一株耐酸短雙歧桿菌BB8dpH及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一株耐酸短雙歧桿菌BB8dpH及其應(yīng)用。短雙歧桿菌BB8dpH的16S?rRNA基因部分核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，保藏號為CGMCCNo.8370。本發(fā)明的短雙歧桿菌BB8dpH的獲得，是從健康青年人糞便中分離并在pH3.2酸性條件下進(jìn)一步篩選得到的菌種。發(fā)酵培養(yǎng)過程是，于BL液體培養(yǎng)基(含0.05％半胱氨酸鹽酸鹽)中37℃厭氧培養(yǎng)24h。本發(fā)明的短雙歧桿菌BB8dpH對酸的耐受性能顯著優(yōu)于普通菌株，且耐酸性能具有遺傳穩(wěn)定性，具有與普通菌株不同的細(xì)胞膜脂肪酸含量百分比，平均碳鏈長度顯著長于普通菌株，細(xì)胞膜流動性顯著低于普通菌株?？捎糜谌粘０l(fā)酵食品、保健食品和藥品的生產(chǎn)領(lǐng)域中。
【專利說明】—株耐酸短雙歧桿菌BB8dpH及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物，具體涉及一株耐酸短雙歧桿菌BB8dpH及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人體胃腸道定植著各種細(xì)菌，根據(jù)其對人體健康的影響可分為有益菌、有害菌和中性菌。有益菌即對人體有益生作用的益生菌，其中雙歧桿菌和乳桿菌是定植于人體胃腸道的最具代表性的益生菌。當(dāng)益生菌占人體胃腸道優(yōu)勢數(shù)量時有利于人體健康。
[0003]雙歧桿菌屬于革蘭氏陽性菌，是一種專性厭氧菌，無運動屬性，生長周期中不產(chǎn)生芽孢，無莢膜和鞭毛。
[0004]雙歧桿菌對環(huán)境pH的變化非常敏感。其最適生長pH為6.7~7.0，一旦高于8.0或低于5.0，雙歧桿菌將停止生長。當(dāng)處于低pH條件下，會導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞大量的死亡，特別是人源性雙歧桿菌酸耐受力非常差。
[0005]雙歧桿菌對環(huán)境溫度的變化也很敏感。當(dāng)溫度介于37~41°C時，生長最為迅速，當(dāng)溫度高于43°C或低于28°C時，其生長極其緩慢或停止生長。在生產(chǎn)應(yīng)用中，雙歧桿菌的最適溫度為35~40°C。
[0006]雙歧桿菌作為重要的益生菌，其對人體具有多種潛在的生理功能，如調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抗癌抗腫瘤、抑制致病菌、消炎、抗衰老、預(yù)防由抗生素引起的腹瀉、降低膽固醇、緩解乳糖不耐癥及增強機體免疫力等功能。
[0007]目前，隨著雙歧桿菌功能研究的深入，其在日常發(fā)酵食品、保健食品和藥品等新產(chǎn)品開發(fā)中的應(yīng)用越來越多。而雙歧桿菌作為重要的益生菌，許多國家法規(guī)要求益生菌食品中的活菌數(shù)在保質(zhì)期內(nèi)必須達(dá)到106~108CFU/ml (g)。為了使其在人體胃腸道有效發(fā)揮益生功能，雙歧桿菌必須具有良好的貯存穩(wěn)定性和對胃腸道的耐受(如耐酸性等)性能。因此，對不利環(huán)境(如胃腸道環(huán)境)適應(yīng)性更強的人源性雙歧桿菌株是可應(yīng)用的重要潛在菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的，就是為了提供一株短雙歧桿菌BBSdpH及其應(yīng)用，短雙歧桿菌BBSdpH具有優(yōu)勢的耐酸性能，且耐酸性具有遺傳穩(wěn)定性，以及具有不同的細(xì)胞膜脂肪酸含量百分比和低的細(xì)胞膜流動性，可作為潛在的益生菌菌株。
[0009]本發(fā)明的短雙歧桿菌BBSdpH已于2013年10月18日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所；保藏登記號為CGMCC N0.8370。其分類命名為:短雙歧桿菌，拉丁名:Bifidobacterium breve。
[0010]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是:一株耐酸短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)BB8dpH，其保藏登記號為 CGMCC 吣.8370，其165 rRNA 基因部分核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。[0011]上述短雙歧桿菌BB8dpH具有以下特性:
[0012](I)優(yōu)勢的耐酸性能
[0013]經(jīng)ρΗ3.2處理3h后，每毫升菌液活菌數(shù)的對數(shù)值log CFU/ml =為8.38±0.35，其耐酸性能明顯優(yōu)于普通菌株；
[0014](2)耐酸性能具有遺傳穩(wěn)定性
[0015]新篩選到的菌株BB8dpH經(jīng)pH3.2處理3h后，其每毫升菌液活菌數(shù)的對數(shù)值logCFU/ml = 8.62±0.51，連續(xù)傳代20次并經(jīng)pH3.2處理3h后，其每毫升菌液活菌數(shù)的對數(shù)值 log CFU/ml = 9.11±0.04 ;
[0016](3)不同的細(xì)胞膜脂肪酸含量百分比
[0017]新篩選到的菌株BB8dpH的C16: O和C16: I脂肪酸含量百分比分別為13.190±0.802 和 3.705±0.215，顯著低于普通菌株；而 C18: O、C18: I 和 cycC19: O脂肪酸含量百分比分別為6.307±0.893,61.160±0.932和10.699±0.582，顯著高于普通菌株；平均碳鏈長度為17.496±0.091，顯著長于普通菌株；
[0018](4)具有更低的細(xì)胞膜流動性
[0019]新篩選到的菌株BB8dpH細(xì)胞膜的微粘度r = 0.144 + 0.001，明顯高于普通菌株，即細(xì)胞膜流動性明顯低于普通菌株。
[0020]上述短雙歧桿菌BBSdpH的獲取方法包括以下步驟:`[0021]A、將新鮮的健康青年人糞便5克用50ml糞便稀釋液振蕩成糞便勻漿液，將Iml糞便勻漿液接入9ml新鮮的pH7.4BL液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑取菌液在PH6.5的TPY固體培養(yǎng)基平板上劃線，37 °C厭氧培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種于50ml新鮮的pH7.4BL液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧過夜培養(yǎng)至平臺期后，7600g離心10min獲得菌體；再將菌體轉(zhuǎn)移至PH3.2的新鮮的BL液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧過夜培養(yǎng)后，7600g離心10min獲得菌體；
[0022]B、再用pH7.4的磷酸緩沖液洗滌兩次后，重懸于500 μ I ρΗ7.4的磷酸緩沖液中，然后涂布于ΡΗ6.5的TPY固體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)3~4天至生長出單菌落，挑取單菌落進(jìn)行鏡檢，確認(rèn)達(dá)到菌株純種分離，并分子鑒定該菌株為短雙歧桿菌，命名為短雙歧桿菌BB8dpH ；
[0023]C、將短雙歧桿菌BB8dpH以I %接種量接種于新鮮的pH7.4BL液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h，即得短雙歧桿菌BB8dpH菌株的發(fā)酵液。
[0024]所述BL液體培養(yǎng)基、TPY固體培養(yǎng)基和磷酸緩沖液中均含有重量百分含量為
0.05%的半胱氨酸鹽酸鹽。
[0025]上述短雙歧桿菌BBSdpH菌株用于日常發(fā)酵食品、保健食品和藥品的生產(chǎn)領(lǐng)域中。
[0026]本發(fā)明的短雙歧桿菌BBSdpH的酸耐受性能顯著優(yōu)于普通菌株，且耐酸性能具有遺傳穩(wěn)定性，具有不同的細(xì)胞膜脂肪酸含量百分比和更低的細(xì)胞膜流動性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為短雙歧桿菌BBSdpH優(yōu)勢的耐酸性能的遺傳穩(wěn)定性分析圖表。
【具體實施方式】[0028]本發(fā)明的短雙歧桿菌BBSdpH的獲得:從健康青年人新鮮糞便中分離并在pH3.5酸性條件下進(jìn)一步篩選得到的菌種。革蘭氏染色呈陽性，專性厭氧，無運動屬性，生長周期中不產(chǎn)生芽孢，無莢膜和鞭毛。
