一種脊髓性肌萎縮癥smn基因的敲除方法及細(xì)胞模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及脊髓性肌萎縮癥SMN基因的敲除方法及細(xì)胞模型。該模型通過(guò)如下步驟構(gòu)建：（1）構(gòu)建和設(shè)計(jì)敲除SMN基因的鋅指核酶質(zhì)粒;(2)將構(gòu)建好的SMN基因ZFN敲除質(zhì)粒用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞；（3）利用ZFN特異敲除位點(diǎn)的基因組PCR產(chǎn)物和DNA序列測(cè)定以檢測(cè)ZFN基因敲除的有效性；（4）針對(duì)ZFN基因敲除有效的細(xì)胞，進(jìn)行單克隆分離并逐一鑒定細(xì)胞敲除類型；（5）對(duì)基因敲除細(xì)胞株進(jìn)行mRNA水平鑒定；（6）對(duì)基因敲除細(xì)胞株進(jìn)行蛋白表達(dá)水平鑒定。本發(fā)明的脊髓性肌萎縮癥病理細(xì)胞模型可用于研究SMA致病機(jī)理，也可通過(guò)檢測(cè)該細(xì)胞模型中SMN復(fù)合物的蛋白表達(dá)水平對(duì)藥物進(jìn)行篩選。
【專利說(shuō)明】一種脊髓性肌萎縮癥SMN基因的敲除方法及細(xì)胞模型
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種脊髓性肌萎縮癥SMN基因的敲除方法及細(xì)胞模型。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]脊髓性肌肉萎縮癥(Spinal Muscular Atrophy, SMA)是一種常染色體隱形遺傳的神經(jīng)肌肉疾病，病理特征顯示為脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，患者肢體近端和軀干肌肉無(wú)力和萎縮，最終導(dǎo)致呼吸衰竭甚至死亡。其在活產(chǎn)嬰兒中發(fā)病率為l/600(Tl/10000，人群攜帶率為l/4(Tl/60，居致死性常染色體隱形遺傳病的第二位，僅次于囊性纖維化。該病的發(fā)生，給患者帶來(lái)巨大的的身心痛苦，同時(shí)也給家庭帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。
[0005]隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展，現(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn):運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活(SMN)基因是SMA的主要致病基因。該基因定位于5qll.2-13.3。人類染色體組中SMN基因有多個(gè)拷貝:一個(gè)SMNl (位于端粒側(cè)SMN)和多個(gè)SMN2 (著絲粒側(cè)SMN)。SMNl基因的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本fl_SMN可以編碼一種含有294個(gè)氨基酸的功能穩(wěn)定的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)(SMN蛋白)。而SMN2較SMNl對(duì)比來(lái)看編碼區(qū)存在著一個(gè)單堿基的(840C —T)的變化，這一改變導(dǎo)致細(xì)胞剪切機(jī)制的選擇性的跳躍形成的轉(zhuǎn)錄本缺失7號(hào)外顯子，形成一個(gè)截短的mRNA異構(gòu)體“ Λ 7SMN”，編碼不具有生物功能并迅速降解的“截短蛋白質(zhì)”，只有10%-20%的SMN2前mRNA發(fā)生正常剪切表達(dá)SMN(SMN-fl)蛋白，此為SMN2的補(bǔ)償作用。目前認(rèn)為，SMNl基因改變導(dǎo)致SMN蛋白水平下調(diào)是引起SMA發(fā)病的根本原因，SMN2被普遍認(rèn)為是SMA的修飾基因，其拷貝數(shù)和剪接效率則與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。約95%的患者為SMNl純合缺失或SMNl轉(zhuǎn)化為SMN2導(dǎo)致SMNl缺失。
[0006]針對(duì)SMNl基因缺失后為何導(dǎo)致脊髓前角α運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性而患SMA疾病，目前機(jī)制尚不明確。而SMA轉(zhuǎn)基因模型制作迄今技術(shù)不成熟且花費(fèi)巨大。因此，若能應(yīng)用基因敲除技術(shù)特異性敲除SMNl基因，體外構(gòu)建SMA病理細(xì)胞模型，則能為SMA病因及發(fā)病機(jī)制的深入研究及高通量篩選治療SMA藥物提供新的平臺(tái)。
