玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控因子ZmPHO2;H1及其編碼基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控基因ZmPHO2的同源基因ZmPHO2;H1,在耐低磷自交系178中克隆所得序列，其核苷酸序列如SEQID?No.2所示，其氨基酸序列如SEQID?No.1所示。本發(fā)明設(shè)置了正常磷濃度（1mmol/L）、四個低磷水平（無磷、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L）處理12h和八天并做定量分析，結(jié)果表明在某些特定的時間段，不同低磷濃度處理下該基因的表達(dá)量低于正常磷水平，并且證實了該基因在耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782中不同的表達(dá)規(guī)律，為了該基因后續(xù)在研究中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控因子ZmPH02;H1及其編碼基因
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程和分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控因子ZmPH02;Hl實驗設(shè)計創(chuàng)新及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]磷是生物生長發(fā)育的重要營養(yǎng)元素之一，是蛋白質(zhì)、核酸、脂類以及各種重要的小分子，如能源供應(yīng)者ATP的重要組成成分，是各種糖代謝，如糖降解必須的中介物，是生物發(fā)育的調(diào)節(jié)物，如磷酸化等。因此，施加磷肥對提高作物產(chǎn)量起著關(guān)鍵作用。
[0003]玉米是一種重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，土壤低磷嚴(yán)重影響玉米的正常生長發(fā)育。張繼海等通過對多份玉米自交系進(jìn)行耐低磷力鑒定，篩選出一批耐低磷的種質(zhì)，耐低磷玉米自交系178就屬于其中一個表現(xiàn)優(yōu)異的種質(zhì)。耐低磷玉米能夠在低磷條件下提高對磷的利用率，提高玉米的產(chǎn)量，其中磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控基因在耐低磷的作用機(jī)制中起到關(guān)鍵作用。因此，闡明該基因在低磷處理時的表達(dá)模式和在不同低磷濃度處理下的表達(dá)特征，并在耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782中測得可溶性磷含量，有利于闡明耐低磷機(jī)制，為提高玉米耐低磷能力和玉米產(chǎn)量提供重要的研究方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的在于提供一種玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控因子ZmPH02;Hl及其應(yīng)用，本發(fā)明提供的玉米基因ZmPH02;Hl在低磷環(huán)境下受到抑制，使磷酸鹽從地上部分向地下部分運(yùn)輸受到一定程度的抑制 ，從而保持葉片中磷濃度處于正常狀態(tài)，不會受到缺磷的影響。并發(fā)現(xiàn)了在ZmPH02;Hl蛋白結(jié)構(gòu)域中絡(luò)氨酸變?yōu)榘腚装彼幔腚装彼嵩诜核亟Y(jié)合酶復(fù)合體形成中起到非常關(guān)鍵的活化作用，對后續(xù)抑制或降解磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起到重要的調(diào)控作用，因此，深入研究該基因在這個位點上的突變帶來的功能變化有重要意義。
[0005]本發(fā)明提供了一種玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控因子ZmPH02;Hl，其氨基酸序列如SEQID N0.1 所示。
[0006]本發(fā)明還提供編碼上述蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
[0007]本發(fā)明還提供含有編碼玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控基因ZmPH02;Hl的載體及含有該載體的宿主細(xì)胞。
[0008]本發(fā)明設(shè)置了正常磷濃度(lmmol/L)、四個低磷水平(無磷、I μ mol/L、10 μ mol/L、100 μ mol/L)處理12h和八天并做定量分析，結(jié)果表明在某些特定的時間段，不同低磷濃度處理下的該基因的表達(dá)量低于正常磷水平，為了該基因后續(xù)在研究中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
[0009]本發(fā)明還提供了在不同磷濃度不同時間段內(nèi)處理下，耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782中葉和根的有效磷含量，闡明了葉中的有效磷含量要高于根中的有效磷含量，以及在根和葉中有效磷含量的變化規(guī)律，進(jìn)一步證實該基因在研究中的重要價值。
[0010]本發(fā)明提供的ZmPH02;Hl基因是從耐低磷自交系178 (由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所提供)中克隆得到的基因，其開發(fā)閱讀框為1122bp，編碼373個氨基酸；其在耐低磷自交系178或者低磷敏感自交系9782的葉和根中均有表達(dá)；其與喬草(Setaria italica)XP_004967378、水稻(Oryza sativa) 0s01g0233900> 短柄草(Brachypodium distachyon)XP_003566089、大麥(Hordeum vulgare ) BAK03891、小麥屬(Triticum urartu ) EMS50616 存在高度保守性；其表達(dá)的玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控因子ZmPH02;Hl包含一個保守結(jié)構(gòu)域UBC (泛素結(jié)合酶);等電點和分子量為:Theoretical pI/Mw:8.36/41839.39 J_ZmPH02;Hl沒有跨膜結(jié)構(gòu)域；其表達(dá)部位在細(xì)胞核內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明實施例所提供的編碼玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控基因ZmPH02;Hl的擴(kuò)增條帶；
