單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物甾醇制備4-雄烯二酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物甾醇制備4-雄烯二酮的方法，包括如下步驟：第一步，菌種培養(yǎng)：將恥垢分枝桿菌菌種接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第二步，甾醇乳化：將底物植物甾醇在表面活性劑的作用下進(jìn)行乳化；第三步，發(fā)酵培養(yǎng)：將第一步得到的恥垢分枝桿菌菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中并添加第二步得到的植物甾醇進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；第四步，成品提取。本發(fā)明提供的單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物甾醇制備4-雄烯二酮的方法，通過添加乳化劑既提高了4-雄烯二酮的產(chǎn)率，又簡化了4-雄烯二酮的提取工藝，成本低、污染少、環(huán)保壓力小。
【專利說明】單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及留體藥物的微生物轉(zhuǎn)化【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是指一種單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]雄留-4-烯-3,17-二酮,英文名稱:androst-4-ene_3，17-dione,簡稱為 4_ 雄烯二酮，是留體激素類藥物不可替代的中間體，目前大部分留體激素類產(chǎn)品都是以4-雄烯二酮作為原料進(jìn)行生產(chǎn)的。
[0003]4-雄烯二酮目前采取的生產(chǎn)工藝主要有兩種:一種是從野生中藥材穿地龍、黃姜等植物中提取薯蕷皂苷，再經(jīng)化學(xué)合成制備4-雄烯二酮；另一種是利用微生物轉(zhuǎn)化植物甾醇生產(chǎn)4-雄烯二酮。前者工藝成本高、污染重、生產(chǎn)周期長；后者操作簡單、周期短，為現(xiàn)階段研究的熱點。
[0004]目前，國內(nèi)現(xiàn)有的微生物轉(zhuǎn)化植物留醇生產(chǎn)4-雄烯二酮的方法主要采取-油水雙相發(fā)酵體系進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。但是雙相發(fā)酵體系普遍存在工藝復(fù)雜、設(shè)備利用率低，目標(biāo)產(chǎn)物4-雄烯二酮提取和油處理 困難等問題，同時雙相體系中的有機(jī)溶媒使用種類多，用量大，對環(huán)境污染很大；盡管高聚物/高聚物雙水相發(fā)酵體系底物植物留醇在油相中相容性好，利于菌種的轉(zhuǎn)化，但是高聚物的增溶能力有限且價格昂貴，限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提出了一種單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，用于解決現(xiàn)有的微生物轉(zhuǎn)化植物留醇制備4-雄烯二酮的方法存在產(chǎn)物提取困難且環(huán)境污染嚴(yán)重的問題。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的:
[0007]—種單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，包括如下步驟:第一步，菌種繁殖:將恥垢分枝桿菌菌種接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第二步，留醇乳化:將底物植物甾醇在乳化劑的作用下進(jìn)行乳化；第三步，發(fā)酵培養(yǎng):將第一步得到的恥垢分枝桿菌菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中并添加第二步得到的植物留醇乳化液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；第四步，成品提取。
[0008]優(yōu)選的，第二步中乳化劑包括:吐溫60、吐溫80、司盤60或司盤80中的一種。
[0009]優(yōu)選的，發(fā)酵培養(yǎng)基中植物留醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:1.5%-3.0% ;發(fā)酵培養(yǎng)基中乳化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:吐溫 600.1-0.5%，吐溫 800.5-2.0%，司盤 600.5-1.0%，司盤 800.5-2.0%。
[0010]優(yōu)選的，第二步植物甾醇乳化的溫度為50-70°C。
[0011]優(yōu)選的，第一步菌種繁殖的具體操作為:將濃度IO7-1O9個/ml的恥垢分枝桿菌菌種以5%-10%的接種量接入裝有種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中培養(yǎng)。
