靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)及其制備工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了具有靶細(xì)胞特異性細(xì)胞毒性的融合蛋白質(zhì)及其制備方法，本發(fā)明涉及人體促性腺激素釋放激素突變體(mGnRH)與重組綠膿桿菌外毒素A突變體(PE38m4a)融合蛋白質(zhì)，以及所述的雙突變體融合蛋白質(zhì)作為抗腫瘤藥物，在抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)育中的應(yīng)用。
【專利說明】靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)及其制備工藝
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明總地涉及具有靶細(xì)胞特異性細(xì)胞毒性的融合蛋白質(zhì)的新型制備工藝。更具體地說，本發(fā)明涉及腫瘤特異性治療藥物人體促性腺激素釋放激素突變體(mGnRH)與重組綠膿桿菌外毒素A截短片段或其突變體(PE38m4a)融合蛋白質(zhì)的基因重新構(gòu)建和純化的制備工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]為了提高抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用，在中國(guó)專利CN200810051112.4中構(gòu)建并表達(dá)了以突變的GnRH為導(dǎo)向，以截短并在C端進(jìn)行突變的綠膿桿菌外毒素A為細(xì)胞毒性劑的雙突變體融合蛋白質(zhì)，其基本原理是在腫瘤的發(fā)生和發(fā)育過程中，許多腫瘤細(xì)胞都在其表面上過量表達(dá)促性腺激素釋放激素受體蛋白質(zhì)(GnRHR)，因此，可將某些細(xì)胞毒性劑(如綠膿桿菌外毒素(PE)、白喉毒素、霍亂毒素、葡萄球菌內(nèi)毒素及蓖麻毒素等)連接到作為導(dǎo)向劑的GnRH分子上，以產(chǎn)生兼有腫瘤細(xì)胞導(dǎo)向功能和細(xì)胞毒活性的雜交分子。這些雜交分子借助其對(duì)靶腫瘤細(xì)胞導(dǎo)向能力將整個(gè)分子引向靶細(xì)胞并通過其毒素部分殺傷靶細(xì)胞。
[0003]作為細(xì)胞毒性劑的綠膿桿菌外毒素A (PEA)(參見美國(guó)專利US4，545，985和中國(guó)專利申請(qǐng)CN200810051112.4)是由613個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽。對(duì)PEA分子的X射線晶體學(xué)研究和突變分析顯示，PEA分子包括三個(gè)與產(chǎn)生細(xì)胞毒性相關(guān)的結(jié)構(gòu)區(qū)域:負(fù)責(zé)與敏感細(xì)胞結(jié)合的氨基末端細(xì)胞受體結(jié)合區(qū)(I區(qū))；負(fù)責(zé)毒素分子向細(xì)胞溶膠內(nèi)轉(zhuǎn)位的中間轉(zhuǎn)位區(qū)(II區(qū))；以及負(fù)責(zé)失 活蛋白質(zhì)并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡的羧基末端酶促活性區(qū)(III區(qū))。其中I區(qū)包括介導(dǎo)細(xì)胞結(jié)合的Ia區(qū)(氨基酸1-252)和目前尚未明確其功能的Ib區(qū)(氨基酸365-399)?？梢允褂蒙锘瘜W(xué)或重組DNA技術(shù)修飾PEA分子，以制備PEA分子中有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失或取代的各種修飾的PEA片段，例如，一般將刪去了 PE分子中Ia區(qū)，只含有酶促和轉(zhuǎn)位區(qū)，分子量約為40KDa的PE-A蛋白質(zhì)稱為PE40?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)刪除PE的Ia和大部分Ib區(qū)(氨基酸365-380)后，即PE38毒素分子，該分子仍保留其特異性細(xì)胞毒性，但降低了非特異性毒性(例如參見Hwang et al.，Cell48 =129-136, 1987 ;美國(guó)專利4，892，827和歐洲專利0261671)。同時(shí)，如果將PE38分子中C末端氨基酸RKEDL進(jìn)行突變?yōu)榕c內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體結(jié)合密切的KDEL則細(xì)胞活性能夠提高10倍以上。