[0012]圖2為玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控基因ZmPH02;Hl在耐低磷自交系178葉中的相對
表達(dá)量;
[0013]圖3為玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控基因ZmPH02;Hl在耐低磷自交系178根中的相對
表達(dá)量; [0014]圖4為本發(fā)明實施例所提供的玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控因子ZmPH02;Hl的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果；
[0015]圖5為本發(fā)明實施例所提供的玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控因子ZmPH02;Hl的跨膜結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果；
[0016]圖6為本發(fā)明實施例所提供的玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控因子ZmPH02;Hl的表達(dá)部位預(yù)測分析結(jié)果；
[0017]圖7為本發(fā)明實施例所提供的玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控因子ZmPH02;Hl的進(jìn)化樹分析結(jié)果；
[0018]圖8為本發(fā)明實施例所提供的玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控因子ZmPH02;Hl的多重序列比對;
[0019]圖9為編碼玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控基因ZmPH02;Hl在低磷敏感自交系9782葉中的相對表達(dá)量；
[0020]圖10為編碼玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控基因ZmPH02;Hl在低磷敏感自交系9782根中的相對表達(dá)量；
[0021]圖11為編碼玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控基因ZmPH02;Hl在耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782葉中的相對表達(dá)量；
[0022]圖12為編碼玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控基因ZmPH02;Hl在耐低磷自交系178和低磷敏感自交系9782根中的相對表達(dá)量；
[0023]圖13為耐低磷自交系178在12h和8d不同磷濃度的有效磷含量；
[0024]圖14為低磷敏感自交系9782在12h和8d不同磷濃度的有效磷含量。
【具體實施方式】
[0025]實施例1玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控基因ZmPH02;Hl在低磷處理下組織特異性表達(dá)
[0026]1.1玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控基因ZmPH02;Hl在不同組織中表達(dá)特征分析
[0027]1.1.1引物設(shè)計[0028]本實驗選擇玉米組成型表達(dá)基因18S為內(nèi)參基因，用于校準(zhǔn)不同樣品中起始模板量以及RNA反轉(zhuǎn)錄效率。依據(jù)qRT-PCR引物設(shè)計的要求和原則，結(jié)合Primer Premier5.0和Beacon designer設(shè)計目的基因和內(nèi)參基因的特異性引物，用e_PCR在玉米基因組數(shù)據(jù)庫中對設(shè)計的引物進(jìn)行驗證，將只能擴(kuò)增出單一條帶的引物作為候選，送上海Invitrogen公司合成。
[0029]定量引物信息如下:
[0030]正向引物F 如 SEQID N0.3 所示，為:GCTCCTCTGTGAATGTC ；
[0031]反向引物R 如 SEQID N0.4 所示，為:TTCCTTGCTCTGTCCTT。
[0032]1.1.2引物的特異性檢測
[0033]以各時段cDNA樣品混合液稀釋10倍后用作qRT_PCR反應(yīng)的模板，退火溫度梯度范圍設(shè)定為50~65°C，用于確定最佳Tm值，同時根據(jù)溶解曲線的峰型檢測引物的特異性。10 μ L反應(yīng)體系見表1，qRT-PCR反應(yīng)在CFX96Manager (Bio-Rad USA)進(jìn)行，反應(yīng)程序見表2。
[0034]表1熒光定量PCR的反應(yīng)體系
[0035]
【權(quán)利要求】
1.玉米磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上游調(diào)控因子ZmPH02;Hl，其氨基酸序列如SEQIDN0.1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的載體。
5.含有權(quán)利要求4 所述載體的宿主細(xì)胞。
【文檔編號】C12N15/29GK103992397SQ201410108347
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】高世斌, 劉丹, 吳玲, 田躍飛, 蘇順宗, 榮廷昭, 潘光堂, 劉堅, 張志明, 林海建, 沈亞歐, 聶治, 張嘯, 劉文軍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)