[0012]優(yōu)選的，第三步發(fā)酵培養(yǎng)的具體操作為:待第一步中的菌種培養(yǎng)基OD6tltl為15-20時，以20%-50%的接種量將其接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)。[0013]優(yōu)選的，第三步發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度25_30°C，發(fā)酵初始PH6.0-8.0，溶氧量20-40%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速 150-200rpm，培養(yǎng)周期 80_120h。
[0014]優(yōu)選的，第一步的種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖10_12g/L、K2HPO40.5-0.6g/L、MgSO4.7Η200.5-0.6g/L、(NH4) 2Fe (SO4) 2.6H200.04-0.05g/L、CaC035.0-5.3g/L 和檸檬酸 2.0-2.5g/L，種子培養(yǎng)基的 pH 為 6.0-8.0。
[0015]優(yōu)選的，第三步中發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖20_25g/L，蛋白胨20-25g/L,豆餅粉 15-20g/L, K2HPO40.7-0.8g/L, MgSO4.7Η200.6-0.7g/L, (NH4) 2Fe (SO4)
2.6H200.04-0.05g/L, CaC035.0-5.5g/L,檸檬酸 2.0-2.5g/L 和 NH4NO30.9-1.0g/L,所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.0-8.0。
[0016]優(yōu)選的，第四步成品提取的具體工藝為:將發(fā)酵液過濾得到濾餅，用至少2倍量的乙醇或丙酮將所述濾餅溶解后依次進(jìn)行萃取、過濾、脫色蒸餾得到粗品；粗品用至少4倍量的二氯甲烷或氯仿溶解后依次進(jìn)行萃取、脫色、過濾、蒸餾，然后加入至少2倍量己烷或者甲苯后進(jìn)行蒸餾結(jié)晶得到精制品。
[0017]本發(fā)明提出的單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，具有以下有益效果: [0018]1、提高了植物甾醇的利用率，發(fā)酵底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到95%以上；
[0019]2、發(fā)酵中采用單水相體系且提取操作中溶媒種類少，用量小，環(huán)境污染少，生產(chǎn)成本低；
[0020]3、降低了成品提取的難度，提取操作簡單、高效、環(huán)保。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0022]圖1為本發(fā)明一種單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0023]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0024]如圖1所示:一種單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，包括如下步驟:第一步，菌種繁殖:將恥垢分枝桿菌菌種接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；第二步，留醇乳化:將底物植物留醇在乳化劑的作用下進(jìn)行乳化；第三步，發(fā)酵培養(yǎng):將第一步得到的恥垢分枝桿菌菌種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中并添加第二步得到的植物留醇乳化液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；第四步，成品提取。
[0025]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，第二步中乳化劑包括:吐溫60、吐溫80、司盤60或司盤80中的一種。
[0026]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案,發(fā)酵培養(yǎng)基中植物甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:1.5%-3.0%;發(fā)酵培養(yǎng)基中乳化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:吐溫600.1-0.5%，吐溫800.5-2.0%，司盤600.5-1.0%，司盤 800.5-2.0%。
[0027]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，第二步植物留醇乳化的溫度為50-70°C。
[0028]乳化劑的種類、用量及乳化溫度，可以通過測試植物甾醇與乳化劑配制成的乳化液的吸光度來確定。具體測試方法為:將植物留醇與選定的一定濃度的乳化劑按照一定的配比恒溫乳化30min后，離心15min后取清液稀釋測試其在678nm處的吸光度，吸光度高則說明植物留醇在這個濃度的乳化劑中乳化效果好，反復(fù)試驗后確定吐溫60、吐溫80、司盤60及司盤80為優(yōu)選的乳化劑，它們優(yōu)選的濃度(發(fā)酵培養(yǎng)基中乳化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù))分別為:吐溫600.1-0.5%，吐溫800.5-2.0%，司盤600.5-1.0%，司盤800.5-2.0%，優(yōu)選的乳化溫度為50-70。。。
