核酸適配體及其衍生物、篩選方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的核酸適配體及其衍生物、篩選方法和應(yīng)用，所述核酸適配體為a：5’-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCXCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，b：與a所述核酸適配體具有60%以上同源性且具有檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞功能；c：在嚴(yán)緊條件下，與a或b的序列進(jìn)行雜交的序列；或d：a、b或c的核酸適配體序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列，本發(fā)明的核酸適配體的篩選方法可以極大的降低篩選重復(fù)次數(shù)；本發(fā)明還提供所述核酸適配體或核酸適配體衍生物在檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞或制備檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利說(shuō)明】核酸適配體及其衍生物、篩選方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的核酸適配體及其衍生物、篩選方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人鼻咽癌為我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響人類(lèi)健康，由于鼻咽部位較深且位置隱蔽，以致鼻咽癌早期癥狀和體征不明顯，容易漏診、誤診，延誤最佳治療時(shí)機(jī)，早期診斷鼻咽癌，可有效提聞治療的效果和患者生存率。
[0003]鼻咽癌早期診斷的現(xiàn)狀及進(jìn)展，《醫(yī)療診斷》，2011，1，7-12，介紹了鼻咽癌早期診斷的技術(shù)手段，比如免疫PCR (IPCR)方法。Paramita等采用的兩步EBV-1gA ELIAS法，相對(duì)于免疫印記法，靈敏性和特異性分別從85.4%和90.1%上升到96.7%和98%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別從78.7%和97.3%增加到93.7%和97.5%。tong等構(gòu)建了一個(gè)從混合鼻咽癌組織來(lái)源的cDNA文庫(kù)，并從鼻咽癌患者和健康人群血清中分離出31種腫瘤相關(guān)蛋白，表明血清中抗腫瘤相關(guān)抗原的自身抗體可用于鼻咽癌早期篩查診斷等等。但是利用蛋白抗體等的方法，親和力和特異性不夠理想，具有免疫原性，生產(chǎn)成本高，不利于保藏。
[0004]SELEX法篩選鼻咽癌核酸適配子的研究，山東醫(yī)藥2012年第52卷第23期，介紹了利用SELEX法篩選鼻咽癌核酸適配子，引物序列如下:上游引物(BI)序列:5’-FITC-ACCGACCGTGCTGGACTCT-3’，下游引物(B2)序列:5，-CGCAACGCTCGCTCATACT_3，。鼻咽癌細(xì)胞株為EB病毒陽(yáng)性低分化鼻咽癌細(xì)胞株(C666)，采用傳統(tǒng)的SELEX法經(jīng)過(guò)10輪循環(huán)篩選初步建立了鼻咽癌適配體庫(kù)，但是此研究?jī)H僅停留在對(duì)部分核酸適配體進(jìn)行序列同源性分析上，并未對(duì)單個(gè)核酸適配體的親和力和特異性進(jìn)行研究，還需進(jìn)一步研究才有可能得到性質(zhì)優(yōu)良的核酸適配體，不利于核酸適配體的后續(xù)應(yīng)用。因此，開(kāi)展鼻咽癌細(xì)胞核酸適配體篩選的相關(guān)工作，獲得具體的高親和力、高特異性地識(shí)別鼻咽癌細(xì)胞的核酸適配體是很有必要的。
[0005]Aptamers from Cell-Based Selection for Bioanalytical Applications，Chemical Reviews，2013，113，2842-2862，作者介紹了針對(duì)細(xì)胞核酸適配體的篩選，一般需要20輪左右的篩選，才能獲得高親和力的核酸適配體。由此可見(jiàn)，傳統(tǒng)的cell-SELEX方法周期長(zhǎng)，勞動(dòng)量大，成本高。迫切需要發(fā)展高效快速的細(xì)胞核酸適配體的方法，以滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)的科學(xué)、醫(yī)療需求。
[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種親和力強(qiáng)、特異性高、無(wú)免疫原性的檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的核酸適配體，還提供一種效率高，可有效減少篩選循環(huán)次數(shù)的核酸適配體的篩選方法，還提供所述核酸適配體在檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞中的應(yīng)用，還提供所述核酸適配體在制備檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng)用。
[0007] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的核酸適配體，所述核酸適配體序列為[0008]a: 5 ’ -CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCXCCTGCTGACTGAACCTGACG-3 ’，所述 X 為
[0009]5’ -TGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGG-3’、
[0010]5， -TGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGA-3，或[0011 ] 5 ’ -TAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTG-3，；
