確定樣品中是否存在目標(biāo)物的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種確定樣品中是否存在目標(biāo)物的方法，該方法包括：（1）提供基板，所述基板由疏水材料形成，并且在所述基板的表面形成有捕獲探針，其中，所述捕獲探針能夠與所述目標(biāo)物結(jié)合，并且所述捕獲探針與所述目標(biāo)物的結(jié)合能夠提高所述基板表面的親水性；（2）在捕獲探針能夠與所述目標(biāo)物結(jié)合的條件下，使所述樣品與所述基板接觸；（3）提高所述基板表面的潮濕度；以及（4）確定所述基板表面是否形成水斑，其中，所述水斑的形成是所述樣品中存在所述目標(biāo)物的指示。利用本發(fā)明的方法能夠有效地實(shí)現(xiàn)對樣片中目標(biāo)物的檢測，并且，該方法無需任何檢測儀器，成本低、使用簡便、可實(shí)現(xiàn)高通量、快速裸眼可視化檢測基因、基因突變和蛋白。
【專利說明】確定樣品中是否存在目標(biāo)物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種確定樣品中是否存在目標(biāo)物的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]基因和蛋白檢測已成為疾病早期診斷、有害細(xì)菌或病毒檢測、以及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)。特別在癌癥、心血管疾病以及傳染性疾病中的早期預(yù)警與合理化治療中發(fā)揮著重要作用。
[0003]目前，已經(jīng)開發(fā)出多種用于篩選基因突變的方法，包括等位基因雜交法，核苷酸摻入的引物延伸法，電泳法，質(zhì)譜法，核酸測序以及實(shí)時(shí)擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測等。但是，這些方法都需要貴重的檢測儀器。目前，開發(fā)出一種成本低、使用簡便、無需檢測儀器、可實(shí)現(xiàn)高通量、快速檢測基因和蛋白突變的方法迫在眉睫，且對資源匱乏地區(qū)尤為重要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提出一種無需任何檢測儀器，成本低、使用簡便、可實(shí)現(xiàn)高通量、快速裸眼可視化檢測基因、基因突變和蛋白的方法。
[0005]根據(jù)本發(fā)明 的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種確定樣品中是否存在目標(biāo)物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括:(I)提供基板，所述基板由疏水材料形成，并且在所述基板的表面形成有捕獲探針，其中，所述捕獲探針能夠與所述目標(biāo)物結(jié)合，并且所述捕獲探針與所述目標(biāo)物的結(jié)合能夠提高所述基板表面的親水性；(2)在捕獲探針能夠與所述目標(biāo)物結(jié)合的條件下，使所述樣品與所述基板接觸；(3)提高所述基板表面的潮濕度；以及(4)確定所述基板表面是否形成水斑，其中，所述水斑的形成是所述樣品中存在所述目標(biāo)物的指示。
[0006]發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法能夠有效地實(shí)現(xiàn)對樣片中目標(biāo)物的檢測，并且，該方法無需任何檢測儀器，成本低、使用簡便、可實(shí)現(xiàn)高通量、快速裸眼可視化檢測基因、基因突變和蛋白。需要說明的是，本發(fā)明的方法的原理是，當(dāng)捕獲探針與樣品混合后，當(dāng)樣品中存在目標(biāo)物時(shí)，捕獲探針能夠與目標(biāo)物結(jié)合，從而使疏水性基板結(jié)合樣品處的親水性增強(qiáng)，進(jìn)而在提高基板表面的潮濕度時(shí)，疏水性基板結(jié)合樣品處形成水膜，而其他位置形成小水珠，這些小水珠對光起到散射作用，因而裸眼無法觀測到小水珠的形成，而僅能在疏水性基板結(jié)合樣品處觀察到水斑的形成(即水膜)；反之，當(dāng)樣品中不存在目標(biāo)物時(shí)，捕獲探針的狀態(tài)不會變化，而基板仍為疏水性，從而在提高基板表面的潮濕度時(shí)，基板表面不會產(chǎn)生水膜，即裸眼觀測為沒有水斑形成。
[0007]另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的確定樣品中是否存在目標(biāo)物的方法還可以具有如下附加的技術(shù)特征:
[0008]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述目標(biāo)物為選自核酸和蛋白質(zhì)的至少一種。根據(jù)本發(fā)明一些具體示例，所述目標(biāo)物為DNA。