[0029]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，第一步菌種繁殖的具體操作為:將濃度IO7-1O9個/ml的恥垢分枝桿菌菌種以5%-10%的接種量接入裝有種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中培養(yǎng)。
[0030]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，第三步發(fā)酵培養(yǎng)的具體操作為:待第一步中的菌種培養(yǎng)基OD6tltl為15-20時，以20%-50%的接種量將其接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)。
[0031]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，第三步發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度25_30°C，發(fā)酵初始pH6.0-8.0，溶氧量 20-40%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速 150_200rpm，培養(yǎng)周期 80_120h。
[0032]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，第一步的種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖10-12g/L、K2HPO40.5-0.6g/L、MgSO4.7H200.5-0.6g/L、(NH4) 2Fe (SO4) 2.6H200.04-0.05g/L、CaC035.0-5.3g/L 和檸檬酸 2.0-2.5g/L，種子培養(yǎng)基的 pH 為 6.0-8.0。
[0033]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，第三步中發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖20-25g/L,蛋白胨 20-25g/L,豆餅粉 15_20g/L，K2HPO40.7-0.8g/L, MgSO4.7Η200.6-0.7g/L, (NH4) 2Fe (SO4)2.6H200.04-0.05g/L, CaC035.0-5.5g/L,檸檬酸 2.0-2.5g/L 和NH4NO30.9-1.0g/L,發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH 為 6.0-8.0。
[0034]作為一種優(yōu)選的技術(shù)方案，第四步成品提取的具體工藝為:將發(fā)酵液過濾得到濾餅，用至少2倍量的乙醇或丙酮將所述濾餅溶解后依次進(jìn)行萃取、過濾、脫色蒸餾得到粗品；粗品用至少4倍量的二氯甲烷或氯仿溶解后依次進(jìn)行萃取、脫色、過濾、蒸餾，然后加入至少2倍量的己烷或者甲苯后進(jìn)行蒸餾結(jié)晶得到精制品。
[0035]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提出的單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法植物留醇轉(zhuǎn)化率高，發(fā)酵培養(yǎng)后產(chǎn)物4-雄烯二酮的濃度達(dá)到9.0g/L以上；后期成品提取簡單、污染較少，其使用的溶媒數(shù)量少，用上述提取方法對粗品重復(fù)提取兩次后，4-雄烯二酮的純度可達(dá)到99%以上。
[0036]實施例1
[0037]單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，包括如下步驟:
[0038]第一步，菌種 繁殖:將濃度IO7個/ml的恥垢分枝桿菌菌種以10%的接種量接入裝有種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖10g/L、K2HPO40.6g/L、MgSO4.7H200.5g/L、(NH4) 2Fe (SO4) 2.6H200.05g/L、CaC035.0g/L 和檸檬酸2.5g/L，種子培養(yǎng)基的pH為6.0 ;[0039]第二步，甾醇乳化:
[0040]將底物植物甾醇在乳化劑吐溫80的作用下進(jìn)行乳化，乳化溫度60°C ；
[0041]第三步，發(fā)酵培養(yǎng):
[0042]待第一步中的菌種培養(yǎng)基0D_為20時，以50%的接種量將其接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中并添加第二步得到的植物留醇乳化液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；
[0043]發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度25°C，發(fā)酵初始pH6，溶氧量40%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)周期120h ；
[0044]發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖20g/L，蛋白胨25g/L，豆餅粉20g/L，K2HPO40.8g/L, MgSO4.7H200.6g/L, (NH4) 2Fe (SO4) 2.6H200.05g/L, CaC035.0g/L,檸檬酸2.5g/L和NH4NO30.9g/L，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.0，吐溫80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，植物甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.0% ；