[0012]上述3個(gè)序列表示為，Seq ID NO:1:
[0013]5，-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGGCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，Seq ID NO:2:
[0014]5，-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGACCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，Seq ID NO:3:
[0015]5，-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTGCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’。
[0016]b:與a所述核酸適配體具有60%以上同源性且具有檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞功能；[0017]c:在嚴(yán)緊條件下，與a或b的序列進(jìn)行雜交的序列；或
[0018]d:a、b或c的核酸適配體序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。
[0019]所述核酸適配體在保持整體結(jié)構(gòu)不變的前提下，核酸適配體的核苷酸序列上的任一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。即所述核酸適配體連接或標(biāo)記了磷酸、甲基、氨基、巰基、放射性同位素。
[0020]一種核酸適配體衍生物，為所述核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯衍生物或核酸適配體的相對(duì)應(yīng)的肽核酸。
[0021]本發(fā)明還提供一種所述核酸適配體的制備方法，包括以下步驟，
[0022]1、合成以下序列所示的隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)(隨機(jī)ssDNA文庫(kù))和引物:
[0023]隨機(jī)單鏈DNA文
[0024]庫(kù):5，-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTGCTGACTGAACCTGACG-3，(Seq ID NO: 4 )，N 表示 A 或 G 或 C 或 T。
[0025]5’ 端正向引物:5’ -FAM-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGC-3’，正向引物序列為:
[0026]5’ -CGTTCGTCAGGAGTAGAGGC-3’(Seq ID NO:5)，F(xiàn)AM 為熒光素；
[0027]3’ 端反向引物:5’ -Biotin-CGTCAGGTTCAGTCAGCAGG-3’，反向引物序列為:
[0028]5’ -CGTCAGGTTCAGTCAGCAGG-3’(Seq ID N0:6)，Biotin 為生物素，和
[0029]鏈酶親和素修飾的瓊脂糖微球；
[0030]2、cell-SELEX 篩選
[0031]2.1使無(wú)關(guān)序列和人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞(陽(yáng)性細(xì)胞)接觸，時(shí)間優(yōu)選為15min，得到預(yù)處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞；無(wú)關(guān)序列是指不與人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞特異識(shí)別、結(jié)合的序列。
[0032]人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的培養(yǎng)、處理方法為，培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞至基本鋪滿(mǎn)瓶底，去除培養(yǎng)基，后用緩沖液洗滌。
[0033]2.2使隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和預(yù)處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞接觸，孵育，孵育時(shí)間優(yōu)選為30min，得到處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞；
[0034]2.3將上述步驟2.2得到的處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞和單壁碳納米管接觸，篩選，得到CNE2細(xì)胞的特異核酸適配體文庫(kù)；所述人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞和單壁碳納米管的配比為10-30nmol/mg,最優(yōu)選為25.6nmol/mg。
[0035]所述接觸包括孵育或/和洗滌，所述篩選包括在上述步驟2.2得到的處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞和單壁碳納米管接觸后的細(xì)胞中加入無(wú)菌水，沸水浴中加熱，離心，取上清。
[0036]3、對(duì)步驟2的CNE2細(xì)胞的特異核酸適配體文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增的雙鏈DNA ；
[0037]4、將步驟3的擴(kuò)增的雙鏈DNA和鏈酶親和素修飾的瓊脂糖微球接觸，孵育，孵育時(shí)間優(yōu)選為30min，分離，變性處理，分離，得到單鏈DNA文庫(kù)；