[0009]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述基板為硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片。由此，所述基板為疏水性，從而能夠有效基于基板表面的親疏水性，而實(shí)施本發(fā)明的方法。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述捕獲探針為核酸分子。由此，利用本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品中DNA目標(biāo)物的檢測。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，所述捕獲探針與所述目標(biāo)物形成抗體-抗原復(fù)合物。由此，能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品中蛋白質(zhì)抗原的檢測。
[0011 ] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述目標(biāo)物為DNA片段，所述捕獲探針為核酸分子，所述捕獲探針的5’端與所述基板的表面結(jié)合，所述捕獲探針的3’末端形成有游離羥基基團(tuán)，步驟(2)進(jìn)一步包括:(2-1)在存在報(bào)告探針時(shí)，使所述樣品與所述基板接觸，其中，所述報(bào)告探針的5’末端具有游離磷酸基團(tuán)，并且所述報(bào)告探針的包含5’末端堿基的連續(xù)序列和所述捕獲探針的包含3’末端堿基的連續(xù)序列分別與所述目標(biāo)物的一段連續(xù)堿基序列的一部分匹配，以便形成不存在錯(cuò)配的雙鏈結(jié)構(gòu)；以及(2-2)在連接酶的作用下，使所述報(bào)告探針的5’末端游離磷酸基團(tuán)與所述捕獲探針的3’末端游離羥基基團(tuán)連接，以便使所述報(bào)告探針與所述捕獲探針形成磷酸二酯鍵。由此，疏水性基板表面捕獲探針陳列區(qū)域的親水性增強(qiáng)，進(jìn)而通過提高基板表面的潮濕度，即可基于基板表面形成水斑確定所述樣品中存在目標(biāo)物。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2)進(jìn)一步包括:(2-3)破壞所述雙鏈結(jié)構(gòu)，以便使所述目標(biāo)物成為游離狀態(tài)，并在所述基板表面形成由所述捕獲探針和所述報(bào)告探針形成的單鏈連接體。由此，有利于后續(xù)將單鏈連接體進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，使基板表面結(jié)合的核酸分子量顯著提高，從而使疏水性基板表面捕獲探針陳列區(qū)域的親水性也相應(yīng)地顯著增強(qiáng)，進(jìn)而通過提高基板表面的潮濕度，即可基于基板表面形成水斑確定樣品中存在目標(biāo)物。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(2-3)通過對所述基板進(jìn)行清洗，破壞所述雙鏈結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述清洗包括:將所述基板依次進(jìn)行氫氧化鈉浸泡處理和去離子水洗滌。由此，處理效果好，且不會破壞單鏈連接體的結(jié)構(gòu)，有利于后續(xù)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，提高基板表面結(jié)合的核酸分子量，進(jìn)而顯著提高疏水性基板表面捕獲探針陳列區(qū)域的親水性，有利于后續(xù)通過提高基板表面的潮濕度而容易地實(shí)現(xiàn)裸眼觀測樣品中目標(biāo)物的存在。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2 )進(jìn)一步包括:(2-4 )對所述單鏈連接體進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。由此，能夠顯著提高基板表面結(jié)合的核酸分子量，進(jìn)而顯著提高疏水性基板表面捕獲探針陳列區(qū)域的親水性，有利于后續(xù)通過提高基板表面的潮濕度而容易地實(shí)現(xiàn)裸眼觀測樣品中目標(biāo)物的存在。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述滾環(huán)擴(kuò)增為選自線性滾環(huán)擴(kuò)增、指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增和超分支滾環(huán)擴(kuò)增的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述滾環(huán)擴(kuò)增采用環(huán)狀DNA模板進(jìn)行，其中所述環(huán)狀DNA模板的部分序列與所述報(bào)告探針的部分序列互補(bǔ)。由此，能夠有效實(shí)現(xiàn)報(bào)告探針的擴(kuò)增，從而能夠顯著提高基板表面結(jié)合的核酸分子量。