一種無乳鏈球菌的口服疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列，以及包含該核苷酸序列的重組載體、重組菌。本發(fā)明還公開了無乳鏈球菌口服疫苗。本發(fā)明乳鏈球菌口服疫苗，以口服方式接種免疫，對(duì)羅非魚的保護(hù)率高，給藥方便，操作簡單，免疫應(yīng)激反應(yīng)小，安全，應(yīng)用前景優(yōu)良。
【專利說明】一種無乳鏈球菌的口服疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種無乳鏈球菌的口服疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)也稱 B 組鏈球菌(group Bstreptococci, GBS),屬于鏈球菌科(Streptococcaceae),鏈球菌屬(Streptococcus),是一種兼性的革蘭氏陽性球菌，按其莢膜多糖抗原性的不同，可分為10種血清型(la、lb、
II~VIII型)，其是引起羅非魚鏈球病菌的主要致病菌。
[0003]近年來在廣東、海南、福建等羅非魚主產(chǎn)區(qū)大規(guī)模的爆發(fā)羅非魚鏈球菌病，波及范圍廣，病害控制難，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)病魚表現(xiàn)為精神、食欲很差，體色發(fā)黑，離群打轉(zhuǎn)游動(dòng)，部分病魚出現(xiàn)晶狀體混濁，眼球突出甚至脫落的現(xiàn)象；疾病的發(fā)病率接近40%，死亡量與氣溫呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性，氣溫在35°C以上時(shí)發(fā)病魚的死亡率可高達(dá)100%，養(yǎng)殖戶的損失慘重，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2009年該病對(duì)華南地區(qū)羅非魚養(yǎng)殖造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)7億人民幣。據(jù)調(diào)查，羅非魚病害往年已有發(fā)生，然而往年都能以氟苯尼考等藥物很快控制，但近年來的病害來勢兇猛，因耐藥性等原因，藥物控制效果差，養(yǎng)殖戶損失慘重?！傲_非魚”作為海南人工養(yǎng)殖首要魚種，若不能有效地預(yù)防和控制疾病的發(fā)生及蔓延，海南將面臨“無魚可養(yǎng)”的局面。因此，安全有效的治療方式對(duì)于拯救海南羅非魚養(yǎng)殖業(yè)顯得迫在眉睫，疫苗免疫不會(huì)產(chǎn)生耐藥性，是一種安全、有效、環(huán)保的方法。
[0004]目前，常見的無乳鏈球菌疫苗有滅活疫苗、減毒疫苗、亞單位疫苗、DNA疫苗等，其中，全菌疫苗、減毒疫苗和亞單位疫苗多用腹腔注射，DNA疫苗以肌肉注射方式接種為主。一般來說，腹腔或肌肉注射易于控制劑量，免疫應(yīng)答效果較好，但是魚體的應(yīng)激反應(yīng)大，傷口易發(fā)生二次感染?？诜庖叩牟僮骱唵?，魚體的應(yīng)激反應(yīng)小，但是，將現(xiàn)有的無乳鏈球菌疫苗以口服方式免疫，免疫效果非常弱，難以起到保護(hù)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種無乳鏈球菌口服疫苗，其由包含SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列的減毒沙門氏菌制備而成。
[0006]本發(fā)明首先提供了 SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0007]本發(fā)明還提供了一種重組載體，它包含SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0008]優(yōu)選地,所述重組載體為重組pVAXl載體。
[0009]本發(fā)明還提供了一種重組菌，它包含前述的重組載體。
[0010]優(yōu)選 地，所述重組菌為重組減毒沙門氏菌。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述重組減毒沙門氏菌為重組減毒沙門氏菌SL7207。
[0011]本發(fā)明還提供了前述序列、重組載體或重組菌在制備無乳鏈球菌口服疫苗中的用途。
[0012]本發(fā)明無乳鏈球菌口服疫苗，它是由前述序列、重組載體或重組菌和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成。
[0013]本發(fā)明還提供了前述口服疫苗在制備預(yù)防無乳鏈球菌病的藥物中的用途。優(yōu)選地，所述的無乳鏈球菌病為羅非魚無乳鏈球菌病。
[0014]本發(fā)明制備得到了一種可以口服接種的無乳鏈球菌疫苗，將其用拌料的方式免疫接種羅非魚，獲得的最高抗體效價(jià)為1:16，最高相對(duì)保護(hù)率可達(dá)63%，可以有效保護(hù)羅非魚免受無乳鏈球菌感染，給藥方便，操作簡單，免疫應(yīng)激反應(yīng)小，安全，應(yīng)用前景優(yōu)良。
[0015]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0016]以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
[0017]說明書附圖
[0018]圖1無乳鏈球菌的sip基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。M:DNA Maker (2000)，1:sip基因擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0019]圖 2pVAXl-sip 酶切和 PCR 鑒定。M:DNA Maker (10000) , I:DH5 a (pVAXl-sip)菌落 PCR 鑒定,2:pVAXl_sip/BamH I +Hind III，3pVAXl_sip/BamH I。
[0020]圖 3 重組菌 16S rDNA 鑒定。M:DNA Maker (2000) , I:SL7207 (pVAXl),2:SL7207(pVAXl-sip)。
[0021]圖 4SL7207 (pVAXl)酶切鑒定。M1:DNA Maker (2000) , M2:DNA Maker (10000)，I:SL7207(pVAXl)/BamH I , 2: SL7207 (pVAXl)/BamH I +Hind III。