[0045]第四步，成品提取:
[0046]將第三步中得到的發(fā)酵液過濾得到濾餅，用4倍量的乙醇將所述濾餅溶解后依次進(jìn)行萃取、脫色、過濾、蒸餾得到粗品；粗品用8倍量的二氯甲烷溶解后依次進(jìn)行脫色、過濾、蒸餾，然后加入4倍量 的甲苯后進(jìn)行蒸餾結(jié)晶得到精制品。
[0047]測試結(jié)果:植物甾醇的轉(zhuǎn)化率為96.0%，最終效價14.4g/L，得到的4_雄烯二酮的純度大于99.0%。
[0048]實施例2
[0049]將實施例1中的乳化溫度更改為50°C，其余操作與實施例2相同。
[0050]測試結(jié)果:植物甾醇的轉(zhuǎn)化率為89.6%，最終效價13.44g/L，得到的4_雄烯二酮的純度大于99.0%。
[0051]實施例3
[0052]將實施例1中的乳化溫度更改為70°C，其余操作與實施例2相同。
[0053]測試結(jié)果:植物留醇的轉(zhuǎn)化率為84.3%，最終效價12.65g/L，得到的4-雄烯二酮的純度大于99.0%。綜合分析實施例1-3得知，最為優(yōu)選的乳化溫度為60°C。
[0054]實施例4
[0055]將實施例1中發(fā)酵培養(yǎng)基中吐溫80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)更改為2.0%，其余操作與實施例2相同。
[0056]測試結(jié)果:植物甾醇的轉(zhuǎn)化率為76.4%，最終效價11.46g/L，得到的4_雄烯二酮的純度大于98.5%。
[0057]實施例5
[0058]將實施例1中發(fā)酵培養(yǎng)基中吐溫80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)更改為1%，其余操作與實施例2相同。
[0059]測試結(jié)果為:植物留醇的轉(zhuǎn)化率為80.3%，最終效價12.04g/L，得到的4-雄烯二酮的純度大于98.5%。
[0060]實施例6
[0061]將實施例1中發(fā)酵培養(yǎng)條件中溶氧量更改為20%，其余操作與實施例2相同。
[0062]測試結(jié)果為:植物留醇的轉(zhuǎn)化率為80.6%，最終效價12.09g/L，得到的4-雄烯二酮的純度大于98.5%。[0063]實施例7
[0064]將實施例1中發(fā)酵培養(yǎng)條件中溶氧量更改為30%，其余操作與實施例2相同。
[0065]測試結(jié)果為:植物留醇的轉(zhuǎn)化率為82.6%，最終效價12.39g/L，得到的4_雄烯二酮的純度大于99.0%。
[0066]實施例8
[0067]將實施例1中的乳化劑吐溫80更改為吐溫60，添加量及其余操作與實施例2相同。
[0068]測試結(jié)果為:植物甾醇的轉(zhuǎn)化率為76.9%，最終效價11.54g/L，得到的4_雄烯二酮的純度大于98.5%。
[0069]實施例9
[0070]將實施例8中的吐溫60的添加量更改為0.1%，其余操作與實施例8相同。
[0071]測試結(jié)果為 :植物甾醇的轉(zhuǎn)化率為81.2%，最終效價12.18g/L，得到的4-雄烯二酮的純度大于99.0%。
[0072]實施例10
[0073]將實施例8中的吐溫60的添加量更改為0.3%，其余操作與實施例8相同。
[0074]測試結(jié)果為:植物甾醇的轉(zhuǎn)化率為79.9%，最終效價11.98g/L，得到的4_雄烯二酮的純度大于98.5%。
[0075]實施例11
[0076]將實施例1中的乳化劑吐溫80更改為司盤60，添加量及其余操作與實施例2相同。
[0077]測試結(jié)果為:植物甾醇的轉(zhuǎn)化率為75.0%，最終效價11.25g/L，得到的4-雄烯二酮的純度大于98.5%。
[0078]實施例12
[0079]將實施例1中的乳化劑吐溫80更改為司盤80，添加量及其余操作與實施例2相同。
[0080]測試結(jié)果為:植物甾醇的轉(zhuǎn)化率為74.1%，最終效價11.12g/L，得到的4-雄烯二酮的純度大于98.5%。綜合實施例1、實施例8-12可知，上述四種乳化劑中吐溫80為最優(yōu)選的乳化劑，綜合實施例1、4、5可知，吐溫80優(yōu)選的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%。
[0081]實施例13
[0082]將實施例1中第四步成品提取的操作更改為:用2倍量的丙酮將所述濾餅溶解后依次進(jìn)行過濾、萃取、蒸餾得到粗品；粗品用4倍量的氯仿溶解后依次進(jìn)行脫色、萃取、蒸餾，然后加入2倍量的甲苯后進(jìn)行蒸餾結(jié)晶得到精制品。
[0083]測試結(jié)果為:植物留醇的轉(zhuǎn)化率為95.7%，最終效價14.36g/L，得到的4-雄烯二酮的純度大于98.5%。
[0084]實施例14
[0085]將實施例1中第三步中發(fā)酵培養(yǎng)的初始pH更改為8，其余操作與實施例1相同。
[0086]測試結(jié)果為:植物甾醇的轉(zhuǎn)化率為69.9%，最終效價10.48g/L，得到的4_雄烯二酮的純度大于98.5%。
[0087]實施例15[0088]將實施例1中第三步中發(fā)酵培養(yǎng)的初始pH更改為7，其余操作與實施例1相同。
[0089]測試結(jié)果為:植物留醇的轉(zhuǎn)化率為95.9%，最終效價14.38g/L，得到的4-雄烯二酮的純度大于99%。綜合分析實施例1、實施例14與實施例15，可見發(fā)酵培養(yǎng)的合適pH為弱酸性或中性環(huán)境。