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)行所述滾環(huán)擴(kuò)增30分鐘-12小時(shí)，優(yōu)選4小時(shí)。由此，滾換擴(kuò)增的效果好，從而能夠顯著提高基板表面結(jié)合的核酸分子量，以及疏水性基板表面捕獲探針陳列區(qū)域的親水性。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述連接酶為Taq DNA連接酶。由此，能夠有效實(shí)現(xiàn)報(bào)告探針5’末端游離磷酸基團(tuán)與所述捕獲探針的3’末端游離羥基基團(tuán)的連接，從而能夠使所述報(bào)告探針與所述捕獲探針形成磷酸二酯鍵。[0017]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述捕獲探針的長度為10_40nt。由此，捕獲探針對目標(biāo)物的結(jié)合能夠顯著提高疏水基板表面的親水性，目標(biāo)物是否存在與提高基板表面的潮濕度時(shí)基板表面的水斑是否形成顯著相關(guān)，從而能夠容易地實(shí)現(xiàn)裸眼觀測樣品中目標(biāo)物的存在。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述目標(biāo)物具有SEQ ID NO:1-3所示的核苷酸序列，所述捕獲探針具有SEQ ID NO:4-6所示的核苷酸序列，所述報(bào)告探針具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，其中，具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的捕獲探針能夠與具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的目標(biāo)物結(jié)合，具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的捕獲探針能夠與具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的目標(biāo)物結(jié)合，具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的捕獲探針能夠與具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的目標(biāo)物結(jié)合。由此，能夠通過上述報(bào)告探針和捕獲探針能夠有效地檢測樣品中的相應(yīng)目標(biāo)物。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(3)中，通過哈氣提高所述基板表面的潮濕度。由此，本發(fā)明的方法操作更加方便、快捷。
[0020]本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0021]本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0022]圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的確定樣品中是否存在目標(biāo)物的方法的流程示意圖；
[0023]圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例的確定樣品中是否存在目標(biāo)物的方法的流程及原理示意圖；
[0024]圖3顯示了實(shí)施例3中基因突變檢測的結(jié)果；
[0025]圖4顯示了實(shí)施例4中進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增4小時(shí)的基因檢測的結(jié)果；
[0026]圖5分別顯不了實(shí)施例4中進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增30min、60min、120min和150min的基因檢測的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種確定樣品中是否存在目標(biāo)物的方法。發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的方法能夠有效地實(shí)現(xiàn)對樣片中目標(biāo)物的檢測，并且，該方法無需任何檢測儀器，成本低、使用簡便、可實(shí)現(xiàn)高通量、快速裸眼可視化檢測基因和蛋白突變。需要說明的是，本發(fā)明的方法的原理是，當(dāng)捕獲探針與樣品混合后，當(dāng)樣品中存在目標(biāo)物時(shí)，捕獲探針能夠與目標(biāo)物結(jié)合，從而使疏水性基板的未水性增強(qiáng)，進(jìn)而在提聞基板表面的潮濕度時(shí)，裸眼即可觀測到水斑的形成；反之，當(dāng)樣品中不存在目標(biāo)物時(shí)，捕獲探針的狀態(tài)不會變化，而基板仍為疏水性，從而在提高基板表面的潮濕度時(shí)，基板表面不會產(chǎn)生水斑。
