primer; NazarenkoIA, et al.A closed tube format for amplificat1n and detect1n of DNA basedon energy transfer.Nucleic Acids Res.1997; 25:2516-21)和分子信標(molecularbeacon; Tyagi S, et al.Molecular beacons: probes that fluoresce uponhybridizat1n.Nat B1technol.1996; 14:303-8)基礎上演變出來的一種實時突光定量PCR技術(Mackay J, et al.Real-time PCR fluorescent chemistries.Methods MolB1l.2007;353:237-61.)。蝎形引物由兩部分構成，分別是3’-端的引物序列區(qū)和5’-端具有分子信標結構與特性的探針序列區(qū)，引物序列區(qū)與探針序列區(qū)之間用PCR阻斷劑(PCRblocker)連接(如:聚六乙二醇(hexaethylene glycol, HEG)、C3 (三個碳原子的碳鏈,其長度相當于一個堿基))，以阻止PCR產(chǎn)物沿探針序列延伸。探針序列區(qū)呈亞穩(wěn)定狀態(tài)的莖環(huán)結構。在游離狀態(tài)時，探針序列區(qū)莖部結構的5’ -末端和3’ -末端分別標記的熒光報告基因和淬滅基團在突光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)作用下不產(chǎn)生熒光信號。 在引物延伸階段，探針序列區(qū)的環(huán)狀序列與引物的3’-末端延伸產(chǎn)物形成分子內雜交雙鏈，從而使原有的莖部結構被破壞而釋放熒光信號?？梢?，蝎形具有引物和探針雙重功能:引物延伸產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，探針環(huán)部與引物延伸片段以分子內雜交的形式結合在擴增產(chǎn)物內部，并導致其莖環(huán)結構解體而釋放熒光信號。由于每個PCR擴增產(chǎn)物均帶有一個熒光探針，因此，一個延伸產(chǎn)物只能對應于一個熒光基團，從而解決了待檢測模板的定量問題。但是，該技術依然會產(chǎn)生非特異性擴增現(xiàn)象，假陽性率仍然較高。
[0008]綜上所述，耐熱DNA聚合酶的熱動力學特征是導致AS-PCR產(chǎn)物非特異性擴增的根本原因之一，在無法完全抑制非特異性擴增的前提下，存在假陽性檢測結果，最終導致現(xiàn)有的基因型檢測缺乏可靠性。


【發(fā)明內容】

[0009]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種能夠完全抑制AS-PCR非特異性擴增，在單個反應管內特異性平行檢測單堿基變異的所有基因型，從而確保檢測結果準確性的單管競爭性等位基因特異性蝎形引物實時熒光AS-PCR檢測方法。同時將這種方法稱之為競爭性實時突光等位基因特異性PCR(competitive real-time fluorescent AS-PCR,CRAS-PCR)。
[0010]為解決上述技術問題，本發(fā)明提供以下技術方案:
一種基因單堿基變異的CRAS-PCR檢測方法，其檢測體系中包括野生型和突變型等位基因特異性蝎形引物、上述等位基因特異性蝎形引物的共用引物，其特征在于:
野生型和突變型基因的等位基因特異性蝎形引物具有相同的3’-端延伸或擴增方向； 野生型和突變型基因的等位基因特異性蝎形引物和共用引物存在于同一個反應體系中；
野生型和突變型基因的等位基因特異性蝎形引物3’-末端與其基因型序列完全匹配，并通過此3’ -末端識別基因型。
[0011]1.根據(jù)蝎形引物原理設計單堿基變異基因的野生型和突變型序列的等位基因特異性蝎形引物(如:77^7? (dbSNP ID: rsll42345)野生型基因對應的SEQ N0.1.,TPMni突變型基因對應的SEQ N0.2)，并且，每種基因型所對應的等位基因特異性蝎形引物均靶向待測基因的同一條模板鏈(即:同時靶向正鏈或負鏈；或者說具有相同的3’-端延伸方向)，且分別標記有不同顏色的熒光報告基團及其對應的淬滅基團(圖1 ;SEQ N0.1 ；SEQN0.2)，用于實時熒光PCR過程中實時定性和定量判斷單堿基變異的基因型(圖2，圖3)。上述野生型和突變型基因對應的蝎形引物在本發(fā)明中被稱之為等位基因特異性蝎形引物。等位基因特異性蝎形引物的特征是通過其3’ -末端堿基識別基因型:當引物與特定基因型完全匹配時才能產(chǎn)生擴增產(chǎn)物并釋放熒光信號，而對于其它基因型，則由于3’-末端堿基的錯配而無法形成擴增產(chǎn)物。等位基因特異性蝎形引物具有引物和探針雙重功能:引物延伸產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，探針與引物延伸片段以分子內雜交的形式結合在擴增產(chǎn)物內部，并導致探針釋放其熒光報告基團的熒光信號。由于不同基因型對應的等位基因特異性蝎形引物標記有不同的熒光報告基團，因此，當單堿基變異的所有基因型對應的等位基因特異性蝎形引物置于同一個PCR反應管時，可以通過其探針釋放的熒光信號種類和豐度實現(xiàn)單個反應管內同時定性和定量檢測單堿基變異的所有基因型。
