雞新城疫病毒弱毒株、滅活疫苗及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了雞新城疫病毒弱毒株、滅活疫苗及其應(yīng)用，屬于雞新城疫病毒株的分離和應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明從雞病料中分離得到一株雞新城疫病毒弱毒株（DL11株），其微生物保藏編號(hào)為：CGMCC?NO.7958；經(jīng)過(guò)血凝和血凝抑制試驗(yàn)證明本發(fā)明所分離的病毒株為雞新城疫病毒株；靜脈接種致病指數(shù)測(cè)定試驗(yàn)證明該病毒株為雞新城疫病毒弱毒株。本發(fā)明分離的雞新城疫病毒弱毒株半成品紅細(xì)胞凝集價(jià)、病毒含量均高于《獸用生物制品規(guī)程》的標(biāo)準(zhǔn)，制備成本較低，適合大生產(chǎn)要求；用本發(fā)明的弱毒株制備的滅活疫苗，其免疫效力高，能抵抗強(qiáng)毒株攻擊，可作為疫苗株應(yīng)用于雞新城疫的預(yù)防或診斷。
【專利說(shuō)明】雞新城疫病毒弱毒株、滅活疫苗及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株病毒弱毒株，尤其涉及一株雞新城疫病毒(Newcastle diseasevirus)弱毒株，本發(fā)明還涉及該雞新城疫病毒弱毒株制備的滅活疫苗及其在制備預(yù)防、治療或診斷新城疫藥物或試劑中的應(yīng)用，屬于雞新城疫病毒弱毒株的分離和應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]新城疫(Newcastle disease, ND)是禽類的一種急性、高度接觸性傳染病，其病原為新城疫病毒(Newcastle disease virus, ND V)。ND給世界養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅并造成巨大損失，被國(guó)際獸疫局定為I類烈性傳染病，因此新城疫是禽病研究的重點(diǎn)。盡管中國(guó)新城疫免疫接種已經(jīng)普及多年并己基本上控制了典型新城疫的流行，但非典型ND仍時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展。
[0003]根據(jù)新城疫病毒株致病性程度和發(fā)病后的病理變化的不同將其分為速發(fā)型毒株、中發(fā)型毒株和緩發(fā)型毒株。NDV只有一種血清型，但不同毒株的致病力、生物學(xué)特性及理化特性卻不盡相同，即使毒力相同的毒株，在病毒紅細(xì)胞凝集譜、病毒熱穩(wěn)定性等方面也存在明顯差異。單克隆抗體等技術(shù)的應(yīng) 用從免疫學(xué)角度證實(shí)了不同毒株間的抗原決定簇存在差異，同時(shí)也證明免疫壓力足以導(dǎo)致NDV的抗原變異。分子克隆技術(shù)的發(fā)展又進(jìn)一步從分子水平證實(shí)了不同毒株的基因組間核苷酸一級(jí)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)上的差異，這些差異的存在給目前只使用少數(shù)幾株疫苗來(lái)防制ND這種嚴(yán)重的禽類傳染病的可行性提出了質(zhì)疑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供一株雞新城疫病毒(Newcastle disease virus, ND V)弱
毒株;
[0005]本發(fā)明的目的之二是將所述的雞新城疫病毒弱毒株應(yīng)用于防治或診斷雞新城疫。
[0006]本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0007]一株雞新城疫病毒(Newcastle disease virus)弱毒株,其微生物保藏編號(hào)為:CGMCC N0.7958 ;分類命名為:雞新城疫病毒；保藏單位:中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏時(shí)間是2013年7月16日:保藏地址:中國(guó)北京朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0008]本發(fā)明主要通過(guò)以下方式分離得到所述的雞新城疫病毒弱毒株:本發(fā)明人在黑龍江省大慶市郊某養(yǎng)殖場(chǎng)的瀕死雞中采集瀕死雞肝臟，研磨后用1500單位青、鏈霉素溶液于4°C處理12h，2000r/min離心，取上清接種雞胚，收集48h_96h死亡雞胚尿囊液。