[0007]鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)是近年來(lái)興起的一種基因敲除技術(shù)，其為一種人工改造的核酸內(nèi)切酶，由一個(gè)人工鋅指DNA識(shí)別域和一個(gè)非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成，鋅指結(jié)構(gòu)能特異性地結(jié)合DNA序列，每個(gè)鋅指識(shí)別三個(gè)連續(xù)的DNA堿基，非特異性核酸內(nèi)切酶行使剪切功能，兩者結(jié)合就可在DNA特定位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)斷裂。與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內(nèi)切酶來(lái)自FokI羧基端96個(gè)氨基酸殘基組成的DNA剪切域。FokI是來(lái)自海床黃桿菌的一種限制性內(nèi)切酶，只在二聚體狀態(tài)時(shí)才有酶切活性，每個(gè)FokI單體與一個(gè)鋅指蛋白組相連構(gòu)成一個(gè)ZFN，識(shí)別特定的位點(diǎn)，當(dāng)兩個(gè)識(shí)別位點(diǎn)相距恰當(dāng)?shù)木嚯x時(shí)(6^8 bp)，兩個(gè)單體ZFN相互作用產(chǎn)生酶切功能，從而達(dá)到DNA靶向切割目的。針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)8~10個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，將這些鋅結(jié)構(gòu)域連在DNA核酸酶上，便可實(shí)現(xiàn)靶序列的雙鏈斷裂(Double strand break, DSB)。當(dāng)兩個(gè)ZFN切割靶位點(diǎn)，制造出雙鏈斷裂以后，細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制被激活，包括同源重組修復(fù)和非同源末端連接(Non-homologous end-joining,NHEJ)。如果DNA修復(fù)是非同源的末端連接，將會(huì)有大約70%的概率通過(guò)隨機(jī)刪減或添加可以引起移碼突變的堿基，或無(wú)義突變引起蛋白質(zhì)長(zhǎng)度變化，從而導(dǎo)致基因敲除。到目前為止，從包括中國(guó)專利在內(nèi)的有關(guān)資料檢索表明，利用ZFNs技術(shù)敲除SMN基因，建立SMA疾病的細(xì)胞模型，尚未見到相關(guān)報(bào)道。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種用于將脊髓性肌萎縮癥SMN基因敲除的鋅指核酸酶，及其質(zhì)粒載體，以及所得到的細(xì)胞模型。本發(fā)明應(yīng)用ZFN技術(shù)敲除SMN基因，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，實(shí)現(xiàn)了建立 脊髓性肌萎縮癥(SMA)疾病的細(xì)胞模型，可以應(yīng)用在脊髓性肌萎縮癥致病機(jī)理的研究中，同時(shí)也為抗脊髓性肌萎縮癥藥物的高通量篩選提供細(xì)胞模型。
[0010]本發(fā)明提供了一種用于SMN基因敲除的表達(dá)鋅指核酸酶的質(zhì)粒載體，是指分別插入有如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示堿基序列的質(zhì)粒。
[0011]進(jìn)一步地，所述的質(zhì)粒是指pAVX。
[0012]進(jìn)一步地，所述的堿基序列的下游還連接有FokI堿基序列。
[0013]另一方面，本發(fā)明提供了上述的質(zhì)粒載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)出的鋅指核酸酶。
[0014]另一方面，本發(fā)明提供了一種用于SMN基因敲除方法，包括如下步驟:將上述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，對(duì)SMN基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序檢測(cè)SMN基因發(fā)生敲除的細(xì)胞。
[0015]所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為Hela、K562、HEK293、A549、MCF-7或者LNCap中的任一種。
[0016]所述的基因敲除方法中，是采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0017]另一方面，本發(fā)明提供了通過(guò)上述SMN基因敲除方法所制備得到的SMN基因被敲除的SMA病理細(xì)胞模型。
[0018]進(jìn)一步地，上述的細(xì)胞模型是指SMNl基因純合缺失、SMN2基因雜合缺失的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0019]有益效果
本發(fā)明建立的脊髓性肌萎縮癥(SMA)細(xì)胞模型，對(duì)于研究SMN基因在SMA疾病發(fā)病的作用機(jī)制提供了有力的工具，通過(guò)以此細(xì)胞模型為介導(dǎo)，進(jìn)而進(jìn)行相關(guān)小分子化合物和基因工程重組蛋白篩選，獲得可顯著增加SMN蛋白表達(dá)量的小分子化合物和基因工程重組蛋白質(zhì)類藥物。篩選方法簡(jiǎn)單，成本低廉，具有良好的穩(wěn)定性和可靠性。