[0012]SEQ N0.1
(CY5)ACCGCGCCACCAACTACACTGTGTCCCGCGCGGT(BHQ2) (HEG)AATGTATGATTTTATGCAGGTTAGSEQ N0.2
(FAM)ACCGCGCCACCAACTACACTGTGTCCCGCGCGGT(BHQl)(HEG)GTATGATTTTATGCAGGTTCC
SEQ N0.3
TACCCAAATCAAAACAAACC
具體而言，本發(fā)明所述等位基因特異性蝎形引物具有下述共性:
⑴等位基因特異性蝎形引物是一條單鏈DNA，在本發(fā)明中，將其稱之為單鏈型等位基因特異性蝎形引物(圖1-4)。單鏈型等位基因特異性蝎形引物由兩部分構成，分別是3’-端的引物序列區(qū)(圖1綠色線條)和5’ -端具有分子信標結構與特性的探針序列區(qū)(圖1紅色和藍色線條)，并且，引物序列區(qū)與探針序列區(qū)之間用PCR阻斷劑連接，以阻止PCR產(chǎn)物沿探針序列區(qū)延伸(圖1)。探針序列區(qū)呈亞穩(wěn)定狀態(tài)的莖環(huán)結構，其中，環(huán)部(loop)序列(圖1紅色線條)與引物序列區(qū)3’ -端延伸產(chǎn)物互補，可與其3’ -端延伸產(chǎn)物形成分子內雜交雙鏈(圖2)。探針序列區(qū)的莖部(stem)序列(圖1藍色線條)完全互補(圖1)，但與待檢核酸模板無序列同源性，其莖部5’ -末端和3’ -末端分別標記熒光報告基團和淬滅基團(圖1)。當引物序列區(qū)無3’-端延伸產(chǎn)物時，探針序列區(qū)呈亞穩(wěn)定狀態(tài)的莖環(huán)結構，其莖部結構使5’ -末端熒光報告基團和3’ -末端淬滅基團緊密相鄰，5’ -末端熒光報告基團在吸收能量后FRET方式將能量轉移給鄰近的3’ -末端淬滅基團，因此，5’ -末端熒光報告基團受到3’-末端淬滅基團的制約而不能發(fā)出熒光。當引物序列區(qū)有3’-端延伸產(chǎn)物時，在PCR復性階段，探針序列區(qū)的環(huán)部序列與延伸產(chǎn)物結合，形成更穩(wěn)定的分子內雜交體，從而破壞了莖部結構產(chǎn)生的FRET，3’ -末端淬滅基團的淬滅作用被解除，5’ -末端熒光基團的發(fā)出可被檢測熒光信號(圖3)。隨著每次擴增產(chǎn)物的積累，熒光強度增加，可反映出每次擴增產(chǎn)物積累的量。因此，將野生型和突變型基因對應的等位基因特異性蝎形引物置于同一個反應管時，就可通過上述等位基因特異性蝎形引物在PCR過程中熒光信號的種類和強弱判斷基因型的種類和豐度(圖3，圖4)。
[0013]⑵或者，等位基因特異性蝎形引物是一條部分雙鏈DNA，在本發(fā)明中，將其稱之為雙鏈型等位基因特異性蝎形引物(圖5-7)。在此情況下，引物由部分完全互補的兩條單鏈DNA組成(圖5):較短的一條單鏈DNA在本發(fā)明中被稱之為探針淬滅單體(圖5藍色線條)；較長的一條單鏈DNA在本發(fā)明中被稱之為探針-引物序列單體(圖5紅色和綠色線條)。探針淬滅單體的3’ -末端標記有淬滅基團；探針-引物序列單體的5’ -末端標記有熒光報告基團，并且，在其探針序列區(qū)(圖5中紅色線條)和引物序列區(qū)(圖5綠色線條)之間用PCR阻斷劑連接，以阻止PCR產(chǎn)物沿探針序列區(qū)延伸(圖5，圖6)。探針-引物序列單體的探針序列區(qū)與引物序列區(qū)3’-端延伸產(chǎn)物互補，可與引物3’-端延伸產(chǎn)物形成分子內雜交雙鏈；引物序列區(qū)的喊基序列具有等位基因特異性，與特定基因型的喊基序列互補，從而可以選擇性地擴增其對應的基因型序列(圖6，圖7)。探針淬滅單體的堿基序列與探針-引物序列單體的探針序列區(qū)5’ -端部分序列完全互補，且探針淬滅單體的堿基序列比探針-引物序列單體的探針序列區(qū)堿基序列少4~10個堿基(圖5)。當引物序列區(qū)無3’ -端延伸產(chǎn)物時，探針淬滅單體與探針-引物單體的探針序列區(qū)呈亞穩(wěn)定狀態(tài)的莖狀結構，探針淬滅單體的3’ -末端淬滅基團與探針-引物序列單體的5’ -末端熒光報告基團緊密相鄰，熒光報告基團在吸收能量后FRET方式將能量轉移給鄰近的淬滅基團，因此，5’ -末端熒光報告基團受到3’-末端淬滅基團的制約而不能發(fā)出熒光(圖6A)。當引物序列區(qū)有3’-端延伸產(chǎn)物時，在PCR復性階段，探針序列區(qū)的探針序列區(qū)序列與延伸產(chǎn)物結合，形成更穩(wěn)定的分子內雜交體，從而破壞了莖狀結構產(chǎn)生的FRET，探針淬滅單體3’ -末端淬滅基團的淬滅作用被解除，探針-引物序列單體5’-末端熒光基團的發(fā)出可被檢測熒光信號(圖6B)。隨著每次擴增產(chǎn)物的積累，熒光強度增加，可反映出每次擴增產(chǎn)物積累的量。因此，將野生型和突變型基因對應的等位基因特異性蝎形引物置于同一個反應管時，就可通過上述等位基因特異性蝎形引物在PCR過程中熒光信號的種類和強弱判斷基因型的種類和豐度(圖6，圖7)。
