環(huán)狀芽孢桿菌及其在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種環(huán)狀芽孢桿菌及其在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用。環(huán)狀芽孢桿菌菌株（Bacilluscirculans）BLB-32已于2014年2月27日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCCNo.8864。采用本發(fā)明的環(huán)狀芽孢桿菌菌株產(chǎn)酶活力高達(dá)150u/ml以上，采用共生發(fā)酵技術(shù)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)低聚半乳糖，可以實(shí)現(xiàn)一個(gè)罐反應(yīng)達(dá)到大于57%純度的純度，替代傳統(tǒng)的酶反應(yīng)和發(fā)酵反應(yīng)兩步實(shí)施的技術(shù)，得到的低聚半乳糖反應(yīng)液經(jīng)過色譜分離即可得到大于90%的高純度的不同低聚半乳糖含量的系列產(chǎn)品。該技術(shù)可以節(jié)省掉菌體破碎機(jī)和離心機(jī)以及配套設(shè)施投資，節(jié)省占地空間，減少大量的能源消耗。同時(shí)制備的酶充分利用，減少了損失，酶利用率提升10%以上，提高了原料的利用率。
【專利說明】環(huán)狀芽孢桿菌及其在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】
本發(fā)明涉及低聚半乳糖制備【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種環(huán)狀芽孢桿菌菌株，還涉及所述環(huán)狀芽孢桿菌菌株在共生發(fā)酵技術(shù)制備低聚半乳糖中的應(yīng)用。
[0002]【背景技術(shù)】
低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides,簡稱G0S),是一種具有天然屬性的功能性低聚糖，是由半乳糖基和葡萄糖基構(gòu)成的聚合度為2~8的低聚糖。本技術(shù)是以乳糖為原料，利用環(huán)狀芽孢桿菌產(chǎn)生的β -半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷鍵，生成半乳糖和葡萄糖，并通過轉(zhuǎn)半乳糖苷的作用，生成含有半乳低聚二糖到半乳低聚八糖的低聚半乳糖產(chǎn)品，并利用共生發(fā)酵技術(shù)和色譜分離技術(shù)生產(chǎn)高純度低聚半乳糖。 [0003]低聚半乳糖具有下列優(yōu)良的生理學(xué)特性:①在大腸內(nèi)能被對(duì)人體有保健作用的一類菌，包括雙歧桿菌，有選擇性地利用，每日攝取IOg低聚半乳糖后，體內(nèi)雙歧桿菌即可成為優(yōu)勢(shì)菌群它不被人體消化道酶水解，因而是一種低熱量糖；③能緩解乳糖不耐癥，促進(jìn)礦物質(zhì)吸收；④適用于糖尿病患者服用防齲齒；⑥抑制腸內(nèi)腐敗菌和其它有害菌的生長，促進(jìn)腸胃功能。低聚半乳糖產(chǎn)品廣泛應(yīng)用于嬰幼兒食品、乳制品、飲料、焙烤食品、糖果等。
[0004]目前，國內(nèi)外工業(yè)化生產(chǎn)的方法主要是通過選出高活性菌種放大培養(yǎng)，然后破碎菌體、菌體和酶分離制備液體酶制劑，或?qū)⒁后w酶制劑依托載體物質(zhì)通過干燥方式制成粉體，進(jìn)行低聚半乳糖的生產(chǎn)，相關(guān)的制備工藝存在工藝路線較長，可利用的酶存在損失，酶的綜合利用率低，能耗高。原工業(yè)化生產(chǎn)低聚半乳糖50噸轉(zhuǎn)化罐，需要配備菌體破碎機(jī)和離心機(jī)以及配套設(shè)施，每小時(shí)耗電量240度以上，能源消耗大，而且生產(chǎn)量越大，能源消耗越大。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】

為了解決以上低聚半乳糖生產(chǎn)中工藝路線較長，可利用的酶存在損失，酶的綜合利用率低，能耗高的問題，本發(fā)明提供了一種可以縮短生產(chǎn)工藝路線、減少設(shè)備投入、提高酶利用效率的環(huán)狀芽孢桿菌菌株。
[0006]本發(fā)明還提供了所述環(huán)狀芽孢桿菌菌株共生發(fā)酵技術(shù)制備低聚半乳糖。
[0007]一種環(huán)狀芽孢桿菌菌株，所述環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32 (Bacillus circulansBLB-32)已于2014年2月27日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào) CGMCC N0.8864。
[0008]本發(fā)明是通過以下措施實(shí)現(xiàn)的:一種環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用，其特征是它包括如下步驟:
(I)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)