[0029] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，參照圖1，本發(fā)明的確定樣品中是否存在目標(biāo)物的方法包括以下步驟:
[0030]( I)提供疏水性基板
[0031]具體地，提供基板，所述基板由疏水材料形成，并且在所述基板的表面形成有捕獲探針，其中，所述捕獲探針能夠與所述目標(biāo)物結(jié)合，并且所述捕獲探針與所述目標(biāo)物的結(jié)合能夠提聞所述基板表面的未水性。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述基板為硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片。由此，所述基板為疏水性，從而能夠有效基于基板表面的親疏水性，而實(shí)施本發(fā)明的方法。
[0033]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述目標(biāo)物為選自核酸和蛋白質(zhì)的至少一種。根據(jù)本發(fā)明一些具體示例，所述目標(biāo)物為DNA。即，本發(fā)明的方法能夠?qū)悠分械哪繕?biāo)核酸或蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測。
[0034]根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述捕獲探針為核酸分子。由此，利用本發(fā)明的方法能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品中目標(biāo)核酸的檢測。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，所述捕獲探針與所述目標(biāo)物形成抗體-抗原復(fù)合物。由此，能夠?qū)崿F(xiàn)對樣品中蛋白質(zhì)抗原的檢測。
[0035](2)使樣品與所述基板接觸
[0036]具體地，在捕獲探針能夠與所述目標(biāo)物結(jié)合的條件下，使所述樣品與所述基板接觸。
[0037]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述目標(biāo)物為DNA片段，所述捕獲探針為核酸分子，所述捕獲探針的5’端與所述基板的表面結(jié)合，所述捕獲探針的3’末端形成有游離羥基基團(tuán)，步驟
(2)進(jìn)一步包括:(2-1) 在存在報(bào)告探針時(shí)，使所述樣品與所述基板接觸，其中，所述報(bào)告探針的5’末端具有游離磷酸基團(tuán)，并且所述報(bào)告探針的包含5’末端堿基的連續(xù)序列和所述捕獲探針的包含3’末端堿基的連續(xù)序列分別與所述目標(biāo)物的一段連續(xù)堿基序列的一部分匹配，以便形成不存在錯(cuò)配的雙鏈結(jié)構(gòu)；以及(2-2)在連接酶的作用下，使所述報(bào)告探針的5’末端游離磷酸基團(tuán)與所述捕獲探針的3’末端游離羥基基團(tuán)連接，以便使所述報(bào)告探針與所述捕獲探針形成磷酸二酯鍵。由此，疏水性基板表面捕獲探針陳列區(qū)域的親水性增強(qiáng)，進(jìn)而通過提高基板表面的潮濕度，即可基于基板表面形成水斑確定所述樣品中存在目標(biāo)物。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，步驟(2)進(jìn)一步包括:(2-3)破壞所述雙鏈結(jié)構(gòu)，以便使所述目標(biāo)物成為游離狀態(tài)，并在所述基板表面形成由所述捕獲探針和所述報(bào)告探針形成的單鏈連接體。由此，有利于后續(xù)將單鏈連接體進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，使基板表面結(jié)合的核酸分子量顯著提高，從而使疏水性基板表面捕獲探針陳列區(qū)域的親水性也相應(yīng)地顯著增強(qiáng)，進(jìn)而通過提高基板表面的潮濕度，即可基于基板表面形成水斑確定樣品中存在目標(biāo)物。
[0039]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在步驟(2-3)通過對所述基板進(jìn)行清洗，破壞所述雙鏈結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述清洗包括:將所述基板依次進(jìn)行氫氧化鈉浸泡處理和去離子水洗滌。由此，處理效果好，且不會破壞單鏈連接體的結(jié)構(gòu)，有利于后續(xù)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，提高基板表面結(jié)合的核酸分子量，進(jìn)而顯著提高疏水性基板表面捕獲探針陳列區(qū)域的親水性，有利于后續(xù)通過提高基板表面的潮濕度而容易地實(shí)現(xiàn)裸眼觀測樣品中目標(biāo)物的存在。根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，所述氫氧化鈉浸泡處理包括:將所述基板置于質(zhì)量濃度為0.01M的氫氧化鈉溶液中3分鐘，以便去除未連接的序列。