[0038]所述變性處理，分離的方法是加入強(qiáng)堿性溶液，如氫氧化鈉溶液，時(shí)間優(yōu)選為15min,使雙鏈DNA變性，離心，收集上清液，將上清液過(guò)除鹽柱后收集滴下的溶液，得到單鏈DNA文庫(kù)；
[0039]5、陰性篩選:使無(wú)關(guān)序列和人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞接觸，得到處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞(陰性細(xì)胞);將步驟5得到的單鏈DNA文庫(kù)和處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞接觸，收集細(xì)胞接觸后的溶液；
[0040]6、多輪篩選:將步驟5得到的細(xì)胞接觸后的溶液替代步驟2的隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)，重復(fù)步驟2-5至少一次，重復(fù)次數(shù)優(yōu)選為5-6次，分析，確認(rèn)，得到所述核酸適配體。
[0041]所述分析，確認(rèn)的方法為，在步驟2得到的CNE2細(xì)胞的特異核酸適配體文庫(kù)中加入胎牛血清，使用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)單鏈DNA文庫(kù)對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的識(shí)別能力，測(cè)序,富集度高的為所述核酸適配體。
[0042]本發(fā)明還提供一種所述核酸適配體或所述核酸適配體衍生物在人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用。
[0043]本發(fā)明還提供一種所述核酸適配體或所述核酸適配體衍生物在制備檢測(cè)人鼻咽癌藥物或試劑盒中的應(yīng)用。
[0044]本發(fā)明的有益效果是,核酸適配體(aptamer)是通過(guò)指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選得到的，能特異結(jié)合靶物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸(ssDNA或ssRNA)。核酸適配體與抗體功能類(lèi)似，但是與抗體相比具有更多的優(yōu)勢(shì)，具有更高的親和力與特異性；無(wú)免疫原性；能夠化學(xué)合成，成本低；可進(jìn)行標(biāo)記；穩(wěn)定性好，易于保存等優(yōu)點(diǎn)。核酸適配體的靶分子更為廣泛，包括金屬離子、氨基酸、核酸、多肽、蛋白質(zhì)，并從單一靶標(biāo)擴(kuò)展至完整的病毒顆粒及細(xì)胞等復(fù)合物靶標(biāo)。因此，核酸適配體具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0045]傳統(tǒng)的細(xì)胞核酸適配體的篩選方法無(wú)需純化，在靶標(biāo)的天然狀態(tài)下和不知道細(xì)胞表面分子的情況下進(jìn)行篩選，并且一次性可以篩選出針對(duì)多種靶分子的核酸適配體。但是，其過(guò)程往往需要篩選20輪左右，周期長(zhǎng)，勞動(dòng)力大和成本高，因此發(fā)展快速高效的篩選方法顯得尤為重要。因?yàn)閱捂淒NA能夠通過(guò)J1-JI電子堆積作用纏繞在單壁碳納米管表面，所以可以很好的吸附單鏈DNA，從而吸附掉未與細(xì)胞結(jié)合的單鏈DNA，或者與細(xì)胞結(jié)合比較弱的非特異性吸附單鏈DNA，而那些與細(xì)胞的作用大于單壁碳納米管的核酸適配體仍然被保留在細(xì)胞表面。本發(fā)明利用單壁碳納米管能夠很好的吸附單鏈DNA的特點(diǎn)，將單壁碳納米管引入到篩選的過(guò)程中，降低非特異性吸附，有效地去除結(jié)合的單鏈DNA，并且不影響核酸適配體(aptamer)與細(xì)胞的結(jié)合。本發(fā)明的方法大大地提高了篩選的效率，節(jié)約了勞動(dòng)力和降低了成本。
[0046]本發(fā)明通過(guò)SELEX篩選得到的核酸適配體具有比蛋白抗體更高的親和力與特異性；無(wú)免疫原性；能夠體外化學(xué)合成，分子量小，可以對(duì)不同部位進(jìn)行修飾和取代，且序列穩(wěn)定，易于保存；便于標(biāo)記(不需要標(biāo)記的二抗)等。
[0047]采用本發(fā)明的核酸適配體進(jìn)行鼻咽癌細(xì)胞CNE2細(xì)胞的檢測(cè)時(shí)，操作簡(jiǎn)單、迅速，且核酸適配體的合成成本較抗體制備成本低,且周期短,重現(xiàn)性好。
[0048]本發(fā)明的可識(shí)別人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的核酸適配體均能特異性且高親和力的識(shí)別人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞，且結(jié)合能力強(qiáng)，解離常數(shù)均在納摩爾范圍以?xún)?nèi)。利用本發(fā)明的核酸適配體對(duì)其結(jié)合的靶分子進(jìn)行研究，可以得到其腫瘤標(biāo)志物，這對(duì)于肝癌的早期檢測(cè)具有重要意義，在肝癌的診斷方面有良好的應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049]圖1為本發(fā)明的碳納米管輔助的細(xì)胞核酸適配體制備、篩選的原理和主要步驟示意圖。
[0050]圖2為本發(fā)明利用mfold軟件模擬的TlO核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。
[0051]圖3為本發(fā)明利用mfold軟件模擬的Tll核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。
[0052]圖4為本發(fā)明利用mfold軟件模擬的T12核酸適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖。