[0004]許多現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)已描述了 PEA與各種生長(zhǎng)因子、抗體、激素或⑶4融合，以產(chǎn)生可選擇性地導(dǎo)向并殺傷具有不同細(xì)胞膜蛋白(受體或抗原)之靶細(xì)胞的雜交蛋白質(zhì)的方法。美國(guó)專利5，428，143公開了用于選擇性殺傷HIV感染之細(xì)胞的雜交蛋白質(zhì)及編碼該雜交蛋白質(zhì)的嵌合基因的構(gòu)建。其中所說的雜交蛋白質(zhì)由含有HIV結(jié)合位點(diǎn)的人CD4和可殺死HIV感染之細(xì)胞毒性蛋白質(zhì)(PE40)組成。
[0005]作為與本發(fā)明更為相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)，PCT國(guó)際專利申請(qǐng)W093/15751公開了將促性腺激素釋放激素(GnRH)肽直接偶聯(lián)到綠膿桿菌外毒素分子上制成的嵌合蛋白質(zhì)分子。據(jù)稱，投用這樣的嵌合分子可導(dǎo)致腦垂體中攜帶GnRH受體的細(xì)胞的破壞，并伴有性激素分泌的降低，因而可望將其用于動(dòng)物不育化及抑制類固醇激素相關(guān)腫瘤的增殖。
[0006]與本發(fā)明直接相關(guān)的是本 申請(qǐng)人:持有的中國(guó)專利CN200810051112.4提供了一種由突變的人促性腺激素與重組綠膿桿菌外毒素A突變體融合而成的嵌合毒素，特征在于其中所說的突變的人促性腺激素部分作為導(dǎo)向劑，可與表面上具有相應(yīng)激素受體的外周性腺激素反應(yīng)性或非反應(yīng)性腫瘤細(xì)胞特異結(jié)合，并且當(dāng)內(nèi)化到這些腫瘤細(xì)胞中之后，所說的綠膿桿菌外毒素部分作為細(xì)胞毒性劑可有效地殺傷這些腫瘤靶細(xì)胞。其中所說的作為導(dǎo)向的激素是突變的促性腺激素釋放激素(mGnRH)，其中所說的重組綠膿桿菌外毒素是PE38KDEL(PE38m4a)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]根據(jù)本 申請(qǐng)人:持有的中國(guó)專利CN200810051112.4，本發(fā)明在具體基因工程操作和產(chǎn)物純化方面進(jìn)行了進(jìn)一步發(fā)明改造，使之結(jié)構(gòu)更忠實(shí)于GnRH天然結(jié)構(gòu),純化工藝更簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)實(shí)用，收率顯著提高。
[0008]根據(jù)這一發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的mGnRH是以人工體外基因合成的形式連接到PE分子中相當(dāng)于Ia區(qū)基因的位置。
[0009]根據(jù)這一發(fā)明這一目的的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的mGnRH基因是以大腸桿菌偏性密碼子為主體的基因形式合成的。
[0010]這一發(fā)明的另一個(gè)目的是提供含有細(xì)胞毒性有效量的上述mGnRH-PE38m4a嵌合毒素，以及一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑的藥物組合物。
[0011]這一發(fā)明的再一個(gè)目的涉及上述藥物組合物在治療多種與促性腺激素受體有關(guān)的腫瘤中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案是將有利于二硫鍵形成的轉(zhuǎn)硫酶A和SUMO蛋白酶識(shí)別底物序列與中國(guó)專利CN200810051112.4中mGnRH_PE38m4a基因依次拼接形成融合表達(dá)，并去除了 mGnRH-PE38m4a原來(lái)N端作為酶切連接序列的Met-Gly氨基酸。
[0013]本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案是SUMO蛋白酶識(shí)別底物序列N端增加了具有金屬螯合介質(zhì)親和特性的組氨酸標(biāo)簽His6。
[0014]本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案是利用20mM咪唑存在下進(jìn)行金屬螯合介質(zhì)純化，一步獲得90%純度的融合蛋白。
[0015]本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案是利用高特異性和高活性SUMO蛋白酶對(duì)純化的融合蛋白進(jìn)行酶切，使標(biāo)簽部分與mGnRH-PE38m4a目的蛋白分離，在20mM咪唑存在下進(jìn)行金屬螯合介質(zhì)純化以流川形式獲得95%純度的mGnRH-PE38m4a目的蛋白。
