一種食管癌診斷標(biāo)志物及其使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種長鏈非編碼RNA及其應(yīng)用，根據(jù)該長鏈非編碼RNA序列，設(shè)計(jì)并合成特異性實(shí)時(shí)定量PCR引物和探針，制備用于食管癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑。利用實(shí)時(shí)定量PCR制劑，在食管癌臨床病例標(biāo)本中檢測(cè)該長鏈非編碼RNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)該長鏈非編碼RNA在食管癌中表達(dá)顯著下調(diào)，本發(fā)明有望制備用于食管癌輔助診斷、療效預(yù)測(cè)或者預(yù)后判斷的制劑。
【專利說明】一種食管癌診斷標(biāo)志物及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于腫瘤分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種長鏈非編碼RNA及其應(yīng)用，具體而言，本發(fā)明涉及一種長鏈非編碼RNA在制備食管癌輔助診斷或者預(yù)后制劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]食管癌(Esophageal Carcinoma, EC)是嚴(yán)重危害全人類健康的惡性疾病，全球范圍內(nèi)其發(fā)病率和死亡率分別居第八位和第六位。EC主要有兩種病理類型:食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal Squamous Cell Carcinoma, ESCC)和食管腺癌(EsophagealAdenocarcinoma, EA C),我國病理類型以鱗癌為主(占90%以上)。據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的最新資料顯示，我國每年新發(fā)ESCC患者超過25萬人，因食管癌死亡的患者約20萬人，發(fā)病率居全國各類惡性腫瘤第5位，死亡率居第4位，均遠(yuǎn)超世界平均水平。盡管，目前臨床上用于食管癌檢查和治療的技術(shù)手段在不斷改進(jìn)，但患者總體5年生存率仍然極低。近半個(gè)世紀(jì)以來，國內(nèi)外關(guān)于EC發(fā)病機(jī)制的研究已在mRNA、蛋白質(zhì)以及miRNA領(lǐng)域取得了一系列成果，但其確切的發(fā)病機(jī)制目前仍在積極的研究探索之中。(Jemal A, et al.Globalcancer statistics.CA:a cancer journal for clinicians2011，61:69-90 ；EnzingerPC，et al.Esophageal cancer.N Engl J Med2003，349:2241-2252 ;陳萬青.2004-2005 年中國惡性腫瘤發(fā)病與死亡的估計(jì).中華腫瘤雜志2009，31:664-668 ;赫捷，等.中國食管癌流行病學(xué)現(xiàn)狀、診療現(xiàn)狀及未來對(duì)策.中國癌癥雜志，2011，(7) =501-504.)
[0003]人類基因組測(cè)序計(jì)劃完成以后，證實(shí)長期備受關(guān)注的蛋白編碼基因僅約占整個(gè)轉(zhuǎn)錄組的2%，超過98%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為ncRNA(noncoding RNA, ncRNA)。隨著RNA組學(xué)研究的進(jìn)展，起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄“噪音”的ncRNA，被逐步證實(shí)其在包括人類在內(nèi)的多物種，甚至是植物的生理及病理活動(dòng)中，均具有鮮為人知的廣泛而多樣化的功能。目前證實(shí)具有調(diào)控作用的ncRNAs主要分為長度> 200nt的LncRNAs以及< 200nt的microRNAs，雖然miciORNAs是目前為止研究相對(duì)比較深入的一類小ncRNAs，但隨后人們發(fā)現(xiàn)在各個(gè)物種中，LncRNAs不僅數(shù)量大、種類多，而且在基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育、遺傳和表觀遺傳等生命活動(dòng)中的調(diào)控作用較microRNAs更為廣泛、精細(xì)和復(fù)雜(BirneyE，et al.1dentification and analysis of functional elements ini % of thehuman genome by the ENCODE pilot project.Nature2007,447:799-816 ；Wilusz JE,et al.Long noncoding RNAs !Functional surprises from the RNA world.Genes andDevelopment2009，23:1494-1504 ;Prasanth KV, et al.Eukaryotic regulatory RNAs:An answer to the ! genome complexity' conundrum.Genes and Development2007,21:11-42 ；Tsai MC, et al.Long intergenic noncoding RNAs:new links in cancerprogression.Cancer Res2011，71:3_7 ;Pauli A,et al.Non-coding RNAs as regulatorsof embryogenesis.Nature Reviews Genetics2011，12:136-149 ;Van LeeuwenS，etal.Long non-coding RNAs:Guardians of development.Differentiation2010,80:175-183 ;0romUA，et al.Long Noncoding RNAs with Enhancer-like Function in HumanCells.Cell2010,143:46-58 ；Caley DP, et al.Long noncoding RNAs, chromatin，anddevelopment.The Scientific World Journal 2010，10:90-102.)。