將環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32 (CGMCC N0.8864)斜面接種在搖瓶種子培養(yǎng)基中，30 — 37°C，100-250rpm的振蕩速度下培養(yǎng)10_24h，獲得擴(kuò)大的菌種培養(yǎng)液；種子培養(yǎng)基:葡萄糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，蛋白胨5_20g/L，硫酸鎂0.3 g/L, pH7.0，種子培養(yǎng)基進(jìn)行121 °C和15分鐘的滅菌；(2)放大培養(yǎng)產(chǎn)酶
制酶培養(yǎng)基:乳糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，硫酸鎂0.3g/L，磷酸氫二鈉0.01 - 0.2g/L，磷酸二氫鈉0.01 - 0.2g/L，pH7.0，制酶培養(yǎng)基進(jìn)行121°C和15分鐘的滅菌；
將步驟(1)得到的擴(kuò)大的菌種培養(yǎng)液倒入盛有制酶培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中接種培養(yǎng)，30 -37°C，攪拌速度100-300rpm，通入空氣培養(yǎng)30_72h，得到放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32培養(yǎng)液及其釋放的β_半乳糖苷酶用于生產(chǎn)低聚半乳糖；
(3)共生發(fā)酵乳糖轉(zhuǎn)化制備低聚半乳糖
將放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32培養(yǎng)液及其釋放的半乳糖苷酶按接種量50-500ml/L移種于乳糖溶液中，乳糖溶液pH值4~7，反應(yīng)溫度30~50°C，菌種邊生長邊產(chǎn)酶發(fā)酵；或者加入活性酵母共生發(fā)酵，活性酵母加入量l-10g/L ；
在厭氧條件下轉(zhuǎn)化60~120h，經(jīng)過組分檢測(cè)低聚半乳糖達(dá)到57 %以上時(shí)放罐，然后進(jìn)行活性炭脫色處理，脫色溫度60~90°C，脫色30~90分鐘，然后經(jīng)過離子交換精制、濃縮，得到低聚半乳糖組分大于57%的低聚半乳糖濃縮液。
[0009]本方案的具體特點(diǎn)還有，乳糖溶液質(zhì)量濃度為250g~500g/L。
[0010]將低聚半乳糖濃縮液經(jīng)過真空干燥，得到含量大于57%的低聚半乳糖粉末產(chǎn)品。
[0011]低聚半乳糖組分大于57%的低聚半乳糖濃縮液通過色譜分離得到含量大于90%的低聚半乳糖液體，組分含量大于90%的低聚半乳糖液體經(jīng)過真空干燥得到含量大于90%的低聚半乳糖粉體，實(shí)現(xiàn)低聚半乳糖不同組分含量的系列化產(chǎn)品制備。
[0012]本發(fā)明的有益效果:采用本發(fā)明的環(huán)狀芽孢桿菌菌株及共生發(fā)酵轉(zhuǎn)化技術(shù)生產(chǎn)低聚半乳糖，該技術(shù)可以節(jié)省掉菌體破碎機(jī)和離心機(jī)以及配套設(shè)施投資，同時(shí)制備的酶充分利用，減少了損失，酶利用率提升10%以上，提高了原料的利用率。菌種產(chǎn)酶大于20u/ml為活力標(biāo)準(zhǔn)，低聚半乳糖產(chǎn)率測(cè)定采用AOAC法定方法2001.02食品中GOS的檢測(cè)方法測(cè)定低聚半乳糖含量，低聚半乳糖含量以57%為基準(zhǔn)(國家新資源食品2008年第20號(hào)標(biāo)準(zhǔn))
O
[0013]保藏信息:本發(fā)明所用菌株為環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32，拉丁文學(xué)名Bacilluscirculans BLB-32，該菌株已于2014年2月27日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)Jia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)CGMCC N0.8864。
[0014]本發(fā)明環(huán)狀芽孢桿菌菌株篩選方法
I)細(xì)胞菌懸液的制備
將菌體加入篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)好的菌懸液置于80°C水浴中加熱10~20分鐘，隨后將加熱處理過的菌懸液適當(dāng)稀釋接種于芽孢桿菌分離培養(yǎng)基，置于37°C培養(yǎng)10~24小時(shí)，進(jìn)一步作分離純化。準(zhǔn)備6支裝有9mL無菌水的試管，編號(hào)I一6，用移液槍移取1000 μ L懸池液置于I號(hào)試管,再移取1000 μ L I號(hào)試管懸池液置于2號(hào)試管,依次做六個(gè)試管梯度稀釋。
[0015]2)平板制作
將分離培養(yǎng)基熔化后冷至45°C左右倒平板，凝固后待用。
[0016] 3)菌種篩選用移液槍分別取4、5、6號(hào)試管溶液各200 μ L (每個(gè)試管取2— 4份)置于合適的培養(yǎng)