經(jīng)過(guò)血凝和血凝抑制試驗(yàn)證明，本發(fā)明所分離的病毒株為雞新城疫病毒株；本發(fā)明進(jìn)一步將所收獲的雞胚尿囊液在雞胚盲傳5代；用PBS將長(zhǎng)成單層的CEF清洗，接種萬(wàn)倍稀釋的雞胚毒，37°C吸附I小時(shí)后，加入含2%犢牛血清的DMEM，至37°C、5%C02環(huán)境培養(yǎng)，待細(xì)胞80%出現(xiàn)病變后，至-20°C凍融3次后，收獲細(xì)胞毒，進(jìn)行15次連續(xù)傳代培養(yǎng)，傳至第20代最終分離獲得一株雞新城疫病毒弱毒DLll株。[0009]靜脈接種致病指數(shù)(IVPI)的測(cè)定試驗(yàn)表明，本發(fā)明所分離的雞新城疫病毒DLll株的IVPI為0，說(shuō)明該DLll株為弱毒株，通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，DLll株半成品的紅細(xì)胞凝集價(jià)、病毒含量均高于《獸用生物制品規(guī)程》的標(biāo)準(zhǔn)，生產(chǎn)成本較低，適合大生產(chǎn)的要求；用DLll株制備的滅活疫苗的免疫效力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于1: 16，且能抵抗強(qiáng)毒株攻擊，完全能作為疫苗株進(jìn)行使用。
[0010]本發(fā)明的另一個(gè)目的是用所分離的雞新城疫病毒弱毒株(DL11株)制備成雞新城疫滅活疫苗，將其用于預(yù)防或治療雞新城疫。
[0011]由此，本發(fā)明提供了一種雞新城疫滅活疫苗的制備方法，包括:
[0012](I)培養(yǎng)所分離的雞新城疫病毒弱毒株(DLl I株)，得到病毒液；
[0013](2)向病毒液中加入滅活劑,將病毒液滅活；
[0014](3)向滅活后的病毒液中加入佐劑制備得到水相；
[0015](4)將水相加入到油相中，混合均勻，乳化，即得。
[0016]優(yōu)選的，所述的水相按照以下方法制備得到:
[0017]按重量份計(jì)，取滅活抗原液96份，加入4份滅菌吐溫-80，充分?jǐn)嚢瑁钡酵聹豞80完全溶解，即得。
[0018]其中，所述的油相由白油、司本-80和硬脂酸鋁組成；更優(yōu)選的，所述的油相通過(guò)以下方法制備得到:按重量份計(jì)，將白油94份和司本-806份混合后加熱，另加硬脂酸鋁2份，邊加邊攪拌，直至透明為止，高壓滅菌，冷卻后備用，即得。
[0019]本發(fā)明所涉及到術(shù)語(yǔ)及定義
[0020]術(shù)語(yǔ)“滅活疫苗”是指包含不能再?gòu)?fù)制或生長(zhǎng)的感染性生物或病原體的疫苗組合物。病原體可以是細(xì)菌、病毒或原生動(dòng)物來(lái)源的。滅活可以通過(guò)多種方法來(lái)完成，包括凍融、化學(xué)處理、超聲處理、輻射、熱或足以阻止感染性生物或病原體復(fù)制或生長(zhǎng)同時(shí)保留其免疫原性的任何其他常規(guī)方法。
[0021]術(shù)語(yǔ)“佐劑”是指加入疫苗中以增加疫苗的免疫原性的物質(zhì)。
[0022]術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”指用于包含疫苗抗原的可以注射入宿主而無(wú)不良效應(yīng)的流體媒介物。本領(lǐng)域已知的合適的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于無(wú)菌水、鹽水、葡萄糖、右旋糖或緩沖溶液。載體可以包含輔助試劑，包括但不限于稀釋劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、PH緩沖劑、黏度增強(qiáng)添加劑或著色劑等。
[0023]術(shù)語(yǔ)“疫苗組合物”包括在藥學(xué)上可接受的載體中用于在宿主中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的至少一種抗原或免疫原。疫苗組合物可以以劑量或通過(guò)獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)或劑量進(jìn)行施用，在施用劑量時(shí)可以綜合考慮動(dòng)物的年齡、性別、體重和得病狀況等因素；施用途徑可以是經(jīng)皮例如皮肉、肌肉、皮下等；疫苗組合物可以單獨(dú)施用，或可以與其它處理或治療共同施用。疫苗組合物中還可以包含輔助物質(zhì)，例如:濕潤(rùn)或乳化劑、pH緩沖劑、佐劑、黏度增強(qiáng)添加劑或著色劑等。