[0053]圖5為本發(fā)明利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)核酸適配體對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的結(jié)合能力的檢測(cè)結(jié)果。
[0054]圖6為本發(fā)明利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)核酸適配體對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株HONE的結(jié)合能力的檢測(cè)結(jié)果。
[0055]圖7為本發(fā)明利用激光共聚焦檢測(cè)核酸適配體對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的結(jié)合能力及人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果，左圖為熒光成像，右圖為明場(chǎng)成像。
[0056]圖8為本發(fā)明利用流式細(xì)胞儀測(cè)定FAM-TlO核酸適配體結(jié)合CNE2細(xì)胞的解離常數(shù)繪制曲線(xiàn)。
[0057]圖9為本發(fā)明利用流式細(xì)胞儀測(cè)定FAM-Tll核酸適配體結(jié)合CNE2細(xì)胞的解離常數(shù)繪制曲線(xiàn)。
[0058]圖10為本發(fā)明利用流式細(xì)胞儀測(cè)定FAM-T12核酸適配體結(jié)合CNE2細(xì)胞的解離常數(shù)繪制曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0059]實(shí)施例1
[0060]本發(fā)明的用于檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的核酸適配體，所述核酸適配體序列為
[0061]a: 5 ’ -CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCXCCTGCTGACTGAACCTGACG-3 ’，所述 X 為
[0062]5’ -TGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGG-3’、
[0063]5’ -TGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGA-3’ 或
[0064] 5， -TAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTG-3，；[0065]上述3個(gè)序列表示為，Seq ID NO: 1，即TlO:
[0066]5，-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGTTTAGGATTTAGGGGCCTGCTGACTGAACCTGACG-3，，Seq ID NO:2,BP Tll:
[0067]5， -CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGACCTGCTGACTGAACCTGACG-3，，Seq ID NO:3，即 T12:
[0068]5，-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCTAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTGCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’。
[0069]b:與a所述核酸適配體具有60%以上同源性且具有檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞功能； [0070]c:在嚴(yán)緊條件下，與a或b的序列進(jìn)行雜交的序列；或
[0071]d:a、b或c的核酸適配體序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。
[0072]所述核酸適配體在保持整體結(jié)構(gòu)不變的前提下，核酸適配體的核苷酸序列上的任一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。即所述核酸適配體連接或標(biāo)記了磷酸、甲基、氨基、巰基、放射性同位素。
[0073]本發(fā)明還提供一種核酸適配體衍生物，為所述核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯衍生物或核酸適配體的相對(duì)應(yīng)的肽核酸。
[0074]實(shí)施例2
[0075]本發(fā)明的一種可用于檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的核酸適配體，所述核酸適配體的核苷酸序列包括以下序列1-序列3中的任意一條序列所示的DNA片段，且所述核酸適配體的5’端標(biāo)記有FAM，即:序列I為FAM-T10，序列2為FAM-T11，序列3為FAM-T12，
[0076]序列4為FAM-Lib，Lib的序列為:
[0077]5，-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3， (Seq ID NO:7)。
[0078]注』代表4、1\6、0中任一堿基(序列4作為對(duì)照序列，即陰性探針，也即圖5_圖7中的Lib)。
[0079]本實(shí)施例的上述序列1-序列3的可用于檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的核酸適配體采用以下篩選方法篩選得到，如圖1所示，具體包括以下步驟:
[0080]1.合成以下序列所示的隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物:
[0081]隨機(jī)單鏈DNA文
[0082]庫(kù):5，-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，