[0022]圖 5SL7207 (pVAXl-sip)酶切和 PCR 鑒定。Ml:DNA Maker (2000), M2:DNA Maker(10000)，1:SL7207 (pVAXl-sip)/BamH I，2: SL7207 (pVAXl-sip)/BamH I +Hind III，3:SL7207(pVAXl-sip)菌落 PCR 鑒定。
[0023]圖6重組菌生長曲線。
[0024]圖7重組菌SL7027 (pVAXl-sip) 口服免疫羅非魚后組織細(xì)菌計(jì)數(shù)。
[0025]圖8免疫后第7天，羅非魚肝臟、脾臟、腸道分離菌株的特異性PCR鑒定。M1 =DNAMaker (2000)，1:肝樣，2:脾樣，3:腸道樣，4:sip陽性對(duì)照。
[0026]圖9免疫后7天羅非魚肝臟、脾臟、腸道分離菌抽提質(zhì)粒pVAXl-sip的酶切鑒定。M1:DNA Maker (2000), M2:DNA Maker (10000)，1、2:肝樣;3、4:脾樣;5、6:腸樣；7:sip 陽性對(duì)照。
[0027]圖10檢測流程圖
[0028]圖11ELISA檢測經(jīng)三次灌胃免疫接種的羅非魚血清特異性抗體每個(gè)柱形代表在血清稀釋度為1:16時(shí)，0D450下的吸光度。各試驗(yàn)組的抗體應(yīng)答水平與PBS組對(duì)比，并進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SE (N=3)，#P〈0.01。
[0029]圖12ELISA檢測經(jīng)三個(gè)免疫療程拌料免疫接種的羅非魚血清特異性抗體每個(gè)柱形代表在血清稀釋度為1:16時(shí)，0D450下的吸光度。各試驗(yàn)組的抗體應(yīng)答水平與PBS組對(duì)比，并進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，SE (N=3)，**P〈0.01，*Ρ〈0.05。
[0030]圖13灌胃接`種后羅非魚獲得的保護(hù)率。羅非魚只進(jìn)行了一次免疫。
[0031]圖14灌胃接種后羅非魚獲得的保護(hù)率。羅非魚進(jìn)行了兩次免疫。[0032]圖15灌胃接種后羅非魚獲得的保護(hù)率。羅非魚進(jìn)行了三次免疫。
[0033]圖16拌料接種后羅非魚獲得的保護(hù)率。羅非魚只進(jìn)行了一個(gè)流程免疫。
[0034]圖17拌料接種后羅非魚獲得的保護(hù)率。羅非魚進(jìn)行了兩個(gè)流程免疫。
[0035]圖18拌料接種后羅非魚獲得的保護(hù)率。羅非魚進(jìn)行了三個(gè)流程免疫。
【具體實(shí)施方式】:
[0036]實(shí)施例1本發(fā)明口服疫苗的構(gòu)建
[0037]—、目標(biāo)基因片段的克隆
[0038]1.1 方法
[0039]將無乳鏈球菌用BHI肉湯培養(yǎng)至指數(shù)期，離心收集菌體用細(xì)菌DNA提取試劑盒收集提取無乳鏈球菌細(xì)菌DNA，PCR擴(kuò)增分別獲得大量sip基因。
[0040]Sip基因上下游引物為
[0041]sip 上游引物:5’ - GGATCC ACCATGG CTGCCACTTCAATGAAA-3’(下劃線為添加的BamH I酶切位點(diǎn)，粗體為Kozak序列)
[0042]sip 下游引物:5’ -AAGCTTTTATTTGTTAAATGATACGTG-3，(下劃線為添加的 Hind III酶切位點(diǎn))
[0043]PCR 反應(yīng)體系:上下游引物各 1μ I ；Mixl2.5μ I ;DNA 模板 I μ I ；ddH209.5 μ L.反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性5min，94°C 50s, 55 °C 30s, 72 °C lmin，共30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0取5μ I反應(yīng)產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測擴(kuò)增結(jié)果。收集PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，膠回收，獲得純化基因片段。
[0044]將純化的目的基因與PMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入DH5 α。通過Amp平板篩選，PCR和單雙酶切鑒定后，篩選獲得pMD19-T-Sip重組轉(zhuǎn)化細(xì)菌。
[0045]1.2 結(jié)果
[0046]提取的無乳鏈球菌GBS基因組，根據(jù)所設(shè)計(jì)的PCR引物，經(jīng)高保真DNA聚合酶擴(kuò)增，得一條大小約為1000bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)，經(jīng)過測序，得其核苷酸序列如下:
【權(quán)利要求】
1.SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.一種重組載體，其特征在于:它包含SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于:所述重組載體為重組pVAXl載體。
4.一種重組菌，其特征在于:它包含權(quán)利要求2或3所述的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組菌，其特征在于:所述重組菌為重組減毒沙門氏菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組菌，其特征在于:所述重組減毒沙門氏菌為重組減毒沙門氏菌SL7207。
7.權(quán)利要求4~6所述重組菌在制備無乳鏈球菌口服疫苗中的用途。
8.一種無乳鏈球菌口服疫苗，其特征在于:它是由權(quán)利要求4~6任意一項(xiàng)所述重組菌和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成。
9.權(quán)利要求8所述的口服疫苗在制備預(yù)防無乳鏈球菌病的藥物中的用途。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于:所述的無乳鏈球菌病為羅非魚無乳鏈球菌病。
【文檔編號(hào)】C12N15/31GK103834669SQ201410121138
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】劉天強(qiáng), 肖丹, 汪開毓, 黃凌遠(yuǎn), 黃冠軍, 陽濤 申請(qǐng)人:通威股份有限公司