[0024]術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”指在動(dòng)物引發(fā)的應(yīng)答。免疫應(yīng)答可以指細(xì)胞免疫、體液免疫或同時(shí)包含二者。
【具體實(shí)施方式】
[0025]通過(guò)下列實(shí)施例將更具體說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026]通用的試驗(yàn)方法
[0027]一、微量紅細(xì)胞凝集(HA)試驗(yàn)
[0028]I向微量血凝板每孔中加入PBS25 μ 1，共做4行平行重復(fù)。
[0029]2吸取抗原加入到第I列各孔，每孔25 μ 1，然后自左向右進(jìn)行2倍系列稀釋至第11列孔，從第11列各孔吸取25 μ I混合液，棄去。第12列各孔不加抗原，作為對(duì)照孔。
[0030]3向每孔中加入1%紅細(xì)胞懸液25 μ I。
[0031]4將微量血凝板置微型震蕩器上震蕩I分鐘。
[0032]5將微量血凝板置室溫作用30分鐘，判定結(jié)果。以使紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋度作為該抗原的HA效價(jià)。
[0033]二、微量血凝抑制(HI)試驗(yàn)
[0034]I在96孔微量板上，第I孔至第12孔，每孔加入25 μ I PBS0 [0035]2向第I孔中加入被檢血清25 μ 1，依次2倍系列稀釋至第12孔，最后從第12孔棄去25 μ I混合液。
[0036]3向每孔中加入25 μ 14ΗΑ單位工作抗原液，置微型震蕩器上震蕩I分鐘。
[0037]4置室溫下作用30分鐘。
[0038]5向每孔加入1%紅細(xì)胞懸液25 μ 1，置微型震蕩器上震蕩I分鐘。
[0039]6置室溫作用30分鐘，判定結(jié)果。
[0040]7每次測(cè)定時(shí)應(yīng)設(shè)陰性血清對(duì)照和已知HI抗體效價(jià)的陽(yáng)性血清對(duì)照。
[0041]8結(jié)果判定當(dāng)陰性血清HI效價(jià)不高于1: 8 (微量法)、陽(yáng)性血清HI效價(jià)與規(guī)定效價(jià)相比誤差不超過(guò)I個(gè)滴度時(shí)，方可成立。紅細(xì)胞沉淀呈淚珠狀流淌，判為HI陽(yáng)性；紅細(xì)胞在孔底均勻分布或呈鋸齒狀凝集，判為HI陰性。以完全抑制4ΗΑ單位抗原的血清最高稀釋度作為待檢血清的HI抗體效價(jià)。
[0042]三、病毒含量的測(cè)定試驗(yàn)
[0043]將毒種用滅菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10'10-8、10-93個(gè)稀釋度，各尿囊腔內(nèi)接種10~11日齡SPF雞胚5枚，每胚0.1ml，置36~37°C繼續(xù)孵育，48小時(shí)以前死亡的雞胚棄去不計(jì)，在48~120小時(shí)死亡的雞胚隨時(shí)取出，至120小時(shí)，取出所有活胚，逐枚收獲雞胚液，分別測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)，凝集價(jià)不低于1:160 (微量法1:128)者判為感染，計(jì)算EID50 0每0.1ml病毒含量應(yīng)不低于18 0EID500
[0044]實(shí)施例1雞新城疫病毒弱毒株(DL11株)的分離、培養(yǎng)和鑒定
[0045]1、病料采集
[0046]雞病料來(lái)自黑龍江省大慶市郊某養(yǎng)殖場(chǎng)，采集瀕死雞肝臟，研磨后用1500單位青、鏈霉素溶液于4°C處理12h，2000r/min離心，取上清接種雞胚，收集48h~96h死亡雞胚
尿囊液。
[0047]2、病毒分離株血凝(HA)和血凝抑制(HI)試驗(yàn)
[0048]對(duì)收獲的雞胚液進(jìn)行血凝試驗(yàn)，HA血凝價(jià)為Slog2。
[0049]分別用禽流感H5、H7和H9亞型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清及ND、EDS標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清與雞胚尿囊液進(jìn)行HI試驗(yàn)。
