快速高通量提取植物基因組dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種快速高通量提取植物基因組DNA的方法，該方法是將待提取植物材料分別置于96孔板內(nèi)，然后在每孔中放入鋼珠并進(jìn)行液氮速凍，再借助破碎儀將96孔板內(nèi)的所述待提取植物材料進(jìn)行充分研磨，最后通過改良NaOH、CTAB或SDS法從研磨后的粉末中提取DNA，在所述提取DNA的過程中均利用Zephyr?MBW核酸工作站的96通道進(jìn)行各種試劑的添加。該方法具有高通量、低成本、速度快等優(yōu)勢，另外，本發(fā)明的提取方法簡單、得到的基因組DNA純度高、穩(wěn)定性好。
【專利說明】快速高通量提取植物基因組DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)的基礎(chǔ)領(lǐng)域，具體涉及一種快速高通量提取植物基因組DNA的方法，該方法快速、高通量、低成本，既可以從植物多個組織中提取基因組DNA，也可以從種子中提取基因組DNA。
【背景技術(shù)】
[0002]植物材料的基因組DNA的獲取是進(jìn)行基因定位研究、分子標(biāo)記輔助育種、種子純度鑒定和轉(zhuǎn)基因材料鑒定等相關(guān)研究的基礎(chǔ)。植物種子DNA提取和純度鑒定、抗病性檢測是確保種子高質(zhì)量安全上市的必備步驟和重要保障。目前，最常用的提取植物基因組DNA的方法是利用大量的EP管(1.5-2ml等規(guī)格)手工抽提，過程耗時耗力，每天提取的樣品數(shù)量非常有限，僅約為200-400個樣品/人；而且存在一系列問題，如重復(fù)使用研缽引起的交叉污染、大量EP管編號困難容易出錯、樣品提取過程人為誤差大、DNA結(jié)果檢測差異大、單個樣品提取成本高、不能進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)?；僮鞯鹊取＿@些常規(guī)的DNA人工提取方法不能滿足短時間內(nèi)進(jìn)行大量植物材料的分子標(biāo)記篩選和種子純度鑒定的需要。
[0003]隨著植物科研和育種規(guī)模的快速發(fā)展，植物材料和種子DNA的大規(guī)模提取也逐漸成為上述研究的重要限制因素。因此，研究植物材料和種子DNA的高通量、快速、低成本提取技術(shù)體系具有重要的意義。目前，各育種公司和科研機構(gòu)也紛紛展開了此方面的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù) 的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種快速高通量提取植物基因組DNA的方法。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案:
[0006]一種快速高通量提取植物基因組DNA的方法，將待提取植物材料分別置于96孔板內(nèi)，然后在每孔中放入鋼珠并進(jìn)行液氮速凍，再借助破碎儀將96孔板內(nèi)的所述待提取植物材料進(jìn)行充分研磨，最后通過改良NaOH、CTAB或SDS法從研磨后的粉末中提取DNA，在所述提取DNA的過程中均利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道進(jìn)行各種試劑的添加。
[0007]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述待提取植物材料為植物的新鮮或真空凍干的真葉、嫩莖、子葉、嫩根或花部分的組織，或者所述組織的培養(yǎng)材料，所述96孔板每孔的待提取植物材料的用量為孔內(nèi)容積的1/8-1/4 (比如1/7、1/6或1/5)，比如針對孔容積為(l-2ml)的96孔板，植物組織鮮樣每孔用量為10-500mg，干樣或干粉每孔用量為5_50mg，用量過多或過少都會影響DNA的提取效率。
[0008]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述待提取植物材料還可以為經(jīng)催芽后的待提取植物種子，優(yōu)選地，所述經(jīng)催芽后的待提取植物種子的胚芽長度為l_3cm。
[0009]在上述方法中，所述植物可以為玉米、高粱、水稻、小麥、大豆、番茄、黃瓜、蘿卜、油菜、菠菜、韭菜、大蔥、洋蔥、大白菜、西瓜、甜瓜、辣椒、茄子、青花菜、花椰菜或小白菜等。
[0010]在上述方法中，所述96孔板可以為96孔深孔板或96孔PCR板。[0011]在上述方法中，當(dāng)所述待提取植物種子較小時，也可以直接將種子置于96孔板內(nèi)或96孔PCR板加適量水后進(jìn)行催芽，催芽后將孔內(nèi)多余的水分吸出以便于后續(xù)的操作。
[0012]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述改良NaOH法從研磨后的粉末中提取DNA的具體方法為:
[0013]步驟一,立即通過Zephyr MBW核酸工作站的96通道向裝有研磨后粉末的96孔板的各孔中加入 100-300 μ L (比如 120μ L、150y L、200y L、260y L 或 290 μ L) 0.2mol/L 的NaOH溶液，混勻后將所述96孔板置沸水浴中l(wèi)min，再加100 μ L、pH=8.0的Tris-Hcl，混勻后將所述96孔板置沸水浴中2min,之后4000rpm離心l_5min ；
[0014]步驟二，利用Z印hyr MBff核酸工作站的96通道從96孔板的各孔中取10-50 μ L(比如15μ L>20 μ L>25 μ L>30 μ L或45μ L)離心后的上清液到新的96孔板中，再加入190-950 μ L (比如 200 μ L、300 μ L、400 μ L、500 μ L、600 μ L、700 μ L、800 μ L 或 900 μ L)0.2mol/L、pH=8.0 的 Tris-Hcl 進(jìn)行稀釋溶解。
[0015]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述CTAB法從研磨后的粉末中提取DNA的具體方法為:
[0016]步驟一,立即通過Zephyr MBW核酸工作站的96通道向裝有研磨后粉末的96孔板的各孔中加入 500-600 μ L (比如 510 μ L、550 μ L、570 μ L、580 μ L 或 590 μ L) CTAB 提取液，于65°C水浴10-15min (比如12min或14min)后向各孔中加入與各孔溶液等體積的氯仿與異戍醇的混合液，混勻后4000rpm離心5_12min (比如7min或Ilmin),其中在所述氯仿與異戊醇的混合液中，氯仿與異戊醇的體積比為24:1，在所述CTAB提取液中各成分的濃度如下:0.1M Tris-HCl (ρΗ=8.0), 0.02Μ EDTA, 1.4M NaCl, 0.2νο1%β -巰基乙醇，0.05Μ CTAB ；
[0017]步驟二，利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道將96孔板的各孔中離心后的上清液轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，然后向所述新的96孔板的各孔中加入各孔溶液2/3體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，置_20°C冰箱I小時或_80°C冰箱lOmin，再在4000rpm離心10min，去除上清液，沉淀為提取的基因組DNA ；
[0018]步驟三,利用Zephyr MBW核酸工作站的96通道向步驟二離心得到的沉淀中分別加入100-200 μ L70%乙醇進(jìn)行清洗,之后抽掉乙醇置通風(fēng)櫥晾干,干樣為DNA,然后用水或TE進(jìn)行稀釋溶解。
[0019]在上述方法中，作為一種優(yōu)選實施方式，所述SDS法從研磨后的粉末中提取DNA的具體方法為:
[0020]步驟一,立即通過Zephyr MBW核酸工作站的96通道向裝有研磨后粉末的96孔板的各孔中加入lml65°C預(yù)熱的提取緩沖液，加入100 μ L20wt% (比如12wt%、15wt%、17wt%或19wt%)的SDS，并將96孔板于65°C水浴20min，期間搖勻1-2次；然后加入300-500 μ L5mol/L KAc,混勻后繼續(xù)于65°C水浴30min ;降至室溫后進(jìn)行4000rpm離心10min,其中在所述提取緩沖液中各成分的濃度如下:IOOmM Tris-Hcl (pH=8.0),50mM EDTA (pH=8.0),500mMNaCl，IOmM β-巰基乙醇；
[0021]步驟二，利用Z印hyr MBff核酸工作站的96通道將經(jīng)步驟一離心后的96孔板各孔中的上清液轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，并向各孔中加入與孔中溶液等體積的氯仿和異戊醇的混合液，混勻后4000rpm離心5min,其中在所述氯仿和異戍醇的混合液中，氯仿與異戍醇的體積比為24:1 ；[0022]步驟三，利用Z印hyr MBff核酸工作站的96通道將經(jīng)步驟二離心后的96孔板各孔中的上清液轉(zhuǎn)移到另一新的96孔板中，向所述另一新的96孔板的各孔中加入各孔溶液2/3體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，置_20°C冰箱I小時或_80°C冰箱lOmin，4000rpm離心lOmin，去除上清液，沉淀為提取的基因組DNA ；