[0090]實施例16
[0091]單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，包括如下步驟:
[0092]第一步，菌種繁殖:將濃度IO9個/ml的恥垢分枝桿菌菌種以5%的接種量接入裝有種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖12g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7H200.6g/L、(NH4) 2Fe (SO4) 2.6H200.04g/L、CaC035.3g/L 和檸檬酸
2.0g/L,種子培養(yǎng)基的pH為8.0 ;
[0093]第二步，甾醇乳化:
[0094]將底物植物留醇在乳化劑吐溫80的作用下進(jìn)行乳化，乳化溫度60°C ；
[0095]第三步，發(fā)酵培養(yǎng):
[0096]待第一步中的菌種培養(yǎng)基0D_為15時，以30%的接種量將其接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中并添加第二步得到的植物留醇乳化液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； [0097]發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度25°C，發(fā)酵初始pH為7.0，溶氧量30%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)周期IOOh ；
[0098]發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖25g/L，蛋白胨20g/L，豆餅粉15g/L，K2HPO40.7g/L, MgSO4.7H200.7g/L, (NH4) 2Fe (SO4) 2.6H200.04g/L, CaC035.5g/L,檸檬酸
2.0g/L和NH4NO3L Og/L,發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為8，吐溫80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，植物甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0% ；
[0099]第四步，成品提取:
[0100]將第三步中得到的發(fā)酵液過濾得到濾餅，用4倍量的丙酮將所述濾餅溶解后依次進(jìn)行萃取、脫色、過濾、蒸餾得到粗品；粗品用6倍量的氯仿溶解后依次進(jìn)行脫色、過濾、蒸餾，然后加入4倍量的己烷后進(jìn)行蒸餾結(jié)晶得到精制品。
[0101]測試結(jié)果:植物留醇的轉(zhuǎn)化率為93.18%，最終效價9.32g/L，得到的4-雄烯二酮的純度大于99%。
[0102]實施例17
[0103]單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，包括如下步驟:
[0104]第一步，菌種繁殖:將濃度IO9個/ml的恥垢分枝桿菌菌種以5%的接種量接入裝有種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖12g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7H200.6g/L、(NH4) 2Fe (SO4) 2.6H200.04g/L、CaC035.3g/L 和檸檬酸
2.0g/L,種子培養(yǎng)基的pH為8.0 ;
[0105]第二步，甾醇乳化:
[0106]將底物植物留醇在乳化劑吐溫80的作用下進(jìn)行乳化，乳化溫度60°C ；
[0107]第三步，發(fā)酵培養(yǎng):
[0108]待第一步中的菌種培養(yǎng)基0D_為15時，以20%的接種量將其接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中并添加第二步得到的植物留醇乳化液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；
[0109]發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度25°C，發(fā)酵初始pH為8.0，溶氧量20%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速150rpm，培養(yǎng)周期80h ；
[0110]發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖25g/L，蛋白胨20g/L，豆餅粉15g/L，K2HPO40.7g/L, MgSO4.7H200.7g/L, (NH4) 2Fe (SO4) 2.6H200.04g/L, CaC035.5g/L,檸檬酸2.0g/L和NH4NO3L Og/L,發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為8，吐溫80的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%，植物甾醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5% ；
[0111]第四步，成品提取:
[0112]將第三步中得到的發(fā)酵液過濾得到濾餅，用2倍量的丙酮將所述濾餅溶解后依次進(jìn)行萃取、脫色、過濾、蒸餾得到粗品；粗品用4倍量的氯仿溶解后依次進(jìn)行脫色、過濾、蒸餾，然后加入2倍量的己烷后進(jìn)行蒸餾結(jié)晶得到精制品。
[0113]測試結(jié)果:植物甾醇的轉(zhuǎn)化率為73.3%，最終效價5.50g/L，得到的4_雄烯二酮的純度大于98.0%。
[0114]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)， 所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，其特征在于:包括如下步驟: 第一步，菌種繁殖: 將恥垢分枝桿菌菌種接入種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)； 第二步，留醇乳化: 將底物植物留醇在乳化劑的作用下進(jìn)行乳化； 第三步，發(fā)酵培養(yǎng): 將第一步得到的恥垢分枝桿菌菌 種接入發(fā)酵培養(yǎng)基中并添加第二步得到的植物甾醇乳化液進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)； 第四步，成品提取。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，其特征在于:所述第二步中乳化劑包括:吐溫60、吐溫80、司盤60或司盤80中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，其特征在于: 所述發(fā)酵培養(yǎng)基中植物留醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:1.5%-3.0% ； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基中乳化劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:吐溫600.1-0.5%，吐溫800.5-2.0%，司盤600.5-1.0%，司盤 800.5-2.0%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，其特征在于:所述第二步植物留醇乳化的溫度為50-70°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，其特征在于:所述第一步菌種繁殖的具體操作為:將濃度IO7-1O9個/ml的恥垢分枝桿菌菌種以5%-10%的接種量接入裝有種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，其特征在于:所述第三步發(fā)酵培養(yǎng)的具體操作為:待所述第一步中的菌種培養(yǎng)基OD6tltl為15-20時，以20%-50%的接種量將其接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，其特征在于:所述第三步發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度25-30°C，發(fā)酵初始pH6.0-8.0，溶氧量20-40%，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速 150-200rpm，培養(yǎng)周期 80_120h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，其特征在于:所述第一步的種子培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖10_12g/L、K2HPO40.5-0.6g/L、MgSO4.7H200.5-0.6g/L、(NH4) 2Fe (SO4) 2.6H200.04-0.05g/L、CaC035.0-5.3g/L和檸檬酸2.0-2.5g/L，所述種子培養(yǎng)基的pH為6.0-8.0。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項所述的單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，其特征在于:所述第三步中發(fā)酵培養(yǎng)基中包括如下濃度的組分:葡萄糖20-25g/L，蛋白胨 20-25g/L，豆餅粉 15-20g/L, K2HPO40.7-0.8g/L, MgSO4.7Η200.6-0.7g/L, (NH4) 2Fe(SO4) 2.6H200.04-0.05g/L, CaC035.0-5.5g/L，檸檬酸 2.0-2.5g/L 和 NH4NO30.9-1.0g/L，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為6.0-8.0。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單水相系統(tǒng)發(fā)酵降解植物留醇制備4-雄烯二酮的方法，其特征在于:所述第四步成品提取的具體工藝為:將發(fā)酵液過濾得到濾餅，用至少2倍量的乙醇或丙酮將所述濾餅溶解后依次進(jìn)行萃取、過濾、脫色蒸餾得到粗品；粗品用至少4倍量的二氯甲烷或氯仿溶解后依次進(jìn)行萃取、脫 色、過濾、蒸餾，然后加入至少2倍量己烷或者甲苯后進(jìn)行蒸餾結(jié)晶得到精制品。
【文檔編號】C12R1/34GK103923966SQ201410113381
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】宋浩雷, 張敏然, 劉倩 申請人:河北眾盛生物科技有限公司