[0016]本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選方案是高度純化的目的蛋白質(zhì)在多種保護(hù)劑存在下，制備成具有抗腫瘤能力的藥物組合物。
[0017]本文中所使用術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)向劑”，是指能夠只與待殺傷的靶細(xì)胞表面上的受體或抗原特異結(jié)合的分子或配體?！皩?dǎo)向劑”有時(shí)也稱為“識(shí)別分子”或“配體結(jié)合劑”。這樣的識(shí)別分子的例子是可識(shí)別靶細(xì)胞的抗體或其片段，可與靶細(xì)胞上的分子特異結(jié)合的生長(zhǎng)因子、淋巴因子、細(xì)胞因子、抗原及激素等。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，所說的導(dǎo)向劑是小分子突變的性腺類激素(mGnRH)。
[0018]GnRH是由Schally等于1971年從動(dòng)物體內(nèi)分離純化，闡明其結(jié)構(gòu)后又人工合成的，并以此獲得了 1976年的Nobel獎(jiǎng)。GnRH為一個(gè)不含游離氨基酸與羧基的十肽，其分子結(jié)構(gòu)為:P-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro_Gly-NH2,其中第 4-6 位氨基酸可能形成β轉(zhuǎn)折，呈發(fā)夾形，適合與受體結(jié)合，第2和3位對(duì)生物活性很重要，第6位對(duì)維持發(fā)夾構(gòu)象起重要作用，第I位與第4-10位氨基酸均參與受體結(jié)合，若置換以上氨基酸殘基可導(dǎo)致活力喪失或呈幾何級(jí)增強(qiáng)。
[0019]在體內(nèi)很容易被蛋白水解酶降解，故其半衰期僅4_8min。其水解酶肽酶的主要作用部位是Gly6-Leu7和Pro9-GlylO-NH2。為尋求高效且持久的LHRH類似物，通過對(duì)其肽鏈結(jié)構(gòu)中氨基酸的拾取或替換，已合成3000多種LHRH類似物。由于合成的LHRH半衰期長(zhǎng)，作用更強(qiáng)，所以比天然的LHRH更適于病人的治療。合成長(zhǎng)效的LHRH激動(dòng)劑的要求是穩(wěn)定分子結(jié)構(gòu)，使之不易被酶水解，增加與循環(huán)中的蛋白和胞膜的結(jié)合及提高對(duì)LHRH受體的親和力。如6位為D-氨基酸的類似物和取代GlylO酰胺基。這種LHRH激動(dòng)劑不僅耐蛋白酶水解作用較大，而且對(duì)受體有較高的親和力。若在第6位引入龐大的疏水基團(tuán)可進(jìn)一步增加與受體的親和力。這樣的置換穩(wěn)定了釋放激素類似物的“活性”構(gòu)型，提高了與循環(huán)中蛋白的結(jié)合，從而延長(zhǎng)半衰期。早期開發(fā)的LHRH拮抗劑的理論基礎(chǔ)與LHRH激動(dòng)劑相似，可改善與受體結(jié)合，卻產(chǎn)生不易接受的組胺釋放副作用。因此，開發(fā)下一代的LHRH拮抗劑的焦點(diǎn)集中到既提高效能又減少組胺釋放這一方面。
[0020]越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，某些激素和細(xì)胞因子的受體在腫瘤和癌細(xì)胞上有異常高的表達(dá)，如EGFR、LHRHR等。而且，激素和細(xì)胞因子的分子相對(duì)較小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，基因操作方便，因此，作為免疫毒素的載體有很大的可行性。目前有很多的細(xì)胞因子和激素被利用來(lái)做免疫毒素的載體，如IL-2、IL-4、EGF、LHRH等，并且表達(dá)的重組免疫毒素蛋白均具有特異性細(xì)胞毒效應(yīng)。GnRH受體最早發(fā)現(xiàn)于垂體，隨著近年來(lái)對(duì)GnRH及其受體研究的進(jìn)一步深入，越來(lái)越多的臨床和實(shí)驗(yàn)表明，垂體外組織也有GnRH及其受體的分布，并且垂體外正常組織及其相應(yīng)部位癌組織GnRH受體性質(zhì)有許多不同。有文獻(xiàn)報(bào)道，它們所介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路不同，也有報(bào)道，癌細(xì)胞表 面的GnRH受體可能介導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡。另外，癌細(xì)胞膜表面受體的親和力通常大于相應(yīng)正常組織細(xì)胞膜表面受體親和力。