[0040]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例 ，步驟(2 )進(jìn)一步包括:(2-4 )對所述單鏈連接體進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。由此，能夠顯著提高基板表面結(jié)合的核酸分子量，進(jìn)而顯著提高疏水性基板表面捕獲探針陳列區(qū)域的親水性，有利于后續(xù)通過提高基板表面的潮濕度而容易地實(shí)現(xiàn)裸眼觀測樣品中目標(biāo)物的存在。其中，可以采用的滾環(huán)擴(kuò)增方法不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述滾環(huán)擴(kuò)增為選自線性滾環(huán)擴(kuò)增、指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增和超分支滾環(huán)擴(kuò)增的至少一種。由此，滾換擴(kuò)增效果好，有利于后續(xù)步驟的進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述滾環(huán)擴(kuò)增采用環(huán)狀DNA模板進(jìn)行，其中所述環(huán)狀DNA模板的部分序列與所述報(bào)告探針的部分序列互補(bǔ)。由此，能夠有效實(shí)現(xiàn)報(bào)告探針的擴(kuò)增，從而能夠顯著提高基板表面結(jié)合的核酸分子量。其中，所述環(huán)狀DNA模板的成環(huán)方式不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以在T4DNA連接酶和外切酶的作用下，利用與所述環(huán)狀DNA模板相適應(yīng)的鏈條DNA使所述環(huán)狀DNA模板首尾連接形成環(huán)狀。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增的條件不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，進(jìn)行所述滾環(huán)擴(kuò)增30分鐘-12小時(shí)，優(yōu)選4小時(shí)。由此，滾換擴(kuò)增的效果好，從而能夠顯著提高基板表面結(jié)合的核酸分子量，以及疏水性基板表面捕獲探針陳列區(qū)域的親水性。此外，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，可以利用Phi29聚合酶進(jìn)行所述滾環(huán)擴(kuò)增。
[0042]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述連接酶的種類不受特別限制，只要能夠有效實(shí)現(xiàn)所述報(bào)告探針的5’末端游離磷酸基團(tuán)與所述捕獲探針的3’末端游離羥基基團(tuán)連接即可。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述連接酶為Taq DNA連接酶。由此，報(bào)告探針5’末端游離磷酸基團(tuán)與所述捕獲探針的3’末端游離羥基基團(tuán)的連接效果好，從而能夠使所述報(bào)告探針與所述捕獲探針形成磷酸二酯鍵。
[0043]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述捕獲探針的長度不受特別限制，只要能夠有效實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的捕獲檢測，并且不影響基板的疏水性即可。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述捕獲探針的長度為10-40nt。由此，捕獲探針對目標(biāo)物的結(jié)合能夠顯著提高疏水基板表面的親水性，目標(biāo)物是否存在與提高基板表面的潮濕度時(shí)基板表面的水斑是否形成顯著相關(guān)，從而能夠容易地實(shí)現(xiàn)裸眼觀測樣 品中目標(biāo)物的存在。
[0044]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述目標(biāo)物具有SEQ ID NO:1_3所示的核苷酸序列，所述捕獲探針具有SEQ ID NO:4-6所示的核苷酸序列，所述報(bào)告探針具有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，其中，具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的捕獲探針能夠與具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的目標(biāo)物結(jié)合，具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的捕獲探針能夠與具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的目標(biāo)物結(jié)合，具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的捕獲探針能夠與具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的目標(biāo)物結(jié)合。由此，能夠通過上述報(bào)告探針和捕獲探針能夠有效地檢測樣品中的相應(yīng)目標(biāo)物。
