一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，屬于家畜基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。該分子標(biāo)記由IP10基因克隆得到，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：2所示。序列表SEQIDNO：2所示序列的第119位堿基處有一個(gè)C119-T119的堿基突變，導(dǎo)致RFLP-MspI多態(tài)性。本發(fā)明還公開(kāi)了獲得上述分子標(biāo)記的制備方法和多態(tài)性檢測(cè)方法的應(yīng)用，為豬的標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的分子標(biāo)記。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于家畜基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，現(xiàn)代育種技術(shù)在改良豬生產(chǎn)性狀方面做出了很大貢獻(xiàn)，但對(duì)健康和抵抗疾病的能力的遺傳改良確沒(méi)有得到足夠重視。一些預(yù)防性措施的應(yīng)用，如提高管理水平、改善衛(wèi)生環(huán)境、注射藥物和疫苗等，在現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)中發(fā)揮了重要作用，但隨著全球?qū)p少藥物和疫苗使用的呼聲越來(lái)越高，采用分子遺傳學(xué)方法從本質(zhì)上提高畜禽機(jī)體自身抗病能力越來(lái)越受到關(guān)注，成為研究的重點(diǎn)。
[0003]個(gè)體免疫力是衡量動(dòng)物健康的重要指標(biāo)(Knap等,2000),它屬于數(shù)量性狀,其中涉及相關(guān)基因較多，分子機(jī)制很復(fù)雜。免疫力與生產(chǎn)性能通常表現(xiàn)為表型負(fù)相關(guān)關(guān)系，這為育種工作者提出了一個(gè)大的難題，即如何在保持和提高生產(chǎn)性能的基礎(chǔ)上同時(shí)提高個(gè)體免疫能力是育種工作者研究的新課題。因此，從基因組水平揭示出生產(chǎn)性能和免疫力的控制基因體系間的具體關(guān)系，是解決上述難題的有效途徑。在抗病育種中，抗病基因的尋找是關(guān)鍵。
[0004]對(duì)于豬抗病性狀的候選基因，研究得較清楚的是豬大腸桿菌K88和F18受體基因。研究表明動(dòng)物體內(nèi)如果缺乏大腸桿菌K88受體或F18受體，就會(huì)對(duì)相應(yīng)的血清型大腸桿菌引起的腹瀉產(chǎn)生抗性，目前編碼大腸桿菌K88受體(K88abR和K88acR)的基因已經(jīng)定位在豬13號(hào)染色體上靠近轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的位置(Edfors-Lilja等，1998)，- (1，2)_海藻糖轉(zhuǎn)移酶 I ( α (I, 2) fucosyltransferase，F(xiàn)UTl)基因是 F18 受體(ECF18R)的候選基因，位于豬6號(hào)染色體上(Vogeli P等，1992)。氟烷基因(Hal)是另一個(gè)影響較大的抗性相關(guān)基因，它的氟烷敏感等位基因(Haln )可導(dǎo)致豬的體質(zhì)和抵抗力下降，產(chǎn)生劇烈的應(yīng)激反應(yīng)。豬的干擾素被證明對(duì)繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、胃腸炎冠狀病毒等多種重大傳染病病毒均具有廣譜防御和抑制作用，因而干擾素基因、干擾素受體基因是選擇豬的非特異性抗病力的重要候選基因。另外，MHC已經(jīng)被證明與抗體對(duì)多種抗原的應(yīng)答、細(xì)菌的噬菌作用、對(duì)螺旋旋毛蟲(chóng)和惡性黑素瘤的易感性等性狀有相關(guān)(Peelman等，1996),其它有研究的與抗病力有關(guān)的基因是MXl (Myxovirus (influenza)resistance 1，粘液病毒(流感)抗性因子 I )、NRAMPl (Natural resistance-associatedmacrophage protein I,與巨卩遼細(xì)胞有關(guān)的天然抗性蛋白I), ILl (Interleukins I,白細(xì)胞介素 1)、PPARG (Peroxisome proliferator activated receptor gamma,過(guò)氧化物酶體增殖激活受體Y)等基因。