[0014]⑶本發(fā)明所述的等位基因特異性蝎形引物具有探針和引物的雙重功能。等位基因特異性蝎形引物的探針序列區(qū)行使探針功能，通過與引物序列區(qū)3’-端延伸產(chǎn)物形成分子內雜交體而釋放熒光信號；引物序列區(qū)行使引物功能，其堿基序列與對應的基因型序列互補，并通過其3’ -末端堿基識別基因型，同時，為了進一步提高等位基因特異性蝎形引物的擴增特異性，可以在其3’ -末端堿基倒數(shù)第二位和/或第三位引入錯配堿基，或者，進一步采用包括硫代堿基、鎖核酸(locked nucleic acids, LNA)和肽核酸(peptide nucleicacids, PNA)在內的修飾堿基。
[0015]⑷上述等位基因特異性蝎形引物中所用到的熒光報告基團包括如羧基熒光素(6-FAM)、六氯熒光素(HEX)、四氯熒光素(TET)、JOE、VIC、異硫氰酸熒光素(FITC)、吲哚二羧菁(Cy3、Cy5)、TAMRA和ROX及其它熒光分子；淬滅基團既可以熒光淬滅劑(如:TAMRA、R0X)，也可以是非熒光淬滅劑(如:DABCYL，BHQI, BHQ2)。所用到的PCR阻斷劑可以是聚六乙二醇(HEG)、C3(三個碳原子的碳鏈)等，其特征是可以阻止引物的延伸。此外，還可以調換熒光報告基團和淬滅基團的位置，或者在引物的適當位置引入兩個或以上的熒光報告基團和淬滅基團，以提高熒光報告基團的熒光強度。
[0016](5)不同基因型的等位基因特異性蝎形引物均靶向同一條模板鏈，因此，具有相同的引物延伸與擴增方向。并且，單堿基變異所有基因型對應的等位基因特異性蝎形引物置于同一個PCR反應管，并通過其探針釋放的熒光信號種類和豐度實現(xiàn)單個反應管內同時定性和定量檢測單堿基變異的所有基因型。
[0017]2.設計與等位基因特異性蝎形引物(如:SEQ N0.1和SEQ N0.2)相對應的共用引物(如:SEQ N0.3)，該引物不具備等位基因識別能力，可同時擴增所有基因型(圖4，圖7)。
[0018]3.構建PCR反應體系:將共用引物、各基因型對應的等位基因特異性蝎形引物和待檢模板(如'TPMWl野生型、突變型和雜合型)置于單個PCR反應管中進行雙色或多色實時熒光定量PCR(圖4 ，圖7)。
[0019]4.應用實時熒光PCR檢測技術與設備記錄PCR實時擴增曲線，并根據(jù)每種等位基因特異性蝎形引物熒光信號的種類和強度判斷基因型的類別和豐度。
[0020]本發(fā)明的技術問題是這樣被解決的:
野生型和突變型等位基因特異性蝎形引物及其共用引物置于同一個PCR反應管中。無論反應體系中存在野生型、突變型和雜合型中的任何一種待檢測模板，均有其匹配的等位基因特異性蝎形引物，并在PCR擴增過程中釋放其對應的熒光信號。例如，野生型基因是野生型等位基因特異性蝎形引物(如:SEQ N0.1)和共用引物(如:SEQ N0.3)擴增形成擴增產(chǎn)物并釋放對應的CY5熒光信號'TPMn'2突變型基因是突變型等位基因特異性蝎形引物(如=SEQ N0.2)和共用引物(如=SEQ N0.3)擴增形成擴增產(chǎn)物并釋放對應的FAM熒光信號-'TPMni雜合型基因是同時存在上述兩種情況而同時釋放穩(wěn)各自對應的CY5和FAM熒光信號(圖4，圖7)。可見，當野生型和突變型等位基因特異性蝎形引物存在于同一個PCR反應管中時，無論待檢模板是何種基因型，均有其完全匹配的等位基因特異性蝎形引物存在，從而完全滿足了耐熱DNA聚合酶的熱動力學，確保每種等位基因特異性蝎形引物均特異性地擴增其匹配的基因型模板序列。
[0021]等位基因特異性蝎形引物具有探針和引物雙重功能。由于每種等位基因型特異性蝎形引物均標記有特定種類的熒光報告基團，并且，只在其產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的情況下才釋放熒光信號，因此，可以通過PCR擴增過程中熒光信號的種類來判斷待檢核酸序列的基因型，并且，檢測結果不受引物二聚體的干擾。同時，由于一個延伸產(chǎn)物只能產(chǎn)生一個熒光信號，因此，可以通過PCR擴增過程中熒光信號的強度或其對應的熒光擴增曲線拐點(即:CT值)來判斷某種特定基因型的豐度。最后，由于PCR擴增體系中總是存在至少與一種等位基因特異性蝎形引物相匹配的待檢核酸模板，因此，此檢測體系中至少有一種等位基因特異性蝎形引物會產(chǎn)生陽性擴增信號，從而可彼此作為PCR擴增檢測體系的陽性內對照，避免假陰性結果。