[0083]5，端引物:5，-FAM-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGC-3，，
[0084]3，端引物:5’ -Biotin-CGTCAGGTTCAGTCAGCAGG-3，，和
[0085]鏈酶親和素修飾的瓊脂糖微球；
[0086]2.cell-SELEX篩選獲得CNE2細(xì)胞特異核酸適體文庫(kù):
[0087]2.1細(xì)胞預(yù)處理:1640培養(yǎng)基(購(gòu)買(mǎi)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)加質(zhì)量濃度為15%的小牛血清培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞至鋪滿(mǎn)瓶底95%，去除培養(yǎng)基后用IOmLwashing buffer 洗漆，與 I mL 含 InM 無(wú)關(guān)序列的 binding buffer 在冰上孵育 15min,棄溶液；得到預(yù)處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞。所述無(wú)關(guān)序列為:5’-AGCTAGTAATCGAGATTAAGAGACCAATCCAAGACATATCAGCAGTAGCA-3’ (Seq ID NO:8)。
[0088]2.2 孵育:用 300 μ L binding buffer 溶解 IOnmol 隨機(jī)單鏈 DNA 文庫(kù)，95°C恒溫振蕩5min,迅速放入冰中；在隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)中補(bǔ)充binding buffer至終體積為I mL,與步驟2.1中得到的預(yù)處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞在冰上孵育30min，得到處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞。
[0089]2.3解離:孵育完成后倒出孵育培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的液體，用2mL含有單壁碳納米管的washingbuffer洗滌孵育培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞；用I mL無(wú)菌水刮取孵育培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞，置于EP管中沸水浴加熱lOmin，12000rpm離心取上清，即為篩選所得CNE2細(xì)胞的特異核酸適配體文庫(kù)。
[0090]3.進(jìn)行PCR擴(kuò)增文庫(kù):
[0091]取100 μ L篩選所得的CNE2細(xì)胞的特異核酸適配體文庫(kù)進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為 95°C 3min,95°C 30sec,60°C 30sec,72°C 30sec，經(jīng)合適循環(huán)輪數(shù)，72°C 3min。第一輪篩選后需將全部所得的CNE2細(xì)胞的特異核酸適體文庫(kù)預(yù)擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)，再進(jìn)行本步驟的擴(kuò)增，得到擴(kuò)增的雙鏈DNA。
[0092]4.制備單鏈DNA文庫(kù):[0093]將100 μ L鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微球5000rpm離心去上清，再用500 μ L PBS洗滌，離心去上清；重復(fù)洗滌一次。將步驟3中PCR擴(kuò)增所得的雙鏈DNA與鏈霉親和素修飾的瓊脂糖微球在常溫下孵育半小時(shí)，通過(guò)雙鏈DNA上的生物素與瓊脂糖微球上的鏈霉親和素的親和作用將雙鏈DNA充分捕獲到瓊脂糖微球表面；5000rpm離心去上清，用PBS離心洗滌兩次；然后加入200mM NaOH溶液500 μ L至瓊脂糖微球中用于雙鏈DNA的變性處理，常溫反應(yīng)15min，5000rpm離心5min，收集上清；除鹽柱用IOmL無(wú)菌水洗滌后，加入堿變性后收集得到的上清液，自然滴完。加入ImL無(wú)菌水，收集滴下的溶液，干燥后即為單鏈DNA文庫(kù)。
[0094]5.陰性篩選:
[0095]將步驟4后篩選得到的單鏈DNA文庫(kù)進(jìn)行陰性篩選，陰性篩選的具體操作為:培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞HONE至鋪滿(mǎn)瓶底95%，去除培基后用緩沖液洗滌，然后與無(wú)關(guān)序列在冰上孵育后，棄溶液，得到處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞；再將步驟4篩選得到的單鏈DNA文庫(kù)溶解，恒溫振蕩后與經(jīng)前述處理后的人鼻咽癌細(xì)胞HONE細(xì)胞在冰上孵育，孵育完成后收集細(xì)胞接觸后的溶液。
[0096]6.多輪篩選:
[0097]將步驟5所收集的細(xì)胞接觸后的溶液替代步驟2中的隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)，繼續(xù)重復(fù)進(jìn)行上述步驟2-5的操作過(guò)程，在第一輪篩選以后，用于細(xì)胞孵育篩選的文庫(kù)量約為200pmol，從第三輪篩選開(kāi)始，步驟2.2中隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和預(yù)處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞在冰上孵育時(shí)加入胎牛血清，隨著篩選輪數(shù)的增加，添加量從5%增加至20% ;重復(fù)篩選過(guò)程中用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)所得單鏈DNA文庫(kù)對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞識(shí)別能力的增強(qiáng)情況，直至6輪篩選后單鏈DNA文庫(kù)對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的識(shí)別能力滿(mǎn)足要求，將所得產(chǎn)物(產(chǎn)物中含有15條序列)經(jīng)克隆測(cè)序分析，對(duì)測(cè)序結(jié)果整理分析后，最終可得到富集度高的三條序列，這三條序列即為上述本實(shí)施例的可用于檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的核酸適配體。