[0005]IPlO是屬于CXC家族的趨化因子，又名CXCL10，主要是由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等受到IFNy刺激后誘導(dǎo)分泌的。IPlO能介導(dǎo)Thl型炎癥反應(yīng)。IPlO作為單核細(xì)胞和活化T淋巴細(xì)胞的趨化因子，能刺激單核細(xì)胞，活化T淋巴細(xì)胞的定向遷移，并增加T細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用(Taub et al., 1993)。IPlO激活Thl細(xì)胞能夠發(fā)揮一下幾個(gè)方面的生物學(xué)作用:(1)參與某些遲發(fā)型超敏反應(yīng)疾病的發(fā)生。在活動(dòng)性肺結(jié)核病的支氣管肺泡中IPlO的表達(dá)水平很高；另有研究發(fā)現(xiàn)同種異體移植中使用IPlO單克隆抗體可以延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間，即說(shuō)明阻斷IPlO后能抑制移植排斥反應(yīng)的發(fā)生；(2)參與自身免疫性疾病的發(fā)生。不僅在SLE患者的血清中檢測(cè)到高水平表達(dá)的IP10，而且有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其可能是I型糖尿病的誘因(Li et al., 2005)，IPlO激活Thl型細(xì)胞，從而激活細(xì)胞毒性巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和NK細(xì)胞，攻擊胰島細(xì)胞導(dǎo)致胰島B細(xì)胞破壞引起I型糖尿病；(3)抗病毒免疫功能。在皰疹病毒感染人腦時(shí)，發(fā)現(xiàn)外源的IPlO能直接抵抗病毒的復(fù)制，增強(qiáng)小膠質(zhì)細(xì)胞抗病毒的防御反應(yīng)，并且增強(qiáng)免疫應(yīng)答效應(yīng)(Lokensgard et al., 2001) ； (4)具有抑制血管新生的作用。它作為體內(nèi)血管新生抑制因子之一，能有效抑制IL8和bFGF引起的血管新生(Angiolillo et al.，1995),其作用主要表現(xiàn)在參與血管重塑的調(diào)節(jié)和抑制腫瘤生長(zhǎng)遷移兩個(gè)方面。IPlO通過(guò)抑制腫瘤的血管新生，減少腫瘤血液供給，導(dǎo)致腫瘤缺血壞死，同時(shí)它能將T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和NK細(xì)胞等趨化至腫瘤發(fā)生部位，誘導(dǎo)Thl型炎癥反應(yīng)從而殺傷腫瘤細(xì)胞，最終發(fā)揮抗腫瘤的重要生物學(xué)作用。
[0006]迄今為止，尚未見(jiàn)全面研究豬IPlO基因功能的報(bào)道，而研究突變位點(diǎn)在群體中的多態(tài)性，并進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析是研究基因功能的一個(gè)非常有力的手段。所以 申請(qǐng)人:對(duì)這個(gè)基因的部分的外顯子進(jìn)行了多態(tài)研究和關(guān)聯(lián)分析，以期能夠發(fā)現(xiàn)它在免疫方面的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的技術(shù)方案。
[0008]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
申請(qǐng)人:克隆得到與豬免疫性狀相關(guān)基因IPlO的DNA片段，它的cDNA序列(包括全長(zhǎng)CDS及部分5，-UTR和3，-UTR)如序列表SEQ ID NO:1所述；它的部分DNA序列如序列表SEQ ID NO:2 所述。
[0009]PCR擴(kuò)增的IPlO基因cDNA長(zhǎng)為787bp，包括CDS全長(zhǎng)315bp及部分5’ -UTR和3，-UTR，即如序列表SEQ ID NO:1所述和附圖2所示的核苷酸序列。
[0010]PCR擴(kuò)增的IPlO基因組序列全長(zhǎng)為497bp，即如序列表SEQ ID NO:2所述和附圖3所示的核苷酸序列。
[0011]在序列表SEQ ID NO:2的第119bp處有一個(gè)堿基突變(C119-T119)，該突變導(dǎo)致Msp1-RFLP 多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism)。
[0012]擴(kuò)增IPlO基因cDNA序列的引物如下所示:
正向引物序列如SEQ ID N0:5所示，
反向引物序列如SEQ ID N0:6所示。
[0013]擴(kuò)增IPlO基因測(cè)序并檢測(cè)C119-T119處堿基突變所用的引物序列如下所示:
正向引物序列如SEQ ID N0:3所示，
反向引物序列如SEQ ID N0:4所示。
[0014]本發(fā)明所述的分子標(biāo)記的制備方法是:
用人IPlO基因mRNA(GenBank收錄號(hào):NM_001565.3)為信息探針，作同源序列篩選，獲得同源性90%以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST);然后對(duì)EST進(jìn)行拼接；與人同源比對(duì)并設(shè)計(jì)引物，提取RNA進(jìn)行RT-PCR及PCR擴(kuò)增，并克隆得到如序列表SEQ ID NO:1所示的cDNA序列(包括⑶S全長(zhǎng)及部分3’ -UTR);根據(jù)與豬IPlO基因的基因組全長(zhǎng)DNA序列的比對(duì)結(jié)果大致得出外顯子的拼接位點(diǎn)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，提取DNA，PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序，獲得如序列表SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
[0015]應(yīng)用常規(guī)的PCR-RFLP的方法對(duì)序列表SEQ ID NO:2所示的第119位堿基突變進(jìn)行了檢測(cè)，并初步進(jìn)行其基因型與豬的部分免疫性狀之間的關(guān)聯(lián)分析的應(yīng)用，為豬的分子標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的分子標(biāo)記。
[0016]更詳細(xì)的技術(shù)方案參見(jiàn)《【具體實(shí)施方式】》。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1:本發(fā)明的技術(shù)流程圖。
[0018]圖2:本發(fā)明中豬IPlO基因部分cDNA序列(包含CDS全長(zhǎng)及部分5’ -UTR和3， -UTR)。
[0019]圖3:本發(fā)明中豬IPlO基因3’_UTR部分序列，其中第119位堿基處的括號(hào)內(nèi)為等位基因的突變位點(diǎn)。[0020]圖4:本發(fā)明中豬IPlO基因3’_UTR部分序列的擴(kuò)增序列的電泳圖譜，片段大小為497bp (瓊脂糖膠濃度為2%)。圖中:M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)。
[0021]圖5:本發(fā)明中豬IPlO基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)的C119-T19的等位基因突變。
[0022]圖6:本發(fā)明中豬IPlO基因3’-UTR的Msp1-RFLP的三種基因型(AA AB BB)電泳圖譜。M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0024]實(shí)施例1
(一)IPlO基因⑶S克隆及部分DNA序列擴(kuò)增 (I)引物設(shè)計(jì)
用人IPlO基因mRNA (GenBank收錄號(hào):ΝΜ_001565.3 )為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫(kù)中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為90%以上的ESTs (片段長(zhǎng)度大于IOObp)，將這些ESTs的收錄號(hào)在NCBI中用ENTREZ (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/Web/ Search/index, html)查詢(xún)相應(yīng)序列，然后用序列分析軟件DNAStar中的SeqMan程序構(gòu)建豬EST-重疊群。根據(jù)與人IPlO基因mRNA的同源比對(duì)初步確定起始與終止密碼子位置，設(shè)計(jì)引物克隆得到如序列表SEQ ID NO:1所示的cDNA序列(包括⑶S全長(zhǎng)及部分5’ -UTR和3’ -UTR序列);根據(jù)與豬IPlO基因的基因組全長(zhǎng)DNA序列的比對(duì)結(jié)果大致得出外顯子的拼接位點(diǎn)，推測(cè)豬IPlO基因含有4個(gè)外顯子，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化及測(cè)序，獲得如序列表SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。其中，通過(guò)對(duì)外顯子IV部分序列(497bp)的擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)，于119bp處發(fā)現(xiàn)了 I個(gè)堿基突變(C 119-T 119)，對(duì)此突變進(jìn)行酶切分析，發(fā)現(xiàn)該突變恰好影響著內(nèi)切酶MspI的識(shí)別。
[0025]克隆IPlO基因cDNA序列的引物如下所不:正向:5’_ CGGGGGAGACACTCTTCAACT - 3’(該序列如 SEQ ID NO:5 所示)，
反向:5’_ CAGTAGAAGCCCACGGAGTAAAG - 3’(該序列如 SEQ ID NO:6 所示)。
[0026]擴(kuò)增IPlO基因測(cè)序并檢測(cè)C119-T119處堿基突變所用的引物序列如下所示 正向:5’ - AAGCAGAACTCAGACTGAAACC -3’(該序列如 SEQ ID NO:3 所示)，
反向:5’ - GTAGAAGCCCACGGAGTAAAG -3’(該序列如 SEQ ID NO:4 所示)。