[0029]該短雙歧桿菌已于2013年10月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC(地址:中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)保藏，保藏登記號為CGMCC N0.8370。其分類命名為:短雙歧桿菌，拉丁名:Bifidobacteriumlongum。
[0030]下面結(jié)合實施例和附圖1進(jìn)一步說明本發(fā)明:
[0031]實施例1:菌株的篩選及獲得
[0032]將新鮮的健康青年人糞便5克用50ml糞便稀釋液振蕩成勻漿，將Iml糞便勻漿液接入9ml新鮮的pH7.4BL液體培養(yǎng)基(含0.05%的半胱氨酸鹽酸鹽)試管中，37°C厭氧培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑取菌液在pH6.5的TPY (含0.05%的半胱氨酸鹽酸鹽)固體培養(yǎng)基平板上劃線，37°C厭氧培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種于50ml新鮮的pH7.4BL液體培養(yǎng)基(含
0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)中，37°C厭氧過夜培養(yǎng)至平臺期后，7600g離心10min獲得菌體，再將菌體轉(zhuǎn)移至PH值為3.2的新鮮的含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽BL液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧過夜培養(yǎng)后，7600g離心10min獲得菌體，再用含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽的磷酸緩沖液(pH7.4)洗滌兩次后，重懸于500 μ I含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽的磷酸緩沖液(ρΗ7.4)中，然后涂布于ΡΗ6.5的TPY (含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)固體培養(yǎng)基中，37 °C厭氧培養(yǎng)3~4天至生長出單菌落，挑取單菌落進(jìn)行鏡檢，確認(rèn)達(dá)到菌株純種分離，并分子鑒定該菌株為短雙歧桿菌，命名為短雙歧 桿菌BB8dpH。
[0033]實施例2:菌株的鏡檢
[0034]無菌條件下接種環(huán)挑取短雙歧桿菌BBSdpH，涂于載玻片上，制片并革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。
[0035]實施例3:菌株發(fā)酵
[0036]將短雙歧桿菌BB8dpH以I %接種量接種于新鮮的pH7.4BL液體培養(yǎng)基(含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)中，37°C厭氧培養(yǎng)24h，即得短雙歧桿菌BBSdpH菌株的發(fā)酵液。
[0037]實施例4:短雙歧桿菌BB8dpH優(yōu)勢的耐酸性能
[0038]將待進(jìn)行耐酸性評價的菌株以I %的接種量接種于新鮮的pH7.4BL液體培養(yǎng)基(含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)中，并傳代2次，第3代發(fā)酵液在37°C厭氧培養(yǎng)18h至平臺期，取Iml菌液轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，7600g離心10min獲得菌體，將菌體轉(zhuǎn)移至IOml pH值為3.2的新鮮的BL液體培養(yǎng)基(含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)中，分別于Oh和3h，37°C厭氧培養(yǎng)后，取100 μ I菌液用含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽的磷酸緩沖液(ρΗ7.4)梯度稀釋后取IOOyl的稀釋菌液涂布于TPY (含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)固體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)3~4天后菌落計數(shù)，并統(tǒng)計在pH3.2的BL液體培養(yǎng)基(含0.05%半胱氨酸鹽酸鹽)中培養(yǎng)Oh和3h后的菌體濃度。本實施例采用實驗室保存的分離自商業(yè)化產(chǎn)品的短雙歧桿菌BBM作為對照菌株。短雙歧桿菌的BBSdpH優(yōu)勢的耐酸性能如表1所示。