[0022]可見，本發(fā)明主要解決了以下關鍵技術難道:野生型和突變型等位基因特異性蝎形引物存在于同一個PCR擴增體系，滿足了耐熱DNA聚合酶的熱動力學特征，每種待檢核酸模板都只被其對應的等位基因特異性蝎形引物特異性擴增，確保檢測結果的準確性和特異性；可在單個反應管內通過熒光信號的種類和強度實現(xiàn)單堿基變異基因型的定性和定量檢測；野生型和突變型特異性等位基因特異性蝎形引物的擴增產(chǎn)物可作為彼此的陽性內對照，避免假陰性結果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1.單鏈型等位基因特異性蝎形引物的結構示意圖；
圖2.單鏈型等位基因特異性蝎形引物的熒光信號釋放原理示意圖；
圖3.單鏈型等位基因特異性蝎形引物的CAST-PCR基本原理示意圖；
圖4.單鏈型等位基因特異性蝎形引物的CAST-PCR判斷基因型原理示意圖；
圖5.雙鏈型等位基因特異性蝎形引物的結構示意圖；
圖6.雙鏈型等位基因特異性蝎形引物的熒光信號釋放原理示意圖； 圖7.雙鏈型等位基因特異性蝎形引物的CAST-PCR判斷基因型原理示意圖；
圖8.TPMWZ的CAST-PCR檢測特異性；
圖9.TPMWl的CAST-PCR檢測的線性范圍；
圖10.TPMWZ的CAST-PCR檢測的靈敏度；
圖11.TPMWZ的全血樣本CAST-PCR檢測結果示例；
圖12.TPMT觀和TPMm和CAST-PCR檢測結果示例；
圖13.基因點突變的CAST-PCR檢測結果示例。
[0024]Loop:環(huán)；Stem:莖；Reporter:報告基團；Quencher:淬滅基團；Priming:引發(fā)；WT-F:野生型上游引物；MT-F:突變型上游引物；C0-R:共用下游引物；Amplificat1n:擴增；PCR Blockers: PCR 阻斷物；Fluorescent Queancer:突光淬滅基團；Fluorescentdyes quenched:處于淬滅狀態(tài)的突光基團；Fluorescent dyes releasing fluorescence:釋放突光的突光基團；wild_type alleles:野生型等位基因；Mutant alleles:突變型等位基因！Fluorescence:突光；Cycles:循環(huán)；WT-QC plasmid:野生型質控質粒；MT-QCplasmid:突變型質控質粒；Cycles number:循環(huán)數(shù)；Log concentrat1n of QC plasmidcopies:質控質?？截悢?shù)的對數(shù)濃度；% Mutat1ns:突變比例；ffild-type template:野生型模板；Mutant template:突變型模板。

【具體實施方式】
[0025]下面將通過具體的例子來進一步闡述本發(fā)明方法，但本發(fā)明方法并不限于以下有限的例子。本領域技術人員可以根據(jù)說明書的內容和實際的需要對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0026]實施案例一 'TPMWl基因型的檢測1.等位基因特異性蝎形引物的設計與合成
根據(jù)TPMWZ (dbSNP ID: rs 1800462; G238C)基因型核酸序列特征，分別設計與其野生型和突變型序列相匹配的等位基因特異性蝎形引物，其中，SEQ N0.1和SEQN0.2與TPMWZ (G238C)反向序列互補，均是PCR擴增上游引物，分別用于特異性擴增TPMWl (G238C)野生型和突變型核酸序列。SEQ N0.1和SEQ N0.2中的PCR阻斷劑HEG的5’ -端和3’ -端寡核苷酸序列分別是探針序列區(qū)和引物序列區(qū)，此PCR阻斷劑的作用是阻止野生型和突變型等位基因特異性蝎形引物的共用下游引物(即:SEQ N0.3)沿探針序列延伸。上述等位基因特異性蝎形引物序列中，下劃線加粗者是蝎形引物的莖部結構，二者是完全互補序列，其5’ -末端和3’ -末端分別標記有熒光報告基團(SEQ N0.1是CY5熒光報告基因；SEQ N0.2是FAM熒光報告基團)和淬滅基團(SEQ N0.1是BHQ2淬滅基團；SEQN0.2是BHQl淬滅基團)。在上述等位基因特異性蝎形引物的3’ -末端倒數(shù)第二位堿基均引入了一個錯配喊基，以提聞其等位基因的識別能力。
[0027]SEQ N0.1
(CY5)ACCGCGCCACCAACTACACTGTGTCCCGCGCGGT(BHQ2) (HEG)AATGTATGATTTTATGCAGGTTAGSEQ N0.2