據(jù)報(bào)導(dǎo)，在脊椎動(dòng)物牛蛙腦垂體和后腦的細(xì)胞上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 3種LHRH受體的亞型，人體中目前發(fā)現(xiàn)兩種亞型，但其分布和功能各不相同，I型受體與I型GnRH結(jié)合，II型受體與II型GnRH結(jié)合，二者之間交叉反應(yīng)極低。已經(jīng)有大量的實(shí)驗(yàn)證明:(I)人類正常性腺組織(包括子宮內(nèi)膜、子宮肌層、卵巢和睪丸)，胎盤等細(xì)胞膜上有低親和力GnRH受體的分布。(2)其他正常組織心、肝、脾、肺、腎、肌肉等細(xì)胞膜上無(wú)GnRH受體存在。(3) GnRH受體主要分布在肝癌、胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮肌瘤、乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞膜上。
[0021]本文所使用的術(shù)語(yǔ)“mGnRH”是指能夠與表面存在GnRH受體的細(xì)胞結(jié)合，并引導(dǎo)蛋白質(zhì)分子作用在靶細(xì)胞上，引起細(xì)胞病變或死亡，其作用機(jī)理等同于或高于天然GnRH或其類似物。
[0022]天然GnRH也稱為促黃體激素釋放激素(LHRH或LRH)，其為具有如下所示的氨基酸序列的十肽分子:
[0023]pGlu-HiS-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly
[0024]由于GnRH為導(dǎo)向的蛋白質(zhì)在基因工程表達(dá)必須添加啟動(dòng)子和基因酶切位點(diǎn)進(jìn)行連接，故中國(guó)專利CN200810051112.4中的mGnRH_PE38m4a融合蛋白的mGnRH氨基酸序列的增加了啟動(dòng)密碼子ATG和調(diào)整正確開放閱讀框架添加了 GGC密碼子，所以其表達(dá)產(chǎn)物為十二肽分子:
[0025]Met-Gly-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly
[0026]本發(fā)明所涉及的融合毒素中設(shè)計(jì)的導(dǎo)向部分為突變的GnRH氨基酸序列為:Glu_His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly
[0027]式中所用的氨基酸符號(hào)為本領(lǐng)域通用的三字母縮寫符號(hào)，其中為了基因連接方便在基因合成時(shí)于N末端去除了 Met-Gly的密碼子，并且將新序列中第六位氨基酸于基因水平上仍保留突變的Trp，以使表達(dá)產(chǎn)物與相應(yīng)受體結(jié)合能力的增強(qiáng)；同時(shí)將大腸桿菌偏性密碼子引入到其中，以使表達(dá)產(chǎn)物適合在大腸桿菌中表達(dá)。
[0028]我們對(duì)按中國(guó)專利CN200810051112.4發(fā)明方法制備的mGnRH_PE38m4a融合蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性分析已清楚地證明，mGnRH-PE38m4a具有與包括Hela細(xì)胞在內(nèi)多種器官來(lái)源的腫瘤細(xì)胞具有殺傷活性，而對(duì)多種組織來(lái)源的正常細(xì)胞則沒有這種特異殺傷活性(參見中國(guó)專利200810051112.4實(shí)施例2)。同時(shí)利用本發(fā)明方法制備的mGnRH_PE38m4a與原產(chǎn)物進(jìn)行了活性對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明專利制備的樣品活性優(yōu)于原工藝產(chǎn)品。
[0029]本文中所使用術(shù)語(yǔ)“IC5(I”是指抑制靶細(xì)胞蛋白質(zhì)合成達(dá)到對(duì)照組的50%所需的融合蛋白的濃度。本發(fā)明中使用MTT標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定蛋白質(zhì)對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度。
[0030]本發(fā)明進(jìn)一步涉及以重組DNA技術(shù)生產(chǎn)多種類蛋白質(zhì)串聯(lián)融合表達(dá)的靶特異性、細(xì)胞毒性重組PE融合蛋白質(zhì)的方法，該方法包括:(I)提供攜帶PE38KDEL基因的表達(dá)載體；(2)人工合成分子串聯(lián)連接`的編碼轉(zhuǎn)硫酶A和SUMO酶切底物的核苷酸序列，并將其克隆到線性化的步驟(1)的表達(dá)載體中；(3)用步驟(2)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；