基平板，用涂抹棒均勻涂抹，30 - 37°C培養(yǎng)2 — 3天，培養(yǎng)至平板長出成熟菌落。
[0017]4)菌種斜面培養(yǎng)
挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基，30 - 37°C培養(yǎng)2 - 3天，獲得生長成熟的斜面菌種。
[0018]5)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)
將生長成熟的斜面菌種接種在25ml/500mL搖瓶種子培養(yǎng)基中接種，30 — 37 °C，
100-250r/min培養(yǎng)10-24小時(shí)，獲得擴(kuò)大的菌種培養(yǎng)液。
[0019]6)放大培養(yǎng)產(chǎn)酶
將菌種擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種培養(yǎng)液接種在15升發(fā)酵罐接種培養(yǎng)，30 - 37°C，培養(yǎng)2-3天，
進(jìn)行產(chǎn)酶測(cè)定，已獲得高效產(chǎn)酶菌株，根據(jù)培養(yǎng)酶活力大小選出優(yōu)良斜面出發(fā)菌株環(huán)狀芽
孢桿菌(編號(hào)為BLB-32)于生產(chǎn)低聚半乳糖。
【權(quán)利要求】
1.一種環(huán)狀芽孢桿菌 BLB-32 (Bacillus circulans BLB-32),已于 2014 年 2 月 27 日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)CGMCC N0.8864。
2.—種環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用，其特征是它包括如下步驟:(I)菌種擴(kuò)大培養(yǎng) 將環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32 (CGMCC N0.8864)斜面接種在搖瓶種子培養(yǎng)基中，30 — 37°C，100-250rpm的振蕩速度下培養(yǎng)10_24h，獲得擴(kuò)大的菌種培養(yǎng)液；種子培養(yǎng)基:葡萄糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，蛋白胨5_20g/L，硫酸鎂0.3 g/L，pH7.0，種子培養(yǎng)基進(jìn)行121 °C和15分鐘的滅菌； (2)放大培養(yǎng)產(chǎn)酶 制酶培養(yǎng)基:乳糖5-20g/L，酵母膏5-20g/L，蛋白胨5-20g/L，硫酸鎂0.3g/L，磷酸氫二鈉0.01 - 0.2g/L，磷酸二氫鈉0.01 - 0.2g/L，pH7.0，制酶培養(yǎng)基進(jìn)行121°C和15分鐘的滅菌； 將步驟(1)得到的擴(kuò)大的菌種培養(yǎng)液倒入盛有制酶培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中接種培養(yǎng)，30 -37°C，攪拌速度100-300rpm，通入空氣培養(yǎng)30_72h，得到放大培養(yǎng)的環(huán)狀芽孢桿菌BLB-32培養(yǎng)液及其釋放的β_半乳糖苷酶用于生產(chǎn)低聚半乳糖； (3)共生發(fā)酵乳糖轉(zhuǎn)化制備低聚半乳糖 將放大培養(yǎng)的環(huán)狀 芽孢桿菌BLB-32培養(yǎng)液及其釋放的半乳糖苷酶按接種量50-500ml/L移種于乳糖溶液中，乳糖溶液pH值4~7，反應(yīng)溫度30~50°C，菌種邊生長邊產(chǎn)酶發(fā)酵；或者加入活性酵母共生發(fā)酵，活性酵母加入量l-10g/L ； 在厭氧條件下轉(zhuǎn)化60~120h，經(jīng)過組分檢測(cè)低聚半乳糖達(dá)到57 %以上時(shí)放罐，然后進(jìn)行活性炭脫色處理，脫色溫度60~90°C，脫色30~90分鐘，然后經(jīng)過離子交換精制、濃縮，得到低聚半乳糖組分大于57%的低聚半乳糖濃縮液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用，其特征是乳糖溶液質(zhì)量濃度為250g~500g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用，其特征是將低聚半乳糖組分大于57%的低聚半乳糖濃縮液通過色譜分離得到低聚半乳糖組分大于90%的低聚半乳糖液體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的環(huán)狀芽孢桿菌在共生發(fā)酵技術(shù)制低聚半乳糖中的應(yīng)用，其特征是將低聚半乳糖濃縮液經(jīng)過真空干燥，得到含量大于57%的低聚半乳糖粉末產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】C12P19/04GK103911322SQ201410118268
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】劉宗利, 王乃強(qiáng), 欒慶民, 張莉, 熊小蘭, 周文福, 杜倩 申請(qǐng)人:保齡寶生物股份有限公司