[0098]用mfold軟件對(duì)該本發(fā)明的三條序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬。用mfold軟件對(duì)本發(fā)明的三條序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)模擬后的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2-圖4所示。
[0099]實(shí)施例3
[0100]流式細(xì)胞儀檢測(cè)本發(fā)明的三條核酸適配體與人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的結(jié)合效果及其特異性。將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞用無(wú)酶消化液消化后打散，2000rpm離心去上清，用5mL PBS離心洗滌兩次。人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞與含250nM DNA序列(包括序列1:FAM-T10、序列2:FAM-T11、序列3:FAM-T12和序列4:FAM-Lib陰性探針)的binding buffer冰上孵育半小時(shí)，2000rpm去上清，用400 μ L binding buffer洗漆兩次，最后加入200μL binding buffer，用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以人鼻咽癌細(xì)胞株HONE作為對(duì)照，檢測(cè)結(jié)果如圖5、圖6所示。由圖5、圖6的檢測(cè)結(jié)果證明，本發(fā)明的T10、T11、T12三條核酸適體均對(duì)靶細(xì)胞人鼻咽癌細(xì)胞CNE2細(xì)胞具有較強(qiáng)的特異性識(shí)別能力，而對(duì)對(duì)照細(xì)胞人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞無(wú)識(shí)別，與陰性探針(即上述的序列4 =FAM-Lib)也無(wú)識(shí)別。
[0101]實(shí)施例4
[0102]激光共聚焦檢測(cè)本發(fā)明的三條核酸適配體與人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的結(jié)合效果及其特異性。在激光共聚焦小皿中分別培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞和人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞，倒出培養(yǎng)基，用PBS將人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞和人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞洗漆三次，然后與含250ηΜ上述本發(fā)明的三條核酸適體的binding buffer冰上孵育半小時(shí)，倒出反應(yīng)液，用binding buffer洗漆三次,最后加入200 μ L binding buffer用于檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，CNE2細(xì)胞表示人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞，HONE表示人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞。檢測(cè)結(jié)果表明:本發(fā)明的三條核酸適體均能識(shí)別原位生長(zhǎng)狀態(tài)下的靶細(xì)胞，即人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞，而不能識(shí)別對(duì)照細(xì)胞，即人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞。
[0103]實(shí)施例5
[0104]流式細(xì)胞儀測(cè)定本發(fā)明的三條核酸適配體對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的解離常數(shù)
[0105]特異性檢測(cè)的操作與實(shí)施例3的操作基本一致，平行配制不同濃度的含本發(fā)明的核酸適配體的反應(yīng)液與人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞孵育，以流式細(xì)胞儀的熒光幾何平均值為縱坐標(biāo)，以核酸適配體的濃度為橫坐標(biāo)，由Y=Bmax*X/ (Kd+X)方程模擬曲線(xiàn)，得到本發(fā)明的三條核酸適配體的解離常數(shù)繪制曲線(xiàn)，如圖8-10所示，由此可得到解離常數(shù)Kd，如下表
I所示。圖8-圖10及表1的檢測(cè)結(jié)果表明:T10、T11及T12與靶細(xì)胞，即人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的結(jié)合能力很強(qiáng)，解離常數(shù)均在納摩爾級(jí)別。
[0106]表1:解離常數(shù)結(jié)果
[0107]
【權(quán)利要求】
1.一種核酸適配體，其特征是，所述核酸適配體為