(4)在適于表達(dá)所說的由轉(zhuǎn)硫酶A和SUMO酶切底物和mGnRH-PE38m4a組成的融合蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所說的被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；(5)從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收并純化所說的融合蛋白質(zhì)。
[0031]用于構(gòu)建本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)的PE分子可以是缺失了 Ia區(qū)和大部分Ib區(qū)的天然PE分子，但也可以并且較好是經(jīng)過修飾的PE38m4a分子。例如，這樣經(jīng)過修飾的PE38KDEL分子可以是其中I~4個(gè)半胱氨酸(Cys265、Cys287、Cys372和Cys379)被刪除或被其他氨基酸如 Lys-Asp-Glu-Leu 取代的 PE38m4a。
[0032]由于作為本發(fā)明抗腫瘤嵌合毒素中導(dǎo)向劑或稱識(shí)別分子的小分子激素的分子量均相對(duì)較小(10肽)，所以可使用通用的DNA合成儀在1000A固相載體上合成編碼這些激素或其變異體的核苷酸序列。為了便于與游離的或攜帶于特定重組載體上的PE編碼序列連接，可在合成的融合蛋白基因序列的5’和/或3’端引入適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶(如NcoI)酶切位點(diǎn)，并造成適于連接的粘性末端?？砂凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的重組技術(shù)，克隆編碼這些合成的閱讀框架通暢的基因(或以其cDNA或基因組DNA形式)，DNA重組操作中，一般使用標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增所需的基因片段并造成適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)。使用限制性酶切法鑒定序列連接方向的正確性和可能的突變，最后以DNA測(cè)序進(jìn)行序列確認(rèn)。
[0033]這里應(yīng)特別指出的是，由于相對(duì)于細(xì)胞毒性部分PE38m4a來(lái)說，導(dǎo)向部分mGnRH的分子量小得多，所以由兩者產(chǎn)生的融合蛋白質(zhì)中的PE38m4a部分很可能形成新的二級(jí)空間構(gòu)象，導(dǎo)致PE38m4a部分對(duì)mGnRH的卷曲，影響融合蛋白質(zhì)的受體結(jié)合的程度。然而通過技術(shù)人員計(jì)算機(jī)分析PE38m4a部分的卷曲并不能影響mGnRH的分子暴露和與受體結(jié)合。
[0034]重組蛋白質(zhì)基因?qū)⒈豢刹倏v地連接到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)控制序列上，如連接到適于在大腸桿菌中使用的T7、trp或λ啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)上?？墒褂靡阎霓D(zhuǎn)化方法，如適于原核細(xì)胞的氯化鈣處理法或適于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的電穿孔法將本發(fā)明的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到選擇的宿主細(xì)胞中?？苫谫|(zhì)粒上所含抗生素抗性基因所賦予的抗生素抗性來(lái)選擇被轉(zhuǎn)化的陽(yáng)性細(xì)胞。一旦表達(dá)了所需的融合蛋白質(zhì)，即可按照本領(lǐng)域已知的方法分離并純化該融合蛋白質(zhì)。例如，可從發(fā)酵培養(yǎng)物中離心收集菌體細(xì)胞并用溶菌酶和超聲波裂解之，然后超速離心并在低濃度磷酸鹽(約20mM)溶液中加入飽和硫酸銨進(jìn)行分步沉淀。依次經(jīng)離子交換層析(IEC)和IMAC層析純化所需的mGnRH-PE38KDEL重組蛋白質(zhì)。
[0035]一般說來(lái)，使用聚丙烯酰胺凝膠以SDS-PAGE電泳法分析各柱層析洗脫部分，并使用多克隆抗PE抗血清和以免疫印跡法監(jiān)測(cè)之。對(duì)重組融合蛋白質(zhì)純化產(chǎn)物進(jìn)行腫瘤細(xì)胞抑制試驗(yàn)以檢測(cè)融合蛋白質(zhì)的細(xì)胞毒性(IC5tl)15