[0039]表1短雙歧桿菌BB8dpH優(yōu)勢的耐酸性能(pH = 3.5處理4h)
【權(quán)利要求】
1.一株耐酸短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)BB8dpH,其保藏登記號為CGMCCN0.8370，其16S rRNA基因部分核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的短雙歧桿菌BBSdpH，其特征在于，所述短雙歧桿菌BBSdpH具有以下特性: (1)優(yōu)勢的耐酸性能 經(jīng)pH3.2處理3h后，每毫升菌液活菌數(shù)的對數(shù)值log CFU/ml =為8.38±0.35，其耐酸性能明顯優(yōu)于普通菌株； (2)耐酸性能具有遺傳穩(wěn)定性 新篩選到的菌株BB8dpH經(jīng)pH3.2處理3h后，其每毫升菌液活菌數(shù)的對數(shù)值log CFU/ml = 8.62 ±0.51，連續(xù)傳代20次并經(jīng)pH3.2處理3h后，其每毫升菌液活菌數(shù)的對數(shù)值logCFU/ml = 9.11 ±0.04 ; (3)不同的細(xì)胞膜脂肪酸含量百分比 新篩選到的菌株BB8dpH的C16: O和C16: I脂肪酸含量百分比分別為13.190±0.802 和 3.705±0.215，顯著低于普通菌株；而 C18: O、C18: I 和 cycC19: O脂肪酸含量百分比分別為6.307±0.893,61.160±0.932和10.699±0.582，顯著高于普通菌株；平均碳鏈長度為17.496±0.091，顯著長于普通菌株； (4)具有更低的細(xì)胞膜流動性 新篩選到的菌株BB8dpH細(xì)胞膜的微粘度r = 0.144 + 0.001，明顯高于普通菌株，即細(xì)胞膜流動性明顯低于普通菌株·。
3.權(quán)利要求1所述短雙歧桿菌BBSdpH的獲取方法，其特征在于，包括以下步驟: A、將新鮮的健康青年人糞便5克用50ml糞便稀釋液振蕩成糞便勻漿液，將Iml糞便勻漿液接入9ml新鮮的pH7.4BL液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h，用接種環(huán)挑取菌液在PH6.5的TPY固體培養(yǎng)基平板上劃線，37 °C厭氧培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種于50ml新鮮的pH7.4BL液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧過夜培養(yǎng)至平臺期后，7600g離心10min獲得菌體；再將菌體轉(zhuǎn)移至PH3.2的新鮮的BL液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧過夜培養(yǎng)后，7600g離心10min獲得菌體； B、再用pH7.4的磷酸緩沖液洗滌兩次后，重懸于500 μ I ρΗ7.4的磷酸緩沖液中，然后涂布于ΡΗ6.5的TPY固體培養(yǎng)基中，37 °C厭氧培養(yǎng)3~4天至生長出單菌落，挑取單菌落進(jìn)行鏡檢，確認(rèn)達(dá)到菌株純種分離，并分子鑒定該菌株為短雙歧桿菌，命名為短雙歧桿菌BB8dpH ； C、將短雙歧桿菌BB8dpH以I%接種量接種于新鮮的pH7.4BL液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)24h，即得短雙歧桿菌BB8dpH菌株的發(fā)酵液。
4.如權(quán)利要求3所述的短雙歧桿菌BB8dpH的獲取方法，其特征在于，所述BL液體培養(yǎng)基、TPY固體培養(yǎng)基和磷酸緩沖液中均含有重量百分含量為0.05%的半胱氨酸鹽酸鹽。
5.如權(quán)利要求1所述的短雙歧桿菌BBSdpH的應(yīng)用，其特征在于:所述的短雙歧桿菌BBSdpH菌株用于日常發(fā)酵食品、保健食品和藥品的生產(chǎn)領(lǐng)域中。
【文檔編號】C12N1/20GK103849590SQ201410114654
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】楊虹, 楊旭, 杭曉敏, 羅程, 譚晶 申請人:上海交通大學(xué)