[0023]步驟四，利用Zephyr MBW核酸工作站的96通道向步驟三得到的沉淀中加入100-200 μ 170%乙醇進(jìn)行清洗,之后抽掉乙醇置通風(fēng)櫥晾干,干樣為DNA,然后用水或TE進(jìn)行稀釋溶解。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0025]本發(fā)明提供了一套高通量、低成本、快速提取植物DNA的技術(shù)體系，以96孔板(0.25-2ml不同規(guī)格)、96通道Z印hyr MBff核酸工作站為載體，每4板樣品(384個樣品)DNA提取在IOmin-1h內(nèi)完成(堿法最快IOmin完成，SDS和CTAB法約需lh)。實現(xiàn)每人每天(8小時)可完成至少3702-18432個樣品的DNA提取任務(wù)，如進(jìn)行統(tǒng)籌計劃，可完成更多樣品DNA (8000-30000余份材料)的提取任務(wù)，且單個樣品成本降至0.3-1元人民幣。本發(fā)明為遺傳群體材料分析、分子標(biāo)記輔助育種、種子純度鑒定、轉(zhuǎn)基因材料鑒定等研究和實際應(yīng)用提供技術(shù)支撐。另外，本發(fā)明采用自配試劑配方、不使用酶試劑，成本低，提取方法簡單，在移液步驟中利用工作站即能實現(xiàn)半自動化，得到的基因組DNA純度高、無蛋白及RNA污染，穩(wěn)定性好?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0026]圖1是本發(fā)明采用CTAB法和SDS法進(jìn)行高通量低成本快速提取植物DNA的流程圖；
[0027]圖2是黃瓜種子96孔深孔板播種催芽示意圖；
[0028]圖3是Z印hyr工作站結(jié)合改良的CTAB法提取的黃瓜葉片DNA純度檢測電泳示意圖；
[0029]圖4是以Z印hyr工作站結(jié)合改良的CTAB法提取的黃瓜葉片DNA為模板經(jīng)PCR擴增后的結(jié)果示意圖；
[0030]圖5是Z印hyr工作站結(jié)合改良的NaOH法提取的黃瓜種子DNA純度檢測電泳示意圖；
[0031]圖6是以Z印hyr工作站結(jié)合改良的NaOH法提取的黃瓜種子DNA為模板經(jīng)PCR擴增后的結(jié)果示意圖；
[0032]圖7是Z印hyr工作站結(jié)合改良的SDS法提取的黃瓜葉片DNA純度檢測電泳示意圖；
[0033]圖8是以Z印hyr工作站結(jié)合改良的SDS法提取的黃瓜葉片DNA為模板經(jīng)PCR擴增后的結(jié)果示意圖。
【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，目的在于更好地理解本
【發(fā)明內(nèi)容】
，并非限制本發(fā)明于此。
[0035]本發(fā)明涉及的96孔深孔板或96孔PCR板購自北京泰博昌生物技術(shù)有限公司，以下實施例中使用的96孔深孔板或96孔PCR板各孔的規(guī)格為1.5ml ;鋼珠購自北點泰博昌生物技術(shù)有限公司；低溫干燥設(shè)備購置基因公司的丹麥labogene CS55-9型；組織破碎儀為GTlOO型,購自北京格瑞德曼公司；Zephyr工作站為Caliper Zephyr系列核酸工作站，購自基因公司；離心機為5810R型離心機，購自Eppendoff公司；紫外分光光度儀為ThermoScientific ND2000微量分光光度儀，購自基因公司。
[0036]以下實施例中使用的溶液的配制方法:
[0037]CTAB提取液的配制:以配制1000mL為例
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種快速高通量提取植物基因組DNA的方法，其特征在于，將待提取植物材料分別置于96孔板內(nèi)，然后在每孔中放入鋼珠并進(jìn)行液氮速凍，再借助破碎儀將96孔板內(nèi)的所述待提取植物材料進(jìn)行充分研磨，最后通過改良NaOH、CTAB或SDS法從研磨后的粉末中提取DNA,在所述提取DNA的過程中均利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道進(jìn)行各種試劑的添加。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待提取植物材料為植物的新鮮或真空凍干的真葉、嫩莖、子葉、嫩根或花部分的組織，或者所述組織的培養(yǎng)材料，所述96孔板每孔的待提取植物材料的用量為孔內(nèi)容積的1/8-1/4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待提取植物材料為經(jīng)催芽后的待提取植物種子，優(yōu)選地，所述經(jīng)催芽后的待提取植物種子的胚芽長度為l_3cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物為玉米、高粱、水稻、小麥、大豆、番茄、黃瓜、蘿卜、油菜、菠菜、韭菜、大蔥、洋蔥、大白菜、西瓜、甜瓜、辣椒、茄子、青花菜、花椰菜或小白菜。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述96孔板為96孔深孔板或96孔PCR板。