(FAM)ACCGCGCCACCAACTACACTGTGTCCCGCGCGGT(BHQl)(HEG)GTATGATTTTATGCAGGTTCC
SEQ N0.3
TACCCAAATCAAAACAAACC 2.等位基因特異性蝎形引物的共用下游共用引物的設計與合成
根據(jù)TPMWZ (G238C)基因型核酸序列特征及其等位基因特異性蝎形引物SEQ N0.1和SEQ N0.2所在位置，設計SEQ N0.1和SEQ N0.1的下游共用引物SEQ N0.3。
[0028]3.實時熒光定量PCR反應體系的構建
PCR反應體系共計20 μ I,該體系中包括以下組分:lx Premix Ex Taq master mix(Perfect Real Time; TaKaRa 公司)，系列終濃度(0 μΜ、0.2 μΜ、0.4 μΜ、0.6 μΜ、0.8μ Μ) 77Wr*2(G238C)野生型和突變型等位基因特異性蝎形引物(B卩:SEQ N0.1和SEQ N0.2)，系列終濃度(0.2 μ Μ、0.4 μ Μ、0.6 μ Μ、0.8 μ Μ) TPMWl (G238C)共用下游引物(即:SEQ N0.3),系列終濃度(IxlO8 to IxlO1 copies)的野生型質控(wild-type qualitycontrol, WT-QC)質粒)和突變型質控質粒，或者2(T100 ng人類全血基因組DNA。實時熒光PCR反應條件為:95° C預變性30秒;95° C變性30秒，特定溫度(即:53° C、55° C、57° C、59°C)條件下復性與延伸30秒(并同時采集突光)。所用設備為Exicycler 96 Real-timeQuantitative Thermal Block (B1neer, Daejeon, Korea),突光信號米集與分析軟件為Exicycler 96 Software (B1neer)。
[0029]4.結果與分析
4.1特異性:當反應體系中只存在某種特定基因型特異性蝎形引物時，如圖8A和圖SB顯示，均會導致非特異性擴增。圖8A所述反應體系中只存在野生型等位基因特異性蝎形引物(即:SEQ N0.1)和下游共用引物(即:SEQ N0.2)，此時，突變型質控質粒在理論上不應該出現(xiàn)熒光信號，但是結果表明，在幾乎所有的實驗條件下均出現(xiàn)了非特異性擴增信號，從而產(chǎn)生假陽性結果。與圖8A相類似，圖SB所述反應體系中只存在突變型等位基因特異性蝎形引物(即=SEQ N0.2)和下游共用引物(即:SEQ N0.3)，此時，野生質控質粒在理論上不應該出現(xiàn)熒光信號，但是結果表明，在幾乎所有的實驗條件下均出現(xiàn)了非特異性擴增信號，從而產(chǎn)生假陽性結果。圖SC和圖8D所述反應體系中同時存在野生型和突變型等位基因特異性蝎形引物(即=SEQ N0.1和SEQ N0.2)和下游共用引物(即=SEQ N0.3)，在此反應體系中，紅色和綠色熒光信號分別代表待檢樣本中存在野生型序列和突變型模板。檢測結果表明，在所有實驗條件下，當反應體系中只存在野生型模板(圖SC)或突變型模板(圖8D)，均只出現(xiàn)其基因型對應的熒光信號，無任何非特異性擴增。上述結果證明了本發(fā)明(圖8C和圖8D對應的檢測方法)完全消除了現(xiàn)有AS-PCR(圖8A和圖8B)所存在的非特異性擴增。
[0030]4.2線性范圍:當反應體系中同時存在0.2 μ M終濃度的野生型等位基因特異性蝎形引物(即:SEQ N0.1),0.2 μ M終濃度的突變等位基因特異性蝎形引物(即:SEQN0.1),0.2 μ M終深度共用下游引物(即:SEQ N0.3)時，系列終濃度(IxlO8 to IxlO1copies)的野生型質控質粒(圖9A)和突變型質控質粒(圖9B)均只產(chǎn)生其對應的熒光信號，無任何非特異性擴增信號。在此線性范圍內，野生型和突變型基因型的擴增效率(圖9C)分別是96.59% (R2=0.999)和99.11% (R2=0.998)，雜合型模板中的野生型和突變型基因型的擴增效率(圖3D)分別是95.07% (R2=0.998)和98.27% (R2=0.999)。該結果進一步說明野生型和突變型在本發(fā)明方法中具有等效擴增。
[0031]4.3靈敏度:當特定濃度的野生型質粒(圖10A-C:1xlO6 copies ;圖10D-F:1xlO4 copies)與系列濃度(IxlO6 copies~IxlO1 copies)的突變型質粒共同存在時，本發(fā)明所述方法對突變型的檢測靈敏度達到1%。
[0032]4.4臨床驗證:采用4.2所述反應體系共計檢測了 254例人類外周血全血基因組DNA的基因型(圖11A)，其檢測結果與核酸測序完全一致，并且，在檢測過程中平行檢測的質控質粒的基因型結果完全正確(圖11B)，說明檢測結果準確可靠。
[0033]實施案例二: TPMT觀和TPMPd基因型的檢測