[0045](3)提高所述基板表面的潮濕度
[0046]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，提高基板表面的方法不受特別限制。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，在步驟(3)中，通過哈氣提高所述基板表面的潮濕度。由此，無需借助任何實(shí)驗(yàn)儀器，僅通過人工哈氣即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，從而使得本發(fā)明的方法操作更加方便、快捷。
[0047](4)確定所述基板表面是否形成水斑
[0048]其中，所述水斑的形成是所述樣品中存在所述目標(biāo)物的指示。具體地，當(dāng)樣品中存在目標(biāo)物時(shí)，捕獲探針能夠與目標(biāo)物結(jié)合，從而使疏水性基板的未水性增強(qiáng)，進(jìn)而在提聞基板表面的潮濕度時(shí)，裸眼即可觀測到水斑的形成；反之，當(dāng)樣品中不存在目標(biāo)物時(shí)，捕獲探針的狀態(tài)不會變化，而基板仍為疏水性，從而在提高基板表面的潮濕度時(shí)，基板表面不會產(chǎn)生水斑。
[0049]此外，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，本發(fā)明的確定樣品中是否存在目標(biāo)物的方法還可以包括以下步驟:針對攜帶突變多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段目標(biāo)物，根據(jù)目標(biāo)基因片段，設(shè)計(jì)與之部分匹配的長度為10-40nt的捕獲探針，其中在捕獲探針3’端設(shè)置針對檢測突變多態(tài)性的位點(diǎn)，并在捕獲探針5’端進(jìn)行減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修飾；將捕獲探針呈矩陣分布的固定在疏水性基板上，以便獲得固定有捕獲探針的檢測陣列；將包含目標(biāo)物的樣品與前述的報(bào)告探針一起加載在檢測陣列，通過Taq DNA連接酶來識別并連接與目標(biāo)物完全匹配的捕獲探針與報(bào)告探針；固相核酸連接完成后，取出檢測陣列放入高鹽或高堿溶液中，去除未連接到基板上檢測陣列的非特異性序列；向檢測陣列表面加入連接好的環(huán)狀模板序列、Phi29聚合酶、dNTP,以便進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)；采用哈氣方式，提高所述基板表面的潮濕度，然后觀測基板表面的檢測陣列，并利用手機(jī)拍照記錄基板表面的顯影情況，其中顯示水斑的區(qū)域相對應(yīng)的捕獲探針上的檢測位點(diǎn)與目的基因(即目標(biāo)物)的待測區(qū)域相匹配，未顯示水斑的區(qū)域相對應(yīng)的捕獲探針上的檢測位點(diǎn)與目的基因(即目標(biāo)物)的待測區(qū)域不相匹配，進(jìn)而基于捕獲探針序列及其陣列上的檢測位點(diǎn)設(shè)計(jì)情況，對目的基因待測區(qū)域的突變多態(tài)性進(jìn)行判讀。[0050]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，前述的捕獲探針可以包括多個(gè)針對檢測突變多態(tài)性的位點(diǎn)，同一陣列上分布的探針的Tm值相差不超過2°C。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，所述的進(jìn)行減少空間位阻的序列延長修飾是在檢測探針5’端進(jìn)行polyT、polyC、polyT+polyC或SpaCer6~15C序列的延長修飾。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例,所述捕獲探針5’端的輔助固定修飾為在所述捕獲探針5’最末端添加氨基、巰基、羥基或醛基或不加任何修飾。
[0051]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，其中，與報(bào)告探針的部分序列互補(bǔ)的環(huán)狀DNA模板的部分序列，可以通過以下步驟獲得:設(shè)計(jì)并合成長度為55~IOOnt的模板ssDNA以及鏈條ssDNA，其中將模板ssDNA的5’端磷酸化處理，將鏈條ssDNA固定于基板上，并將該鏈條ssDNA5’端進(jìn)行減少空間位阻的序列延長修飾和/或輔助固定修飾,其中模板ssDNA的兩端與鏈條ssDNA可以部分雜交互補(bǔ)；將包含目標(biāo)物的樣品與模板ssDNA混合，如果目標(biāo)物與模板ssDNA部分基因完全匹配，在所述鏈條ssDNA和連接酶(如T4DNA連接酶)的作用下模板ssDNA可以連接成環(huán)，以便形成所述環(huán)狀DNA模板。