[0004]長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，I ncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，近年研究發(fā)現(xiàn)它是一類具有重要生物學(xué)功能的RNA，參與基因組印記、染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，在細(xì)胞分化和發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動(dòng)中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。近年來，越來越多的權(quán)威研究證實(shí)IncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著抑制或促進(jìn)腫瘤的作用，在調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移能力等方面，均具有十分重要作用。目前已有較多LncRNAs被證實(shí)在包括乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、肝癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌等在內(nèi)的人類多種腫瘤中存在差異表達(dá)并執(zhí)行重要的調(diào)控功能(Gupta RA, et al.Long non-codingRNA HOTAIR reprograms chromatin state to promote cancer metastasis.Nature2010,464:1071-1076 ；Cui Z,et al.The prostate cancer-up-regulated long noncoding RNAPlncRNA-1modulates apoptosis and proliferation through reciprocal regulation ofandrogen receptor.Urologic Oncology:Seminars and Original Investigations2013,31:1117-1123 ；Khaitan D，et al.The melanoma—upregulated long noncoding RNASPRY4-1T1 modulates apoptosis and invasion.Cancer Research2011，71:3852-3862 ;Du Y，et al.Elevation of Highly Up-regulated in Liver Cancer (HULC)by HepatitisB Virus X Protein Promotes Hepatoma Cell Proliferation via Down-reguIatingpl8.J Biol Chem 2012,287:26302-26311 ；Ling H，et al.CCAT2,a novel noncoding RNAmapping to 8q24， underlies metastatic progression and chromosomal instabilityin colon cancer.Genome Research 2013，23:1446-1461 ;Liu Z，et al.Downregulationof GAS5Promotes Bladder Cancer Cell Proliferation， Partly by Regulating CDK6.PLoS ONE 2013,8:9Article Number e73991.)。為探索LncRNA在ESCC 中是否具有功能，發(fā)明人在人ESCC組織及細(xì)胞系中，用目前已經(jīng)證實(shí)在其它腫瘤中具有相關(guān)功能的LncRNA進(jìn)行探索性研究，證實(shí)在乳 腺癌組織中發(fā)現(xiàn)的LncRNA HOTAIR不僅在ESCC癌與配對(duì)正常組織中差異表達(dá)，而且在ESCC細(xì)胞株中可明顯抑制腫瘤細(xì)胞凋亡并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移(Chen FJ, etal.Upregulation of the long non-coding rna hotair promotes esophageal squamouscell carcinoma metastasis and poor prognosis.Molecular Carcinogenesis2013，52:908-915.)。此外，發(fā)明人也證實(shí)在前列腺中發(fā)現(xiàn)的PlncRNA-1在ESCC組織中均顯著上調(diào)并可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖能力(Wang CM，et al.Upregulation of the Long Non-codingRNA PlncRNA-1 Promotes Esophageal Squamous Carcinoma Cell Proliferationand Correlates with Advanced Clinical Stage，Dig Dis Sci 201 3.doi:10.1007/sl0620-013-2956-7.)。