[0036]可將本發(fā)明的mGnRH_PE38m4a融合蛋白質(zhì)作為基本活性成分，并加入一種或多種醫(yī)藥上可接受的載體或賦形劑，制成適于臨床應(yīng)用的藥物組合物。所說的載體或賦形劑包括但不只限于磷酸鹽緩沖鹽水、生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根據(jù)所治療的疾病的不同，可在本發(fā)明的藥物組合物中加入一種或多種與本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)有輔助或協(xié)同作用的其他天然的、合成的或重組的活性化合物。另外，可在本發(fā)明的藥物組合物中加入低分子量肽、甘氨酸或賴氨酸及金屬陽(yáng)離子(如Zn2+、Mn2+、Mg2+和Ca2+)的蛋白質(zhì)保護(hù)劑，以及聚乙二醇、羧甲基纖維素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的穩(wěn)定劑。
[0037]可以通過常規(guī)給藥途徑，特別是胃腸道外途徑投用本發(fā)明的藥物組合物，例如通過靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或粘膜內(nèi)途徑給藥。本發(fā)明藥物組合物的有效劑量范圍可從幾毫微克至幾十毫克 /公斤體重/天，但針對(duì)每個(gè)特定病人的具體用藥劑量將根據(jù)待治療疾病或病理狀態(tài)的性質(zhì)及嚴(yán)重程度、病人的年齡、體重、對(duì)藥物的反應(yīng)能力及給藥方式等因素而定。
[0038]應(yīng)特別指出的是，盡管更深入的作用機(jī)理尚不明確，但我們的實(shí)驗(yàn)室已證明本發(fā)明的mGnRH-PE38m4a蛋白質(zhì)對(duì)包括結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞、卵巢癌0VCAR3細(xì)胞、子宮頸腺癌HeLa細(xì)胞及肝癌H印G_2細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞系均有明顯的特異結(jié)合活性和細(xì)胞毒性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1顯示用于表達(dá)mGnRH_PE38m4a的重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0040]以下借助實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以意識(shí)到，這些實(shí)施例并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明待批權(quán)利要求范圍的限制。
[0041]實(shí)施例1:mGnRH-PE38m4a融合蛋白質(zhì)的制備
[0042](I)重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
[0043]a.基因合成:在中國(guó)專利200810051112.4實(shí)施例1中構(gòu)建了表達(dá)載體PET-1 la-mGnRH-PE38m4a，其中mGnRH和PE38m4a基因之間利用NdeI內(nèi)切酶進(jìn)行連接，本發(fā)明中參考已經(jīng)公開認(rèn)知的轉(zhuǎn)硫酶A和SUMO酶識(shí)別底物序列，人工體外合成如下序列:[0044]NcoI內(nèi)切酶+轉(zhuǎn)硫酶A+HIS6+SUM0酶識(shí)別底物序列+mGnRH+Ndel內(nèi)切酶基因序列SEQ ID NO:1，本合成序列經(jīng)Ncol、NdeI雙酶切形成粘性末端，以正確的閱讀框架在T4連接酶(Promega)存在下插入到同樣酶切的PET-lla-mGnRH_PE38m4a載體中，構(gòu)建轉(zhuǎn)硫酶A+HIS6+SUM0酶識(shí)別底物序列+mGnRH+PE38m4a融合蛋白雙鏈表達(dá)基因，所述融合蛋白重組基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.2
[0045]b.構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM105細(xì)胞，并將被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)于含氨芐青霉素(50μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中，以擴(kuò)增質(zhì)粒DNA。培養(yǎng)完成后，破碎細(xì)胞，離心收集質(zhì)粒并純化質(zhì)粒DNA測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒將被轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)菌株，用酶切鑒定法和瓊脂糖凝膠(2%)電泳法進(jìn)行鑒定，然后陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行DNA序列分析。圖1顯示了重組質(zhì)粒 PET-lla-TRXA-SUM0-mGnRH-PE38m4a 的構(gòu)建。