a:5’ -CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCXCCTGCTGACTGAACCTGACG-3’，
所述 X 為 5’ -TGCCACGTGTTGGTGGAGGGAAGGGITTAGGAITTAGGGG-3’、
5’ -TGGACCGGAGGTTGGGGGATGGGTGTTGGATTTGGGAGGA-3’ 或
5’ -TAGCGGCACACTATGGGAGGCGGTGGGGGGTTCGGCGGTG-3’ ； b:與a所述核酸適配體具有60%以上同源性且具有檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞功倉(cāng)泛; c:在嚴(yán)緊條件下，與a或b的序列進(jìn)行雜交的序列；或 d:a、b或c的核酸適配體序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸適配體，其特征是，所述核酸適配體在保持整體結(jié)構(gòu)不變的前提下，所述核酸適配體的核苷酸序列上的任一位置被磷酸化、甲基化、氨基化、巰基化或同位素化。
3.—種核酸適配體衍生物，其特征是，所述核酸適配體衍生物為如權(quán)利要求1或2的所述核酸適配體的核苷酸序列的骨架衍生出的硫代磷酸酯衍生物或核酸適配體的相對(duì)應(yīng)的肽核酸。
4.一種如權(quán)利要求1或2的核酸適配體的篩選方法，其特征是，包括以下步驟， 1、合成以下序列所示的隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和引物: 隨機(jī)單鏈DNA文
庫(kù):5，-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTGCTGACTGAACCTGACG-3，，
5’ 端引物:5’ -FAM-CGTTCGTCAGGAGTAGAGGC-3’， 3，端引物:5，-Biotin-CGTCAGGTTCAGTCAGCAGG-3，，和 鏈酶親和素修飾的瓊脂糖微球； 2、cell-SELEX篩選 2.1使無(wú)關(guān)序列和人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞接觸，得到預(yù)處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞； 2.2使隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)和預(yù)處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞接觸，孵育，得到處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞； 2、3將上述步驟2.2得到的處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞和單壁碳納米管接觸，篩選，得到CNE2細(xì)胞的特異核酸適配體文庫(kù)； 3、對(duì)步驟2的CNE2細(xì)胞的特異核酸適配體文庫(kù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增的雙鏈DNA； 4、將步驟3的擴(kuò)增的雙鏈DNA和鏈酶親和素修飾的瓊脂糖微球接觸，孵育，分離，變性處理，分離，得到單鏈DNA文庫(kù)； 5、陰性篩選:使無(wú)關(guān)序列和人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞接觸，得到處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞；將步驟4得到的單鏈DNA文庫(kù)和處理后的人鼻咽癌細(xì)胞株HONE細(xì)胞接觸，收集細(xì)胞接觸后的溶液； 6、多輪篩選:將步驟5得到的細(xì)胞接觸后的溶液替代步驟2的隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)，重復(fù)步驟2-5至少一次，分析，確認(rèn)，得到所述核酸適配體。
5.如權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征是，所述步驟4的所述變性處理，分離的方法是，加入強(qiáng)堿性溶液，離心，收集上清液，將上清液過(guò)除鹽柱后收集滴下的溶液，得到單鏈DNA文庫(kù)。
6.如權(quán)利要求4所述的篩選方法，其特征是，所述步驟6中，分析，確認(rèn)的方法為，在步驟2得到的CNE2細(xì)胞的特異核酸適配體文庫(kù)中加入胎牛血清，使用流式細(xì)胞儀監(jiān)測(cè)單鏈DNA文庫(kù)對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的識(shí)別能力，測(cè)序，富集度高的為所述核酸適配體。
7.如權(quán)利要求1或2所述的核酸適配體、權(quán)利要求3所述的核酸適配體衍生物或權(quán)利要求4-6所述的篩選方法得到的核酸適配體在檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞中的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求1或2所述的核酸適配體、權(quán)利要求3所述的核酸適配體衍生物或權(quán)利要求4-6任一項(xiàng)所述的篩選方法得到的核酸適配體在制備檢測(cè)人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞的試劑盒中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】C12N15/115GK103911379SQ201410111108
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】王柯敏, 譚譽(yù)宇, 郭秋平, 羊小海, 何曉曉 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)