[0005]然而，追蹤文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)除發(fā)明人所在課題組外，關(guān)于食管鱗狀細(xì)胞癌的IncRNA表達(dá)譜及其相關(guān)指標(biāo)的功能性的研究目前還較少。為系統(tǒng)探索ESCC的IncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與ESCC發(fā)生發(fā)展特異性相關(guān)的一組IncRNAs，發(fā)明人釆用芯片技術(shù)篩選到一條在人ESCC癌組織中顯著低表達(dá)的IncRNA，該基因被命名為CTB-174D11.1 (Ensemble database)，其轉(zhuǎn)錄區(qū)域位于5號(hào)染色體正義鏈168，440，266-168，453，396bp對(duì)之間，基因全長為1489bp。發(fā)明人研究證實(shí):與配對(duì)正常組織相比，該IncRNA在人ESCC癌組織中顯著低表達(dá)，并在后期的大樣本組織 qRT-PCR (Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction,實(shí)時(shí)定量PCR)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)該指標(biāo)在人ESCC癌組織中的表達(dá)，顯著低于配對(duì)正常組織。為便于后期研究及論述，發(fā)明人將其命名為 HDESCC_lncRNA6 (highly down-regulated in esophagealsquamous cell carcinoma, long noncoding RNA 6)。本發(fā)明人重點(diǎn)關(guān)注了 ESCC 的 IncRNA表達(dá)譜，這一類新型的基因調(diào)控因子將有望進(jìn)一步豐富和完善包括食管鱗癌在內(nèi)的腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究，也為發(fā)現(xiàn)腫瘤診斷及預(yù)后判斷的標(biāo)志物、新的腫瘤治療靶點(diǎn)帶來希望。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為系統(tǒng)研究人食管鱗狀細(xì)胞癌的IncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與人食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)的新的IncRNAs，由發(fā)明人提供的6對(duì)食管癌和配對(duì)正常組織標(biāo)本，通過Qiagen公司的RNA提取試劑盒(RNeasy Micro KU，貨號(hào)74004)提取RNA后，采用北京博奧生物有限公司的晶芯IncRNA芯片V2(4X180K)檢測(cè)篩選出一條在食管癌組織中顯著低表達(dá)的IncRNA，命名為HDESCC-lncRNA6，其基因序列如序列表SEQ ID N0.1所示。后期經(jīng)過共110對(duì)人ESCC癌與配對(duì)正常組織樣本qRT-PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在77對(duì)樣本中該IncRNA表達(dá)在癌組織中顯著下調(diào)。該IncRNA有望成為腫瘤診斷和預(yù)后判斷的標(biāo)志物，同時(shí)也為腫瘤的治療提供了新的靶點(diǎn)。
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)的IncRNA序列及其應(yīng)用方法。
[0008]本發(fā)明系統(tǒng)的研究食管鱗狀細(xì)胞癌的IncRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)的新的IncRNA。
[0009]本發(fā)明的目的 是提供一種檢測(cè)在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中低表達(dá)的HDESCC-lncRNA6 序列。
[0010]本發(fā)明提供了所述HDESCC-1ncRNAe序列的檢測(cè)應(yīng)用方法，根據(jù)該序列制備用于食管癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的制劑。
[0011]本發(fā)明根據(jù)所述HDESCC-lncRNA6序列設(shè)計(jì)了 3對(duì)引物用于檢測(cè)HDESCC_lncRNA6序列。
[0012]Pairl 上游引物:SEQ ID N0.2
[0013]Pairl 下游引物:SEQ ID N0.3
[0014]Pair2 上游引物:SEQ ID N0.4
[0015]Pair2 下游引物:SEQ ID N0.5
[0016]Pair3 上游引物:SEQ ID N0.6
[0017]Pair3 下游引物:SEQ ID N0.7
[0018]本發(fā)明根據(jù)所述HDESCC_lncRNA6序列設(shè)計(jì)并合成出用于實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)引物組。所述引物組適用于SYBR Green、TaqMan探針、分子信標(biāo)、雙雜交探針、復(fù)合探針等的檢測(cè)。
[0019]優(yōu)選的用于染料類實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的引物組分別為:
[0020]Pair2 上游引物:SEQ ID N0.4
[0021]Pair2 下游引物:SEQ ID N0.5
[0022]本發(fā)明中，qRT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、熒光定量PCR是同一概念，可以相互替換使用。[0023]本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)HDESCC_lncRNA6表達(dá)水平的熒光定量PCR試劑盒及使用方法，該熒光定量PCR試劑盒適合于目前存在市場(chǎng)上的所有類型熒光定量基因擴(kuò)增儀，靈敏度高，定量快速準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好，具有良好的應(yīng)用前景。
[0024]本發(fā)明制備了一種檢測(cè)IncRNA表達(dá)水平的染料類實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，組分如下:特異性引物、標(biāo)準(zhǔn)DNA模板、突光染料、實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)液。其中所述的特異性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ ID N0.4，下游引物序列為SEQ ID N0.5。所述熒光定量PCR反應(yīng)液包括dNTP、Mg2+、Taq酶及buffer緩沖液。所述熒光染料優(yōu)選SYBRGreen II, Taq酶優(yōu)選熱啟動(dòng)酶。