[0027](2) PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序
PCR擴(kuò)增條件=IOuL的反應(yīng)體系中加入DNA模板0.5 μ L, 10,PCR buffer I μ L, dNTP0.3μ L，IOmM引物前后各0.2 μ L，Taq酶1U。PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min后，94°C變性30s、61°C退火30s、72°C延伸30s，33個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
[0028]PCR產(chǎn)物的純化:在紫外燈下從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5 mL離心管中，于65°C溫育至凝膠完全融化，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(購(gòu)自TIANGEN公司)純化PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，具體步驟是在每300 μ L融化的凝膠中加入1mL Resin試劑,混勻20 s,將Resin/DNA混合物轉(zhuǎn)移至帶有吸附柱的離心管,離心除去液體。再向吸附柱中加入80%的異丙醇2 mL，離心除去液體，取下吸附柱裝入1.5mL離心管中，10，OOOg離心2 min以干燥Resin,將吸附柱裝入另一個(gè)干凈的1.5 mL離心管中，加入30~50 UL滅菌水，靜置lmin，10，OOOg離心20s，以洗脫DNA存于離心管中。
[0029]連接反應(yīng):將純化PCR產(chǎn)物與pGEM-T easy載體(購(gòu)自promega公司)連接,連接反應(yīng)總體積是5 μ L，其中包括2.5 μ L 2 X Buffer, 0.5 μ L的T載體，1.5 μ L的純化PCR產(chǎn)物，0.5 UL的Τ4連接酶，置16°C水浴過(guò)夜。
[0030]感受態(tài)細(xì)胞的制備:從37°C培養(yǎng)了 16-20 h的新鮮平板上挑取一個(gè)DH5 α單菌落接種于2 mL LB中，于37°C振蕩培養(yǎng)3 h，轉(zhuǎn)接I mL菌液于含有30 mL LB的鹽水瓶中，繼續(xù)在37°C振蕩培養(yǎng)約4 h，待0D600達(dá)到0.3-0.4時(shí)將鹽水瓶從搖床取出置冰浴冷卻10-15min，然后將菌液轉(zhuǎn)入離心管中于4°C 4，OOOg離心10 min以收集細(xì)胞，將離心管倒置以棄凈培養(yǎng)液，用10 mL冰預(yù)冷的0.1 mol/L的CaC12重懸沉淀，冰浴30 min，重復(fù)4°C 4, OOOg離心10 min 一次，用4 ml冰預(yù)冷的0.1 mol/L的CaC12重懸沉淀，置4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0031]轉(zhuǎn)化:無(wú)菌狀態(tài)下取100-120 μ L感受態(tài)細(xì)胞于1.5 mL離心管中，將5 μ L的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30 min, 420C熱激90 S，其間不要搖動(dòng)離心管，取出后冰浴3_4min，加入400 μ L無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)45 min。取100 μ L涂布于已提前4 h涂布了 IPTG(英文名稱(chēng):Isopropylthio_β-D-galactoside,中文名稱(chēng):異丙基硫代-β -D-半乳糖苷，購(gòu)自TIANGEN公司和X-gal的瓊脂平板上，37°C平放I h后倒置培養(yǎng)。
[0032]質(zhì)粒的小量制備:挑取平板上的單菌落,接種于2-3mL LB中，37°C 300r/min培養(yǎng)6_8h。用1.5mL離心管12000r/min離心數(shù)秒收集菌體。按照質(zhì)粒小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行質(zhì)粒制備(試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司)。
[0033]重組質(zhì)粒的酶切鑒定:取3 μ L質(zhì)粒DNA與適量的雙蒸水混勻，使其總體積為IOyLJpASU限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I及IyL相應(yīng)的IOX限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)緩沖液(購(gòu)自Fermetas公司)，輕彈管壁混勻并離心，置37°C水浴1-2小時(shí)，取2-3 μ L反應(yīng)液于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，酶切結(jié)果與預(yù)計(jì)完全相同者，即為目的重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒采用雙脫氧末端終止法在DNA自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序，序列測(cè)定由生工生物工程(上海)有限公司完成。