[0046](2) TRXA-SUM0-mGnRH-PE38m4a融合蛋白質(zhì)的表達(dá)及產(chǎn)物的純化:
[0047]將攜帶重組基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21 (DE3)(含有T7RNA聚合酶基因)培養(yǎng)在含有氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB瓊脂平皿上。培養(yǎng)后挑選氨芐青霉素抗性菌落，于含氨芐青霉素(50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，當(dāng)A_達(dá)到約0.4~0.6時(shí)加入ImM異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG)(終濃度ImM)，37°C繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，以誘導(dǎo)目的產(chǎn)物的表達(dá)。然后離心分離細(xì)胞和培養(yǎng)基，并將含有目的蛋白質(zhì)的菌體中加入緩沖液成分，終濃度達(dá)50mM Tris-HCl,pH8.0,lmM EDTA，超生破碎，4°C離心(20，OOOg，30 分鐘)，取上清(可溶性部分)即為融合蛋白粗提物。
[0048]粗提物經(jīng)過緩沖液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia),用含有O~0.5M NaCl的TE緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8.0, ImM EDTA)連續(xù)梯度洗脫，并收集蛋白質(zhì)各組分峰部分。目的組分峰部分經(jīng)小型中空纖維超濾器(Milipore)作用30分鐘超濾濃縮換液后，使?jié)饪s物通過用20mM Tris-HCl, pH8.0,0.15M NaCl，20mM咪唑緩沖液平衡過的 XKl.6 X IOcm IMAC 柱(Pharmacia)，并用含有 0.15M NaCl 的緩沖液(20mM Tris.HCl，pH8.0,200mM咪唑)洗脫。收集目的蛋白峰部分并進(jìn)行10倍稀釋，利用SUMO酶切目的蛋白，30°C，4hr，并再次以相同條件進(jìn)行IMAC液相色譜柱，收集流川峰部分并在30mM PBS中徹底透析，透析后于_20°C下儲(chǔ)存?zhèn)溆?，如此純化的蛋白質(zhì)SEQ ID N0.3，純度> 97%。
[0049]實(shí)施例2:利用MTT法測(cè)定兩種工藝制備的mGnRH_PE38m4a對(duì)Hela細(xì)胞活性作用。
[0050]細(xì)胞毒性試驗(yàn):
[0051]將培養(yǎng)的Hela單層細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，吹打收集細(xì)胞懸液，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板記數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為60000個(gè)/ml，按照80 μ I/孔加入到96孔培養(yǎng)板中(每孔5000細(xì)胞)，5% CO2, 37°C條件下培養(yǎng)4h。調(diào)整兩種工藝制備的mGnRH-PE38m4a蛋白質(zhì)樣品濃度為lmg/ml，定量的樣品經(jīng)過濾除菌，按等倍稀釋法將不同量的樣品加入各細(xì)胞孔中，然后補(bǔ)足培養(yǎng)基，使之總體積為100ul，5% C02，37°C條件下培養(yǎng)12h，培養(yǎng)板各孔中分別加入100 μ I的MTT染色試劑，5% CO2, 37°C條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h，于490nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，計(jì)算融合蛋白對(duì)Hela腫瘤細(xì)胞的50%蛋白質(zhì)合成抑制的濃度(IC50)結(jié)果見表1。
[0052]表1:兩種工藝產(chǎn)物對(duì)比
[0053]
【權(quán)利要求】