1.單鏈型等位基因特異性蝎形引物及其共用引物的設計與合成根據(jù)(dbSNP ID: rsl800460; G460A)和(dbSNP ID: 1142345;
A719G)基因型核酸序列特征，分別設計其野生型和突變型匹配的等位基因特異性蝎形引物及其共用引物。野生型和突變型匹配的等位基因特異性蝎形引物分別是Seq N0.4和Seq N0.5，均是上游引物，分別標記HEX和FAM熒光報告基團；共用引物為下游引物SeqN0.6。77ir*3C野生型和突變型匹配的等位基因特異性蝎形引物分別是Seq N0.8和SeqN0.9，均是下游引物，分別標記HEX和FAM熒光報告基團；共用引物為上游引物Seq N0.7。在上述等位基因特異性蝎形引物的3’ -末端倒數(shù)第二位堿基均引入了一個錯配堿基，以提聞其等位基因的識別能力。
[0034]SEQ N0.4
(HEX)ACCGCGCTCACCTGGATTGATGGCAACTAGCGCGGT(BHQl)(HEG)ACATGATTTGGGATAGAGGTG
SEQ N0.5
(HEX)ACCGCGCTCACCTGGATTGATGGCAACTAGCGCGGT(BHQ1) (HEG)GACATGATTTGGGATAGAGGTASEQ N0.6TAGAAGTCTAAGCTGATTTTCT
SEQ N0.7
CGTTGTCTTGAGAAGGTTGA
SEQ N0.8
(HEX)ACCGCGCAAAGTTGGGGAATTGACTGTCTGCGCGGT(BHQ1) (HEG)CTCATTTACTTTTCTGTAAGTAGCTSEQ N0.9
(FMA)ACCGCGCAAAGTTGGGGAATTGACTGTCTGCGCGGT(BHQl) (HEG)GTCTCATTTACTTTTCTGTAAGTAGTC
2.實時熒光定量PCR反應體系的構建
TPMT觀的PCR反應體系共計20 μ I,該體系中包括以下組分:lx Premix Ex Taqmaster mix, 0.2 μ M野生型和突變型等位基因特異性蝎形引物(即=SEQ N0.4和SEQ N0.5),0.2 μ M下游共用引物(即:SEQ N0.6)、IxlO4拷貝的野生型質控質粒和突變型質控質粒，或者2(T100 ng人類全血基因組DNA。實時熒光PCR反應條件為:95°C預變性30秒；95°C變性30秒，57°C復性與延伸30秒(并同時采集熒光)。所用設備為B1-Rad CFX96型實時熒光定量PCR儀，熒光信號采集與分析軟件為B1-Rad CFX Manager V3.1。
[0035]77Wr*3C的PCR反應體系共計20 μ 1，該體系中包括以下組分:lx Premix Ex Taqmaster mix, 0.2 μ M野生型和突變型等位基因特異性蝎形引物(即=SEQ N0.8和SEQ N0.9),0.2 μ M下游共用引物(即:SEQ N0.6)，IxlO4拷貝的野生型質控質粒和突變型質控質粒，或者2(T100 ng人類全血基因組DNA。實時熒光PCR反應條件為:95°C預變性30秒；95°C變性30秒，57°C復性與延伸30秒(并同時采集熒光)。所用設備為B1-Rad CFX96型實時熒光定量PCR儀，熒光信號采集與分析軟件為B1-Rad CFX Manager V3.1。
[0036]3.結果與分析
3.1特異性:當反應體系中只存在野生型核酸序列時，TPMT'^m和TPMWiC反應體系均只能檢測到HEX熒光通道信號(圖12A，C);當反應體系中只存在突變型核酸序列時，TPMT觀和TPMm反應體系均只能檢測到FAM熒光通道信號(圖12C，D);當反應體系同時存在野生型和突變型時，則能同時檢測到HEX和FAM熒光通道信號。
[0037]3.2靈敏度:野生型質粒(IxlO6 copies)與系列濃度(IxlO6 copies~IxlO1copies)突變型質粒共同存在時，本發(fā)明所述方法對突變型的檢測靈敏度達到1%。
[0038]3.3臨床驗證:254例人類外周血全血基因組DNA的基因型檢測結果表明，無TPMT觀變異，4例為TPMWiC雜合型，共變異比例為1.6%，且雜合型與核酸測序結果一致。
[0039]實施案例三基因第600位密碼子突變檢測
1.雙鏈型等位基因特異性蝎形引物及其共用引物的設計與合成根據(jù).A第600位密碼子(V600; GTG)第二位堿基的所有突變情況，設計分別靶向野生型(V600; GTG)和 V600E (GTG)GAG)、V600A (GTG)GCG)、V600G (GTG)GGG)等三種突變型的雙鏈型等位基因特異性蝎形引物的探針-引物單體。靶向野生型(V600; GTG)的探針-引物單體是SEQ N0.11，靶向突變型V600E(GTG>GAG)的探針-引物單體是SEQ N0.12，靶向突變型V600A(GTG>GCG)的探針-引物單體是SEQ N0.13，靶向突變型V600G (GTG>GGG)的探針-引物單體是SEQ N0.14。SEQ N0.11~14的5’ -末端分別標記有CY5、FAM、HEX和Texas Red熒光報告基團，在探針序列區(qū)和引物序列區(qū)之間是PCR阻斷劑HEG。各引物的3’ -末端是等位基因特異性堿基，在3’ -末端倒數(shù)第三位堿基引入一個錯配堿基G，以進一步提聞錯配識別能力。