[0034]在本實(shí)施例中，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示均為特異的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物回收純化后克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示PCR得到的cDNA序列長(zhǎng)度為787bp，包括CDS全長(zhǎng)315bp及部分5’ -UTR和3’ -UTR (如圖2和序列表SEQ ID NO:1所示)；PCR得到的DNA序列全長(zhǎng)為497bp (如圖3和序列表SEQ ID NO:2所示)，測(cè)序結(jié)果表明在該DNA序列的119bp處存在C119-T119突變，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖5所示。
[0035](3) DNA序列同源性檢索鑒定
通過(guò)美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)軟件,將測(cè)序后獲得的 DNA 序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的已知生理功能基因進(jìn)行序列同源性比較，以鑒定和獲得該DNA序列的功能信息。
[0036](二)PCR-RFLP診斷方法建立
RFLP 檢測(cè):將 PCR 產(chǎn)物 3 μ L，10 X Buffer I μ L，限制性?xún)?nèi)切酶 MspI 為 0.2 μ L (2U)，加雙蒸水補(bǔ)至10 μ L，將樣品混勻后離心，37°C培養(yǎng)箱放置12h，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。
[0037]用引物擴(kuò)增豬基因組DNA得到了 497bp特異性擴(kuò)增片段(詳見(jiàn)圖4)，序列分析結(jié)果表明在119bp處存在C119-T119突變，并導(dǎo)致MspI多態(tài)性。該基因突變位點(diǎn)由兩個(gè)等位基因控制，其中T是沒(méi)有形成酶切位點(diǎn)的等位基因，C是形成酶切位點(diǎn)的等位基因。這兩個(gè)等位基因可組成三種基因型其中TT型為未發(fā)生酶切的純合型(電泳檢測(cè)時(shí)只有497bp —條DNA帶)，CC型為發(fā)生酶切的純合型(電泳檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)379bp和118bp兩條DNA帶)，TC為雜合型(電泳檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)497bp、379bp和118bp三條DNA帶)。
[0038](三)PCR- MspI 一 RFLP多態(tài)性在各豬品種中的分布情況的檢測(cè)的應(yīng)用
利用PCR - Msp1- RFLP檢測(cè)了六個(gè)豬種:其中屬于中國(guó)地方血緣的豬種分別是金華豬，嘉興黑豬，嵊縣花豬和岔路黑豬，屬于外來(lái)的例如歐美血緣的豬種分別是大白豬和杜洛克豬。該突變位點(diǎn)在不同豬種中的基因型和基因頻率如表1所示，結(jié)果顯示在地方豬種中等位基因T和C頻率無(wú)明顯差異，在國(guó)外豬種中等位基因C占優(yōu)勢(shì)。
[0039]表1:幾個(gè)豬品種中IPlO基因119位點(diǎn)多態(tài)性的基因型和基因頻率
【權(quán)利要求】
1.一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，其特征在于該核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.如權(quán)利要求1所述的一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與免疫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，其特征在于該序列中第119位堿基處有一個(gè)C119-T119的堿基突變導(dǎo)致RFLP-Jfe/?/多態(tài)性。
3.檢測(cè)如權(quán)利要求2所述的堿基突變的引物，其特征在于正向引物序列如SEQID NO:3所示,反向引物序列如SEQ ID N0:4所示。
4.權(quán)利要求1或2 所述的分子標(biāo)記在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103898104SQ201410113003
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】潘建治, 黃菁, 朱志偉, 陳曉宇, 于福先 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院