[0052]根據(jù)本發(fā)明的另一些實(shí)施例，當(dāng)目標(biāo)物為蛋白質(zhì)時(shí)，設(shè)所述目標(biāo)物為極少量抗原，并將待測樣品固定于疏水性基板上，且不改變所述基板的親疏水性；基于目標(biāo)物的氨基酸序列，制備與目標(biāo)物相應(yīng)的抗體；使制備獲得的與目標(biāo)物相應(yīng)的抗體與固定有待測樣品的基板接觸，從而，當(dāng)待測樣品中包含目標(biāo)物時(shí)，抗體與抗原結(jié)合，即與目標(biāo)物相應(yīng)的抗體與所述目標(biāo)物形成抗體-抗原復(fù)合物，此時(shí)與目標(biāo)物相應(yīng)的抗體即為本發(fā)明所述的捕獲探針。需要說明的是，上述與目標(biāo)物相應(yīng)的抗體連接有報(bào)告探針，進(jìn)而在待測樣品中存在目標(biāo)物時(shí)，可以在環(huán)的存在下，通過酶的作用基于報(bào)告探針進(jìn)行核酸片段擴(kuò)增，從而顯著增加疏水性基板上與待測樣品結(jié)合處的親水性物質(zhì)的分子量，使該處的親疏水性顯著改變，進(jìn)而，當(dāng)提高基板的潮濕度時(shí)，能夠在該處形成裸眼可視的水斑。反之，當(dāng)待測樣品中不存在蛋白質(zhì)目標(biāo)物時(shí)，疏水性基板的親疏水性不變，則不會有裸眼可視的水斑形成。由此，同樣能夠利用本發(fā)明的方法，實(shí)現(xiàn)對樣品中蛋白質(zhì)抗原的檢測。
[0053]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，需要說明的是，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法具有以下有益的技術(shù)效果:
[0054]本發(fā)明的方法檢測基因或蛋白質(zhì)，是通過固定在載體上的捕獲探針與分析物完全匹配或分析物可以將模板ssDNA連接成環(huán)形成環(huán)狀DNA，模板從而引起的核酸擴(kuò)增，改變了疏水性基板上陳列區(qū)域的親疏水性(而與探針識別的序列不完全匹配時(shí)，就不能進(jìn)行序列的延長，進(jìn)而被洗脫掉，載體芯片表面的親疏水性不變)，進(jìn)而通過提高基板表面的潮濕度尤其是人體呼氣凝結(jié)，基于水斑形成與否，結(jié)合捕獲探針的序列及在基板上的矩陣式分布情況，即可容易地實(shí)現(xiàn)裸眼檢測基因或蛋白質(zhì)。
[0055]本發(fā)明的方法是以基因芯片為基礎(chǔ)，可實(shí)現(xiàn)高通量、高特異性、快速、并且易于推廣的檢測方法。該方法通過在以硅片為代表的固相介質(zhì)上進(jìn)行特異性探針引發(fā)的核酸擴(kuò)增反應(yīng)，改變載體芯片表面親疏水性來實(shí)現(xiàn)裸眼檢測基因突變，無需任何檢測儀器，只需哈一口氣實(shí)現(xiàn)芯片的顯影(本文中所述的“芯片顯影”，是指基板表面水斑的形成)，即可確定樣品中是否存在目標(biāo)物。
[0056]本發(fā)明的方法檢測準(zhǔn)確性高，具體表現(xiàn)為:通過特異性的探針設(shè)計(jì)，以及利用Taq連接酶實(shí)現(xiàn)單堿基突變的識別連接，通過核酸的等溫?cái)U(kuò)增(即滾環(huán)擴(kuò)增)，能夠有效地?cái)U(kuò)大輸出信號，顯著改變基板的親疏水性。
[0057]本發(fā)明的方法具有良好的分辨力，能夠有效保障檢測的準(zhǔn)確性，操作簡單，無需任何檢測儀器，僅通過哈氣即可使芯片顯影從而有效實(shí)現(xiàn)檢測基因或蛋白質(zhì)。同時(shí)解決了現(xiàn)有方法的檢測需要配套儀器昂貴、檢測過程復(fù)雜等技術(shù)問題。
[0058]本發(fā)明的方法適用于基因分型、耐藥突變檢測、SNP位點(diǎn)篩查等基于核酸突變的領(lǐng)域，尤其是對各種耐藥病毒、細(xì)菌以及基因分型或感染初期檢查具有重要的檢測意義，進(jìn)而能夠?yàn)榕R床早期診斷，早 期治療及指導(dǎo)用藥提供參考依據(jù)。
[0059]下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的方案進(jìn)行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自Illumina公司。
[0060]其中，表1示出了下面實(shí)施例中所用到的部分試劑:
[0061]表1
[0062]
【權(quán)利要求】