[0020]
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1是用于表達(dá)鋅指核酸酶的質(zhì)粒載體的圖譜。
[0022]圖2是轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物電泳圖。[0023]圖3是轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物測(cè)序圖譜，測(cè)序峰圖在ZFN切割位點(diǎn)附近產(chǎn)生套峰。
[0024]圖4是實(shí)施例1中得到的Hela細(xì)胞株HS-66和HS_1_7 WB檢測(cè)結(jié)果。
[0025]圖5是實(shí)施例4中Hela、HS_66和HS_1_7細(xì)胞株的SMN復(fù)合物核內(nèi)聚點(diǎn)標(biāo)記試驗(yàn)的細(xì)胞熒光圖。
[0026]
【具體實(shí)施方式】
[0027]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例結(jié)合附圖作詳細(xì)說(shuō)明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下實(shí)施，給出了【具體實(shí)施方式】和具體操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述實(shí)施例。凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所進(jìn)行的任何本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028]主要試劑及檢測(cè)試劑盒:Hela細(xì)胞，ZFN敲除SMN基因質(zhì)粒，購(gòu)自sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑lipofectin2000購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM.胎牛血清FBS購(gòu)自Hyclone公司；總RNA提取試劑Trizol為Invitrogen產(chǎn)品；兔抗SMN(H_195)單克隆抗體為美國(guó)santa cruz公司產(chǎn)品，二抗Ant1-Rabbit IgG為美國(guó)GE公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司其他試劑菌為進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。?shí)施例中，酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等常規(guī)實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見《分子克隆(第三版)》。
[0029]實(shí)施例1 SMN基因的敲除
一、SMN基因ZFN質(zhì)粒敲除設(shè)計(jì)與構(gòu)建
根據(jù)ZFN技術(shù)原理，設(shè)計(jì)DNA靶向識(shí)別位點(diǎn)。該位點(diǎn)設(shè)計(jì)在SMN1.SMN2轉(zhuǎn)錄本共有第一外顯子處，經(jīng)過(guò)大量反復(fù)試驗(yàn)，確定的靶序列信息為:
TCCGTGCTGTTCCGGCGCggcacAGGCCAGGTGAGGTCGCA (SEQ ID N0.1)。兩端劃線部分為 ZFN結(jié)合區(qū)，中間小寫字母為ZFN切割區(qū)。其質(zhì)粒構(gòu)建由美國(guó)Sigma公司完成和鑒定。其ZFN質(zhì)粒具體信息如圖1所示。
[0030]所述人工鋅指核酸酶表達(dá)載體的具體構(gòu)建方法，表達(dá)載體骨架為pAVX(Sigma)該載體含有PUC Oir啟動(dòng)該質(zhì)粒在原核細(xì)胞中的復(fù)制，具有卡那霉素抗性基因；在多克隆位點(diǎn)上游含有一個(gè)廣譜啟動(dòng)子CMV序列，能使克隆到該多克隆位點(diǎn)基因高效表達(dá)。利用體外化學(xué)合成的方法構(gòu)建鋅指蛋白表達(dá)元件(EcoR1-Triple Flag-NLS-ZFPl-BamHI和EcoR1-Triple Flag-NLS-ZFP2_BamHI)，表達(dá)元件的整體序列分別如 SEQ ID N0.2 和 SEQID N0.3所示，合成的鋅指蛋白表達(dá)元件兩側(cè)分別含有EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)，可以利用EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)分別將鋅指蛋白表達(dá)域(ZFP1和ZFP2)克隆到載體pAVX的多克隆位點(diǎn)上；NLS是為核定位信號(hào)，可以引導(dǎo)重組ZFP進(jìn)入核區(qū)；Triple Flag用于重組蛋白表達(dá)的WB檢測(cè)中，這兩種元件中的ZFPl和ZFP2域是用于表達(dá)鋅指蛋白，分別與靶序列的左臂和右臂結(jié)合。同樣，再在體外合成BamH1-Fok1-XhaI基因，利用BamHI和XhaI酶切位點(diǎn)將FokI內(nèi)切核酸酶表達(dá)元件克隆到該載體上ZFP元件的下游位置，這樣將鋅指蛋白DNA結(jié)合域以及FokI DNA切割域相互結(jié)合，構(gòu)成了一個(gè)嵌合的限制性核酸內(nèi)切酶。以此得到兩種質(zhì)粒，分別用于表達(dá)結(jié)合在靶序列的左臂和右臂的鋅指蛋白酶，可以將靶序列敲除。