[0040]SEQ N0.10
ACTACACCTCAGATATATTTCTTCATG
SEQ N0.11
(CY5)gtaaaaataggtgattttggtctagcta(HEG)CCCACTCCATCGAGATTgCA
SEQ N0.12
(FAM)gtaaaaataggtgattttggtctagcta(HEG)CCCACTCCATCGAGATTgCT
SEQ N0.13
(HEX)gtaaaaataggtgattttggtctagcta(HEG)CCCACTCCATCGAGATTgCG
SEQ N0.14
(Texas Red)gtaaaaataggtgattttggtctagcta(HEG)CCCACTCCATCGAGATTgCC
SEQ N0.15
gaccaaaatcacctatttttac(BHQl)
SEQ N0.16
gaccaaaatcacctatttt tac(BHQ2)
2.上游共用引物及探針淬滅單體的設計與合成
根據(jù)探針-引物單體及其探針序列區(qū)的序列特征，設計合成探針淬滅單體SEQ N0.15和SEQ N0.16，二者的3’-末端分別標記淬滅基團BHQl和BHQ2。根據(jù)熒光報告基團和淬滅基團的特征，SEQ N0.12 和 SEQ N0.15, SEQ N0.13 和 SEQ N0.15, SEQ N0.11 和 SEQN0.16、SEQ N0.14和SEQ N0.16兩兩配伍構成雙鏈型等位基因特異性蝎形引物。同時，設計上述蝎形引物的上游共用引物SEQ N0.10。
[0041]2.實時熒光定量PCR反應體系的構建
PCR反應體系共計20 μ I,該體系中包括以下組分:lx Premix Ex Taq master mix、0.2PM野生型和突變型等位基因特異性蝎形引物的探針-引物單體(即:SEQ N0.?4),2.0μ M野生型和突變型等位基因特異性蝎形引物的探針淬滅單體(即:SEQ N0.15和SEQ N0.16),0.4 μ M上游共用引物(即:SEQ N0.10)、IxlO4拷貝的野生型質控質粒和各突變型質控質粒，或者2(T100 ng人類結直腸癌組織細胞DNA。實時熒光PCR反應條件為:95°C預變性30秒；95° C變性30秒，60° C復性與延伸30秒(并同時采集熒光)。所用設備為B1-Rad CFX96型實時熒光定量PCR儀，熒光信號采集與分析軟件為B1-Rad CFX ManagerV3.1。
[0042]3.結果與分析
3.1特異性:當反應體系中只存在某種特定基因型的模板時，PCR體系均只能特異性地檢測到各基因型對應熒光信號，無任何非特異性擴增(圖12A-D)。當反應體系中同時存在4種模板時，能夠檢測到所有基因型對應的熒光信號(圖13E)。
[0043]3.2靈敏度:野生型質粒(IxlO6 copies)與系列濃度(IxlO6 copies~IxlO1copies)突變型質粒共同存在時，本發(fā)明所述方法對突變型的檢測靈敏度達到1%。
[0044]3.3臨床驗證:100例人類結直腸癌組織細胞DNA的基因型檢測結果表明，所有樣本中僅存在V600E突變，V600E陽性樣本共計8例，突變比例為8.0%。圖13F顯示一例V600E陽性的臨床樣本檢測結果。
【權利要求】
1.一種基因單堿基變異的CRAS-PCR檢測方法，其檢測體系中包括野生型和突變型等位基因特異性蝎形引物、上述等位基因特異性蝎形引物的共用引物，其特征在于: 野生型和突變型基因的等位基因特異性蝎形引物具有相同的3’-端延伸或擴增方向； 野生型和突變型基因的等位基因特異性蝎形引物和共用引物存在于同一個反應體系中； 野生型和突變型基因的等位基因特異性蝎形引物3’-末端與其基因型序列完全匹配，并通過此3’ -末端識別基因型。
2.如權利要求1所述基因單堿基變異的CRAS-PCR檢測方法，其特征在于:等位基因特異性蝎形引物是單鏈型等位基因特異性蝎形引物，引物序列由探針序列區(qū)和引物序列區(qū)構成，并且，引物序 列區(qū)和探針序列區(qū)通過PCR阻斷劑連接；探針序列區(qū)呈亞穩(wěn)定莖環(huán)結構，其中，莖部結構兩末端分別標記有熒光報告基團和淬滅基團，環(huán)部結構序列與引物序列區(qū)的3’-端延伸產(chǎn)物形成分子內雜交雙鏈而使莖部結構解體，并釋放標記的熒光信號；每種基因型的等位基因特異性蝎形引物均標記某種特定的熒光報告基團，通過PCR反應體系中的熒光信號種類和強度實現(xiàn)基因型的定性和定量檢測。