1.一種確定樣品中是否存在目標(biāo)物的方法，其特征在于，包括: (1)提供基板，所述基板由疏水材料形成，并且在所述基板的表面形成有捕獲探針，其中，所述捕獲探針能夠與所述目標(biāo)物結(jié)合，并且所述捕獲探針與所述目標(biāo)物的結(jié)合能夠提高所述基板表面的親水性； (2)在捕獲探針能夠與所述目標(biāo)物結(jié)合的條件下，使所述樣品與所述基板接觸； (3)提高所述基板表面的潮濕度；以及 (4)確定所述基板表面是否形成水斑，其中，所述水斑的形成是所述樣品中存在所述目標(biāo)物的指示， 任選地，所述目標(biāo)物為選自核酸和蛋白質(zhì)的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)物為DNA， 任選地，所述基板為硅片、硝酸纖維素膜、尼龍膜或載玻片， 任選地,所述捕獲探針為核酸分子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針與所述目標(biāo)物形成抗體-抗原復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)物為DNA片段，所述捕獲探針為核酸分子，所述捕獲探 針的5’端與所述基板的表面結(jié)合，所述捕獲探針的3’末端形成有游離羥基基團(tuán)， 步驟(2)進(jìn)一步包括: (2-1)在存在報(bào)告探針時(shí)，使所述樣品與所述基板接觸，其中，所述報(bào)告探針的5 ’末端具有游離磷酸基團(tuán)，并且所述報(bào)告探針的包含5’末端堿基的連續(xù)序列和所述捕獲探針的包含3’末端堿基的連續(xù)序列分別與所述目標(biāo)物的一段連續(xù)堿基序列的一部分匹配，以便形成不存在錯(cuò)配的雙鏈結(jié)構(gòu)；以及 (2-2)在連接酶的作用下，使所述報(bào)告探針的5’末端游離磷酸基團(tuán)與所述捕獲探針的3’末端游離羥基基團(tuán)連接，以便使所述報(bào)告探針與所述捕獲探針形成磷酸二酯鍵。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)進(jìn)一步包括: (2-3)破壞所述雙鏈結(jié)構(gòu)，以便使所述目標(biāo)物成為游離狀態(tài)，并在所述基板表面形成由所述捕獲探針和所述報(bào)告探針形成的單鏈連接體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，在步驟(2-3)通過對所述基板進(jìn)行清洗，破壞所述雙鏈結(jié)構(gòu)， 任選地，所述清洗包括: 將所述基板依次進(jìn)行氫氧化鈉浸泡處理和去離子水洗滌。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)進(jìn)一步包括: (2-4)對所述單鏈連接體進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述滾環(huán)擴(kuò)增為選自線性滾環(huán)擴(kuò)增、指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增和超分支滾環(huán)擴(kuò)增的至少一種， 任選地，所述滾環(huán)擴(kuò)增采用環(huán)狀DNA模板進(jìn)行，其中所述環(huán)狀DNA模板的部分序列與所述報(bào)告探針的部分序列互補(bǔ)， 任選地，進(jìn)行所述滾環(huán)擴(kuò)增30分鐘-12小時(shí)，優(yōu)選4小時(shí)， 任選地，所述連接酶為Taq DNA連接酶，任選地,所述捕獲探針的長度為10-40nt。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述目標(biāo)物具有SEQID N0:l-3所示的核苷酸序列，所述捕獲探針具有SEQ ID NO:4-6所示的核苷酸序列,所述報(bào)告探針具有SEQID NO:7所示的核苷酸序列， 其中， 具有SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的捕獲探針能夠與具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的目標(biāo)物結(jié)合，具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的捕獲探針能夠與具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的目標(biāo)物結(jié)合，具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的捕獲探針能夠與具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的目標(biāo)物結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(3)中，通過哈氣提高所述基板表面的潮濕 度。
【文檔編號】C12Q1/68GK103882131SQ201410114508
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】杜亞楠, 謝麗萍 申請人:清華大學(xué)