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述改良NaOH法從研磨后的粉末中提取DNA的具體方法為: 步驟一,立即通過Zephyr MBff核酸工作站的96通道向裝有研磨后粉末的96孔板的各孔中加入100-300 μ L0.2mol/L的NaOH溶液，混勻后將所述96孔板置沸水浴中l(wèi)min，再加100 μ L、pH=8.0的Tris-Hcl，混勻后將所述96孔板置沸水浴中2min，之后4000rpm離心l_5min ； 步驟二，利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道從96孔板的各孔中取10-50 μ L離心后的上清液到新的96孔板中，再加入190-950 μ L pH=8.0,0.2mol/L的Tris-Hcl進(jìn)行稀釋溶解。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述CTAB法從研磨后的粉末中提取DNA的具體方法為: 步驟一，立即通過Zephyr MBff核酸工作站的96通道向裝有研磨后粉末的96孔板的各孔中加入500-600 μ L CTAB提取液，于65°C水浴10-15min后向各孔中加入與各孔溶液等體積的氯仿與異戍醇的混合液，混勻后4000rpm離心5_12min,其中在所述氯仿與異戍醇的混合液中，氯仿與異戊醇的體積比為24:1，在所述CTAB提取液中各成分的濃度如下:pH=8.0、0.1MTris-HCl, 0.02M EDTA, 1.4M NaCl, 0.2νο1%β -巰基乙醇，0.05Μ CTAB ； 步驟二，利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道將96孔板的各孔中離心后的上清液轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，然后向所述新的96孔板的各孔中加入各孔溶液2/3體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，置_20°C冰箱I小時或_80°C冰箱lOmin，再在4000rpm離心10min，去除上清液，沉淀為提取的基因組DNA ； 步驟三,利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道向步驟二離心得到的沉淀中分別加入100-200 μ L70%乙醇進(jìn)行清洗,之后抽掉乙醇置通風(fēng)櫥晾干,干樣為DNA,然后用水或TE進(jìn)行稀釋溶解。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方 法，其特征在于，所述SDS法從研磨后的粉末中提取DNA的具體方法為: 步驟一，立即通過Zephyr MBff核酸工作站的96通道向裝有研磨后粉末的96孔板的各孔中加入lml65°C預(yù)熱的提取緩沖液，加入100 μ L10-20wt%的SDS，并將96孔板于65°C水浴20min，期間搖勻1-2次；然后加入300-500 μ L5mol/L KAc,混勻后繼續(xù)于65°C水浴30min ;降至室溫后進(jìn)行4000rpm離心10min,其中在所述提取緩沖液中各成分的濃度如下:ρΗ=8.0、100mmol/L Tris-Hcl, ρΗ=8.0、50mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, IOmMβ -疏基乙醇； 步驟二，利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道將經(jīng)步驟一離心后的96孔板各孔中的上清液轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，并向各孔中加入與孔中溶液等體積的氯仿和異戊醇的混合液，混勻后4000rpm離心5min,其中在所述氯仿和異戍醇的混合液中，氯仿與異戍醇的體積比為24:1 ； 步驟三，利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道將經(jīng)步驟二離心后的96孔板各孔中的上清液轉(zhuǎn)移到另一新的96孔板中，向所述另一新的96孔板的各孔中加入各孔溶液2/3體積的異丙醇或2倍體積的乙醇，置_20°C冰箱I小時或_80°C冰箱10min，4000rpm離心lOmin，去除上清液，沉淀為提取的基因組DNA ； 步驟四，利用Zephyr MBff核酸工作站的96通道向步驟三得到的沉淀中加入100-200 μ 170%乙醇進(jìn)行清洗,之后抽掉乙醇置通風(fēng)櫥晾干,干樣為DNA,然后用水或TE進(jìn)行稀釋溶解。
【文檔編號】C12N15/10GK103882010SQ201410115253
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月25日
【發(fā)明者】溫常龍, 許勇, 于拴倉, 趙泓, 董從娟 申請人:北京市農(nóng)林科學(xué)院