3.如權利要求1所述基因單堿基變異的CRAS-PCR檢測方法，其特征在于:等位基因特異性蝎形引物是雙鏈型等位基因特異性蝎形引物，引物由探針淬滅單體和探針-引物單體兩條單鏈DNA組成；探針-引物單體由探針序列區(qū)和引物序列區(qū)構成，并且，引物序列區(qū)和探針序列區(qū)通過PCR阻斷劑連接；探針淬滅單體與探針-引物單體探針序列區(qū)呈亞穩(wěn)定狀態(tài)，探針淬滅單體的3’ -末端標記有淬滅基團，探針-引物單體探針序列區(qū)的5’ -末端標記有熒光報告基團，探針-引物單體探針序列區(qū)與引物序列區(qū)的3’ -端延伸產(chǎn)物形成分子內雜交雙鏈而使莖部結構解體，并釋放標記的熒光信號；每種基因型的等位基因特異性蝎形引物均標記某種特定的熒光報告基團，通過PCR反應體系中的熒光信號種類和強度實現(xiàn)基因型的定性和定量檢測。
4.如權利要求1所述基因單堿基變異的CRAS-PCR檢測方法，其特征在于:等位基因特異性蝎形引物的PCR阻斷劑是聚六乙二醇(HEG)，或者是三個碳原子的碳鏈(C3)，或者是其它PCR阻斷劑。
5.如權利要求1所述基因單堿基變異的CRAS-PCR檢測方法，其特征在于:所述等位基因特異性蝎形引物的熒光報告基團是羧基熒光素出-FAM)、六氯熒光素(HEX)、四氯熒光素(TET)、JOE、VIC、異硫氰酸熒光素(FITC)、吲哚二羧菁(Cy3、Cy5)、TAMRA、ROX,或者其它類別的熒光基團。
6.如權利要求1所述基因單堿基變異的CRAS-PCR檢測方法，其特征在于:等位基因特異性蝎形引物的淬滅基團是熒光淬滅劑TAMRA、R0X、或者其它熒光基團，也是非熒光淬滅劑DABCYL、BHQl、BHQ2、或者其它熒光基團。
7.如權利要求1所述基因單堿基變異的CRAS-PCR檢測方法，其特征在于:等位基因特異性蝎形引物中的堿基有一個或者多個硫代堿基，或者是鎖核酸，或者是其它修飾堿基；等位基因特異性蝎形引物的3’-端部分堿基是硫代堿基，或者是鎖核酸，或者是其它修飾堿基；等位基因特異性蝎形引物的3’ -末端堿基倒數(shù)第2位和/或第3位堿基進一步引入與待檢測核酸序列錯配的堿基，或者在其它位置引入錯配堿基。
8.如權利要求1所述基因單堿基變異的CRAS-PCR檢測方法，其特征在于:所述反應體系包括:野生型和突變型基因型的等位基因特異性蝎形引物、上述等位基因特異性蝎形引物的共用引物、耐熱DNA聚合酶、PCR擴增所需dNTPs、待檢測模板、PCR擴增所需緩沖液和離子強度， 該反應體系中加入尿11密唳-N-糖基化酶(uracil-N-glycosylase, UNG)或尿B密P定-DNA-糖基化酶(uracil-DNA-glycocasylase, UDG)； 耐熱DNA聚合酶是不具有3’ ->5’核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，或具是有3’ ->5’核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，或者是具有5’ ->3’核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶，或者是具有鏈置換活性的耐熱DNA聚合酶，或者是同時具有上述一種以上特征的耐熱DNA聚合酶； PCR 擴增所需 dNTPs 是 dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP 的混合液，或者是 dATP、dTTP、dGTP、dCTP和dUTP的混合液； 待檢測模板是人類基因組DNA,或者質粒DNA,或者其它核酸序列； 待檢測基因型是野生型基因，或者是突變型基因，或者是雜合型基因； PCR擴增促進劑:甜菜堿(betaine)，或者二甲基亞砜(DMSO)，或者牛血清白蛋白(BSA)，或者其它PCR擴增促進劑。
9.如權利要求書I至8所述的基因單堿基變異的CRAS-PCR檢測方法，其特征在于:PCR反應條件包括95~98° C預變性30~60秒；35~55個循環(huán)的95~98° C變性30秒，50~65° C復性與延伸30-90秒(并同時采集熒光)， 在第一步進行50° C孵育5~20分鐘，通過該步驟去除前次PCR擴增產(chǎn)物存在的污染；根據(jù)等位基因特異性蝎形引物的熒光信號種類和強度(或者是擴增曲線CT值)判斷待檢測模板的基因型類別和豐度。
10.一種包含有權利要求1~9中的所稱反應體系的檢測試劑或者試劑盒。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164478SQ201410107860
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年3月21日 優(yōu)先權日:2014年3月21日
【發(fā)明者】黃慶, 府偉靈, 張陽, 楊昭, 黃君富, 夏涵 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院