[0031]將鑒定好的ZFN敲除質(zhì)粒擴(kuò)增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，純度要求達(dá)到0D260/280=1.8~2.0以備轉(zhuǎn)染。[0032]二、SMN基因ZFN敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
(I)接種細(xì)胞。轉(zhuǎn)染前一天將Hela細(xì)胞接種至六孔板內(nèi)。細(xì)胞接種數(shù)量視其生長(zhǎng)速度而定，一般為I X IO6個(gè)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)要求細(xì)胞匯合度為80~90%。
[0033](2)將分別取實(shí)施例1中得到的ZFN左臂和右臂的質(zhì)粒載體DNA 3yg加至OPT1-MEM培養(yǎng)基使其終體積為250 μ 1，混勻，得到DNA懸液。
[0034](3)將Lipofectamine2000放置于4°C冰盒架子或者冰上，使用前低轉(zhuǎn)速離心，取10 μ I的1^口(^6(^311^1^2000加至另外24(^ I的OPT1-MEM中，輕輕混勻，此步驟操作要迅速以免脂質(zhì)體在室溫下暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng)影響后面轉(zhuǎn)染效率，而后將混合物室溫靜置5分鐘。
[0035](4)將 DNA 懸液(250 μ I )和 Lipof ectamine2000 (250 μ I)懸液混合，總體積500 μ I,輕輕混勻，室溫靜置20分鐘。
[0036](5)將DNA和Lipofectamine2000混合液加至六孔板的孔內(nèi)，前后左右晃動(dòng)孔板混
勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。[0037](6)轉(zhuǎn)染4~6小時(shí)后細(xì)胞換液，換成含抗生素正常培養(yǎng)基，六孔板容量每孔2ml
培養(yǎng)基。
[0038](7)轉(zhuǎn)染細(xì)胞48~72h后，收集5/6的細(xì)胞，用于基因敲除驗(yàn)證的基因組提取。剩余部分直接分散為細(xì)胞懸液，分入96孔板中分離單克隆。
[0039]三、ZFN敲除SMN基因有效性的檢測(cè)
針對(duì)ZFN特異敲除位點(diǎn)上下游設(shè)計(jì)引物，其序列為:
SMN Knockout-F:5’ -GGGCGATAACCACTCGTAGA-3’ (SEQ ID N0.4)
SMN Knockout-R:5’ -AAGACGTAGAAAAACGCGGA-3’ (SEQ ID N0.5)
收集轉(zhuǎn)染48~72小時(shí)的Hela細(xì)胞:提取全基因組，步驟如下:
(I)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5ml EP管中，加入20 μL蛋白酶K和220 μ I裂解液QS。65°C溫浴10-15min。溶液應(yīng)呈黑色。簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。
[0040](2)加入220 μ I無(wú)水乙醇，上下來(lái)回顛倒混勻。此時(shí)可能出現(xiàn)絮狀沉淀，將溶液及絮狀沉全部淀轉(zhuǎn)移到純化柱中。12,000 rpm離心Imin,棄濾液。
[0041](3)加入500 μ I去蛋白液PS。12, 000 rpm離心lmin，棄濾液。
[0042](4)加入500 4 1漂洗液卩已。12, 000 rpm離心lmin，棄濾液。
[0043](5)加入500 4 1漂洗液卩已。12, 000 rpm離心lmin,棄濾液。
[0044](6) 12，000 rpm離心3min，以徹底去除純化柱中殘留的液體。
[0045](7)將純化柱置于新的1.5 ml離心管中。向純化柱中央處，懸空滴加30~100μ I純化液TE。室溫放置2min。
[0046](8) 12,000 rpm離心2min，管底即為細(xì)胞基因組DNA。-20°C保存。
[0047]提取到的轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組，使用SMN Knockout-F和SMN Knockout-R引物進(jìn)行PCR，其擴(kuò)增條件為:
94°C 5min ；
94°C 45s,54°C 30s, 72°C 45s，(30 ~35 個(gè)循環(huán))；
72 °C 5min。