1.靶特異性雙突變體融合蛋白質(zhì)，所述的融合蛋白質(zhì)從N末端到C末端包括:首位氨基酸為谷氨酰胺(Glu)的、且第六位氨基酸被修飾的促性腺激素釋放激素的氨基酸殘基1-10以及截短的綠膿桿菌外毒素A氨基酸殘基，優(yōu)選氨基酸序列為SEQ ID N0.3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白質(zhì)，所述的截短的綠膿桿菌外毒素A氨基酸殘基為PE40、PE38、PE35、PE23或已知結(jié)構(gòu)片段，也可以是突變其最后4個(gè)氨基酸為KDEL的PE40、PE38、PE35、PE23已知結(jié)構(gòu)片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的融合蛋白質(zhì),其中所說的蛋白質(zhì)由Met+TrxA+HisTag+Sumo蛋白酶識(shí)別序列+mGnRH+突變的PE片段組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中所述的促性腺激素釋放激素的氨基酸殘基第6位被修飾，包括促性腺激素釋放激素的第6位Gly被D-Trp或其他氨基酸取代。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的融合蛋白質(zhì)，所述的氨基酸殘基第10位Gly被乙酰化。
6.融合蛋白重組基因，它的核苷酸序列為SEQID N0.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的融合蛋白質(zhì)，其中所說的融合蛋白質(zhì)的氨基酸序列為SEQIDN0.3。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-6所述的融合蛋白質(zhì)，其中所說的嵌合毒素蛋白質(zhì)是以DNA融合和重組技術(shù)制備的。
9.權(quán)利要求1-6所述的融合蛋白質(zhì)在生產(chǎn)抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求6所述的融合蛋白質(zhì)的制備方法，包括如下步驟: (1)構(gòu)建攜帶重組融合蛋白雙鏈表達(dá)基因的可表達(dá)質(zhì)粒載體，所述融合蛋白重組基因的核苷酸序列為SEQ ID N0.2 ； (2)融合蛋白質(zhì)的表達(dá):將攜帶重組基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中表達(dá)； (3)將菌體破碎，離心取上清即為融合蛋白粗提物；在咪唑存在下進(jìn)行金屬螯合介質(zhì)純化； (4)用SUMO蛋白酶酶切，并利用金屬螯合介質(zhì)將標(biāo)簽部分與目的蛋白分離、純化。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的融合蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述的純化為:粗提物經(jīng)過緩沖液平衡的DEAE-S印harose Fast Flow柱，用含有O~0.5M NaCl的TE緩沖液(20mM Tris-HCl,pH8.0,lmM EDTA)連續(xù)梯度洗脫，并收集蛋白質(zhì)各組分峰部分；目的組分峰部分經(jīng)中空纖維超濾器作用20-40分鐘超濾濃縮換液后，使?jié)饪s物通過用20mMTris-HCl, pH8.0,0.15M NaCl，20mM 咪唑緩沖液平衡過的 XKl.6 X IOcm IMAC 柱，并用含有0.15M NaCl的緩沖液(20mM Tris.HC1，pH8.0，200mM咪唑)洗脫，收集目的蛋白峰部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的融合蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述的純化為:將收集目的蛋白峰部分并稀釋10倍，利用SUMO酶切目的蛋白，30°C，4hr，并再次進(jìn)行IMAC液相色譜，收集蛋白質(zhì)流川峰部分并在30mM PBS中徹底透析，透析后于_20°C下儲(chǔ)存?zhèn)溆?，得到純化的融合蛋白質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求9所述的融合蛋白質(zhì)的制備方法，其特征在于所述的攜帶重組融合蛋白雙鏈表達(dá)基因的可表達(dá)質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)如圖1所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK103864938SQ201410108673
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】張俊英, 侯曉允 申請(qǐng)人:北京博翱泰生物技術(shù)有限公司