[0025]本發(fā)明還公開了一種檢測(cè)食管鱗癌的染料類熒光定量PCR試劑盒的使用方法，熒光定量PCR體系:
[0026]上游引物(10μπιο1/1)2μL ;下游引物(10 μ mol/L) 2 μ L ;樣品 cDNA4 μ L (或標(biāo)準(zhǔn) DNA 模板 DNA2 μ L) ；50XROX Reference Dyel μ L ;2X SYBR Premex Ex Taq II(TIiRNaseH Plus) 25 μ L，加離子水至50 μ L。熒光定量PCR程序:95°C 30s預(yù)變性，接40個(gè)循環(huán):95V 5s,60°C 30-34s。
[0027]本發(fā)明還公開了一種長鏈非編碼RNA的檢測(cè)方法，包括樣品總RNA的提取、樣品cDNA 的制備、HDESCC-lncRNA6 的擴(kuò)增。
[0028]以上所述的樣品總RNA的提取、樣品cDNA的制備、HDESCC_lncRNA6擴(kuò)增的具體步驟包括:
[0029]I)樣品總RNA的提取 :按照Life Technologies公司的TRIZOL?試劑(貨號(hào)15596026)所需試劑及步驟提取食管鱗狀細(xì)胞癌組織或腫瘤的Total RNA ;再用NanoDropND-1000 核酸定量儀定量(NanoDrop Technologies,Wilmington,Delaware)定量所提取的RNA的純度和濃度，甲醛變性膠電泳質(zhì)檢確保提取的RNA的完整性。
[0030]2)樣品 eDNA 的制備:米用 TaKaRa 試劑盒 PrimeScript? RT reagent Kit withgDNA Eraser (Perfect Real Time)(貨號(hào) RR047A)對(duì)提取的總 RNA 反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA ;該試劑盒內(nèi)含RNase-Free DNase，可有效去除混雜的基因組DNA。
[0031]第一步去除基因組DNA反應(yīng)，反應(yīng)體系及條件如下:
[0032]
【權(quán)利要求】
1.一種長鏈非編碼RNA在制備用于食管癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)試劑中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述食管癌為食管鱗狀細(xì)胞癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述長鏈非編碼RNA序列如序列表中SEQID N0.1 所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的用于食管癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的試劑為實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑。
5.一種用于食管癌輔助診斷或者療效預(yù)測(cè)的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括根據(jù)核苷酸序列為SEQ ID N0.1的長鏈非編碼RNA設(shè)計(jì)并合成出特異性用于實(shí)時(shí)定量PCR的檢測(cè)引物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，用于長鏈非編碼RNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的特異性引物如序列表中SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示。
7.一種長鏈非編碼RNA的檢測(cè)方法，包括樣品RNA的提取、樣品cDNA的制備、IncRNA的擴(kuò)增。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的樣品RNA的提取、樣品cDNA的制備、IncRNA的擴(kuò)增的具體步驟包括: 1)樣品總RNA的提取:按照LifeTechnologies公司的TRIzol?_試劑所需試劑及步驟提取食管鱗狀細(xì)胞癌組織或腫瘤的Total RNA ;再用NanoDiOp ND-1000核酸定量儀定量(NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware)定量所提取的 RNA 的純度和濃度，甲醒變性膠電泳質(zhì)檢確保提取的RNA的完整性。 2)樣品cDNA 的制備:米用 TaKaRa 試劑盒 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNAEraser (Perfect Real Time)(貨號(hào)RR047A)對(duì)提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ;該試劑盒內(nèi)含RNase-Free DNase，可有效去除混雜的基因組DNA。 3)IncRNA 的擴(kuò)增:采用 TAKARA SYBR Premix Ex Taq? II (TIi RNaseH Plus)熒光定量試劑盒，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103952474SQ201410122636
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年3月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月27日
【發(fā)明者】曹秀峰, 李蘇卿, 仝宇梭, 史衛(wèi)紅, 庹磊, 汪春梅, 謝海偉, 劉子豪, 楊同昕, 呂進(jìn), 紀(jì)律, 朱斌, 王和明, 李義生 申請(qǐng)人:南京市第一醫(yī)院