[0050]結(jié)果表明，與禽流感H5、H9、H7亞型和EDS病毒標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)為陰性，與ND標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)為陽(yáng)性。
[0051]3、分離培養(yǎng)
[0052]3.1病毒在雞胚上的傳代
[0053]將收獲的病毒液在雞胚盲傳5代。
[0054]3.2病毒在細(xì)胞上的傳代
[0055]3.2.1細(xì)胞的制備
[0056]取9~11日齡SPF雞胚，去除頭、四肢和內(nèi)臟，剪成Imm3左右的組織塊。PBS洗3遍，用0.25%胰酶消化5~15min，棄去胰酶，加入含10%犢牛血清的DMEM，用吸管將CEF細(xì)胞(請(qǐng)給出CEF細(xì)胞的商業(yè)購(gòu)買途徑)輕輕吹打均勻至培養(yǎng)瓶中，37°C、5%C02環(huán)境培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后使用。
[0057]3.2.2接種與收獲
[0058]用PBS將長(zhǎng)成單層的CEF清洗3遍，接種萬(wàn)倍稀釋的雞胚毒，37°C吸附I小時(shí)后，加入含2%犢牛血清的DMEM，至37°C、5%C02環(huán)境培養(yǎng)，待細(xì)胞80%出現(xiàn)病變后，至_20°C凍融3次后，收獲細(xì)胞毒。重復(fù)此步驟15次。部分代次種毒紅細(xì)胞凝集價(jià)、種毒病毒含量、疫苗血清HI抗體以及疫苗攻毒保護(hù)率的測(cè)定數(shù)據(jù)結(jié)果分別見(jiàn)表1-4 ;收獲細(xì)胞毒，進(jìn)行15次連續(xù)傳代培養(yǎng)，傳至第20代，本發(fā)明最終篩選獲得一株弱毒疫苗株(DLlI株)，將該DLll毒株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，微生物保藏編號(hào)為=CGMCCN0.7958。
[0059]表1部分代次種毒紅細(xì)胞凝集價(jià)(HA)的測(cè)定
[0060]
【權(quán)利要求】
1.一株雞新城疫病毒(Newcastlediseasevirus)弱毒株,其特征在于,其微生物保藏編號(hào)為:CGMCC N0.7958。
2.權(quán)利要求1所述的雞新城疫病毒弱毒株在預(yù)防、治療或診斷雞新城疫中的用途。
3.一種預(yù)防或治療雞新城疫的疫苗組合物，其特征在于:含有預(yù)防或治療上有效量的權(quán)利要求1所述的雞新城疫病毒弱毒株以及藥學(xué)上可接受的載體和輔料。
4.一種制備雞新城疫滅活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)培養(yǎng)權(quán)利要求1所述的雞新城疫病毒弱毒株，得到病毒液； (2)向病毒液中加入滅活劑，將病毒液滅活； (3)向滅活后的病毒液中加入佐劑制備得到水相； (4)將水相加入到油相中，混合均勻，乳化，即得。
5.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的水相按照以下方法制備得到:按重量份計(jì)，取滅活抗原液96份，加入4份滅菌吐溫-80，充分?jǐn)嚢瑁钡酵聹?80完全溶解，即得。
6.按照權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的油相由白油、司本-80和硬脂酸鋁組成。
7.按照權(quán)利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述的油相通過(guò)以下方法制備得到:按重量份計(jì)，將白油94份和司本-806份混合后加熱，另加硬脂酸鋁2份，邊加邊攪拌直至透明為止，滅菌冷卻，即得。
【文檔編號(hào)】C12N7/00GK104031888SQ201410116245
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年3月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月26日
【發(fā)明者】邢明偉, 柴洪亮, 曾祥偉, 侯志軍, 田麗紅 申請(qǐng)人:東北林業(yè)大學(xué)