[0048]1%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，PCR擴(kuò)增ZFN作用靶位點(diǎn)片段長(zhǎng)度為367 bp，如附圖2所示，經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段連接T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.col1.DH5 α 12 h后測(cè)定靶DNA序列以統(tǒng)計(jì)PCR產(chǎn)物片段中的突變比例和突變類型。如附圖3所示，片段測(cè)序出現(xiàn)套峰，認(rèn)為ZFN在此過(guò)程中對(duì)靶基因產(chǎn)生切割作用，說(shuō)明在靶向敲出區(qū)域存在著敲出后的移碼突變修復(fù)。
[0049]再通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行單克隆分離。
[0050]四、鑒定單克隆SMN基因敲除的突變類型
培養(yǎng)于96孔板中的細(xì)胞克隆長(zhǎng)至80~90%匯合度時(shí)，消化、收集細(xì)胞后一部分凍存，提取其余細(xì)胞的基因組DNA，共選用17個(gè)細(xì)胞株，通過(guò)PCR擴(kuò)增ZFNs作用靶位點(diǎn)上下游367bp，判斷單克隆在基因組水平上經(jīng)ZFN作用后的改變，并進(jìn)行T-A克隆后通過(guò)DNA測(cè)序鑒定敲除區(qū)域是否有細(xì)胞修復(fù)機(jī)制對(duì)DSB雙鏈斷裂產(chǎn)生的插入和缺失。
[0051]本實(shí)施例中，在采用的17株單克隆細(xì)胞中，經(jīng)單克隆PCR片段的測(cè)序檢測(cè)，證實(shí)有5株存在SMN基因突變的細(xì)胞。
[0052]實(shí)施例2 SMN基因敲除細(xì)胞株mRNA表達(dá)鑒定
對(duì)于鑒定SMN敲除有效的細(xì)胞，提取RNA，方法參見Trizol試劑盒說(shuō)明書，總RNA提取后，用無(wú)RNAase活性的DNase消化以去除痕量基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量，電泳檢測(cè)確定RNA質(zhì)量；cDNA的合成按照Tiangen公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。針對(duì)SMNl、SMN2第七個(gè)外顯子中的(C — T)不同設(shè)計(jì)引物，以SMN1、SMN2不相同的轉(zhuǎn)錄本為模板進(jìn)行RT-PCR根據(jù)半定量的情況初步確定SMNl、SMN2缺失情況。
[0053]然而我們發(fā)現(xiàn)外顯子上的堿基缺失和堿基的插入并沒(méi)有影響SMNl、SMN2所轉(zhuǎn)錄的RNA的穩(wěn)定性。通過(guò)這一結(jié)論我們又在SMNl和SMN2都具有的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本transcriptvariant d、transcript variant b進(jìn)行設(shè)計(jì)引物,其序列為
SMN cDNAbd-F:5’ -GAAGTTACTACAAGCGGTCCTC-3’ (SEQ ID N0.6)
SMN cDNAbd-R:5’ -GCTCTATGCCAGCATTTCTCCT-3’ (SEQ ID N0.7)
RT-PCR后進(jìn)行T-A克隆，測(cè)序后利用第七個(gè)外顯子(C — T)的點(diǎn)突變以區(qū)別SMNl、SMN2突變情況。根據(jù)這種方式我們得到了兩株SMNl-/- SMN2+/-基因型的HeLa細(xì)胞株。稱之為HS-66和HS-1-7。
[0054]例如:HS_66細(xì)胞的突變情況如下:
野生型的SMNl位點(diǎn)的部分序列是:
AGCGGCGGCAGTGGTGGCGGCGTCCCGGAGCAG{GAGGA TTCCGTGCTGTTCCGGCGCGGCACAGGCCA JGAGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAGC
在HS-66細(xì)胞的SMNl的位點(diǎn)上缺少上述括號(hào)[]中的序列段，共35個(gè)bp，同時(shí)在缺失的位置處插入了 103個(gè)bp的插入段。
[0055]AGCGGCGGCAGTGGTGGCGGCGTCCCGGAGCAG::::::::::(-35)::::::::::::GAGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAG ；
插入段是:
ACAACTCCAGTGAGCGGATCGACTTGATGCTGTCCCGAGGCTGCGGAAGGAGAGTTGGGCCGGAAGAAGGGTG
CTGAGAGCGCTAATAGGGAGACTGCACTGG
在HS-66細(xì)胞的SMNl的另一個(gè)等位基因上，存在有4個(gè)bp的缺失，序列是: GGATTCCGTGCTGTTCCGGCGCG::(-4)::AGGCCAGAGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAGCA 野生型的SMN2位點(diǎn)的部分序列是:AGCGGCGGCAGTGGTGGCGGCGTCCCGGAGCAG[GAGGA TTCCGTGCTGTTCCGGCGCGGCACAGGCCA JGkGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAGC
在HS-66細(xì)胞的SMN2的位點(diǎn)上缺少上述括號(hào)[]中的序列段，共35個(gè)bp，同時(shí)在缺失的位置處插入了 103個(gè)bp的插入段。
[0056]AGCGGCGGCAGTGGTGGCGGCGTCCCGGAGCAG:::::::::(-35):::::::::GAGCGATGATTCTGACATTTGGGATGATACAG
插入段是:
ACAACTCCAGTGAGCGGATCGACTTGATGCTGTCCCGAGGCTGCGGAAGGAGAGTTGGGCCGGAAGAAGGGTG
CTGAGAGCGCTAATAGGGAGACTGCACTGG
在SMN2的另一個(gè)等位基因上，未發(fā)現(xiàn)有突變的情況發(fā)生。
[0057]實(shí)施例3 Western blot檢測(cè)SMN蛋白表達(dá)
對(duì)于得到的兩株SMNl-/- SMN2+/-基因型Hela細(xì)胞株HS-66和HS-1-7待其在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中長(zhǎng)至80~90%時(shí)，胰酶消化，裂解細(xì)胞，提取蛋白，用酶標(biāo)儀測(cè)定蛋白濃度，取45ug上樣SDS-PAGE電泳，用10%分離膠，5%濃縮膠，PVDF膜濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜時(shí)間lh，兔抗SMNAntibody單抗孵育l h,Goat-Anti_rabbit 二抗孵育lh, ECL突光檢測(cè),顯影定影并拍照。如附圖4所示，跟正常HeLa細(xì)胞比較其SMN基因敲除細(xì)胞表達(dá)SMN蛋白的量明顯降低。
[0058]實(shí)施例4細(xì)胞中SMN復(fù)合物核內(nèi)聚點(diǎn)檢測(cè)
采用實(shí)施例2中得到的HS-66和HS-1-7細(xì)胞株，以Gemin3為SMN蛋白復(fù)合物細(xì)胞核內(nèi)聚點(diǎn)標(biāo)記物，如圖5所示，第I列為DAPI細(xì)胞核染色，第2列g(shù)emin3染色，第3列為疊圖，即雙染染色全圖?？梢钥闯?，在第一排的Hela細(xì)胞中，SMN復(fù)合物聚點(diǎn)數(shù)正常，而在敲除細(xì)胞株HS66和HS-1-7中，核內(nèi)聚點(diǎn)數(shù)大大下降甚至消失不見，與病理特征相同。
【權(quán)利要求】
1.一種脊髓性肌萎縮癥的細(xì)胞模型，其特征在于:是指SMNl基因純合缺失、SMN2基因雜合缺失的哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
2.一種用于SMN基因敲除的表達(dá)鋅指核酸酶的質(zhì)粒載體，其特征在于:是指分別插入有如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示堿基序列的質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于SMN基因敲除的表達(dá)鋅指核酸酶的質(zhì)粒載體，其特征在于:所述的質(zhì)粒是指pAVX。
4.權(quán)利要求2或3所述的質(zhì)粒載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)出的鋅指核酸酶。
5.一種基于權(quán)利要求2或3所述的質(zhì)粒載體的SMN基因敲除方法，其特征在于，包括如下步驟:將上述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，對(duì)SMN基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序檢測(cè)SMN基因發(fā)生敲除的細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒載體的SMN基因敲除方法，其特征在于:所述的哺乳動(dòng)物細(xì)胞為 Hela、K562、HEK293、A549、MCF-7 或者 LNCap 中的任一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒載體的SMN基因敲除方法，其特征在于:是采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的質(zhì)粒載體的SMN基因敲除方法，其特征在于:PCR擴(kuò)增中使用的引物序列如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示。
9.權(quán)利要求5所述的SMN基因敲除方法所獲得的SMN基因被敲除的SMA病理細(xì)胞模型。
【文檔編號(hào)】C12N5/10GK103911346SQ201410120625
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】陳實(shí), 姜東旭, 黎寒 申請(qǐng)人:江蘇雄鳴醫(yī)藥科技有限公司