重組桿狀病毒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供整合了編碼γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）的基因及編碼DT-黃遞酶（NQO1）的基因的重組桿狀病毒。
【專利說(shuō)明】重組桿狀病毒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及重組桿狀病毒及含所述病毒的重組型維生素K依賴性蛋白質(zhì)的制造用試劑盒。另外，本發(fā)明也涉及感染了重組桿狀病毒的宿主細(xì)胞。再者，本發(fā)明也涉及重組型維生素K依賴性蛋白質(zhì)的制造方法。

【背景技術(shù)】
[0002]維生素K是擔(dān)負(fù)各種維生素K依賴性蛋白質(zhì)的翻譯后修飾的Y-谷氨酰羧化酶(GGCX)的輔因子。在維生素K的存在下，GGCX將各種維生素K依賴性蛋白質(zhì)的指定的谷氨酸殘基羧基化，轉(zhuǎn)變?yōu)閅-羧基谷氨酸(Gla)。已知此Y-谷氨酰羧基化對(duì)于維生素K依賴性蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能(例如，血液凝固、骨代謝、信號(hào)傳遞等)極其重要。例如，作為維生素K依賴性蛋白質(zhì)之一的血液凝固第II因子(凝血酶原)或第X因子通過(guò)Y-谷氨酰羧基化，能夠向作為凝固反應(yīng)的場(chǎng)所的細(xì)胞膜的磷脂結(jié)合，由此可接受由于其他因子開始的活化反應(yīng)。
[0003]第II因子或如第X因子這樣的維生素K依賴性凝血因子主要用人或牛的血漿作為原料進(jìn)行制備，由此存在混入感染性物質(zhì)或制品的批間有差異的問(wèn)題。因此，近年研究一開發(fā)了通過(guò)利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因重組技術(shù)制造維生素K依賴性凝血因子的方法。
[0004]但是，已知通過(guò)利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)得到的維生素K依賴性凝血因子完全不被Y-谷氨酰羧基化。由于活化不被Y-谷氨酰羧基化的凝血因子通常是困難的，因此從產(chǎn)業(yè)上利用的觀點(diǎn)來(lái)看，期望重組維生素K依賴性凝血因子在用表達(dá)蛋白質(zhì)的系統(tǒng)得到的階段就被充分地Y-谷氨酰羧基化。因此開發(fā)了，在利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中，通過(guò)共表達(dá)維生素K依賴性蛋白質(zhì)和GGCX來(lái)得到Y(jié) -谷氨酰羧基化蛋白質(zhì)的方法(參照W02005/038019)。
[0005]另一方面，在維生素K依賴性蛋白質(zhì)的Y-谷氨酰羧基化中，除了 GGCX之外，已知維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)和DT-黃遞酶(NAD (P)H依賴性醌氧化物還原酶I ;也被稱為 NOQl)也相關(guān)(參見 Tie J-K.等人，Blood, vol.117，ρ.2967-2974 (2011))。其中，與
Y-谷氨酰羧基化直接相關(guān)的酶是GGCX，VKOR及NQOl是與維生素K的再循環(huán)相關(guān)的酶，近年也開發(fā)了在利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中，通過(guò)共表達(dá)維生素K依賴性蛋白質(zhì)、GGCX及VKOR來(lái)得到Y(jié) -谷氨酰羧基化蛋白質(zhì)的方法(參照W02006/067116)。
[0006]發(fā)明概述
[0007]由于上述的方法均使用利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，Y-谷氨酰羧基化蛋白質(zhì)的產(chǎn)量從工業(yè)規(guī)模的制造的觀點(diǎn)來(lái)看極其少，另外還有制造成本高的問(wèn)題。
[0008]另一方面已知用利用大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)，可期待大量表達(dá)期望的蛋白質(zhì)，但是所表達(dá)的蛋白質(zhì)并未進(jìn)行翻譯后修飾。此外還知道，在使其表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)時(shí)，所述蛋白質(zhì)幾乎全部變成不溶性凝集體。另外，用以往的利用鱗翅目昆蟲的表達(dá)系統(tǒng)可期待表達(dá)接近天然型蛋白質(zhì)的翻譯后修飾的蛋白質(zhì)，但在本發(fā)明人的預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，在蠶中表達(dá)的維生素K依賴性蛋白質(zhì)幾乎未被Y-谷氨酰羧基化。
[0009]鑒于上述這樣的情況，本發(fā)明人以提供制造滿足下述兩個(gè)條件的重組型維生素K依賴性蛋白質(zhì)的手段作為課題:可簡(jiǎn)便并且大量地制造維生素K依賴性蛋白質(zhì)、和所得到的維生素K依賴性蛋白質(zhì)被充分地Y-谷氨酰羧基化。
[0010]本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用整合有編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因的重組桿狀病毒、和整合有編碼維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因的重組桿狀病毒的鱗翅目昆蟲的表達(dá)系統(tǒng)，可簡(jiǎn)便并且大量地得到維生素K依賴性蛋白質(zhì)，所得到的維生素K依賴性蛋白質(zhì)被充分地
Y-谷氨酰羧基化，從而完成本發(fā)明。
[0011]本發(fā)明提供整合了編碼Y-谷氨酰羧化酶(GGCX)的基因及編碼DT-黃遞酶(NQOl)的基因的重組桿狀病毒。
[0012]本發(fā)明提供重組型維生素K依賴性蛋白質(zhì)的制造方法。此方法包括下述步驟:使用整合有編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因的重組桿狀病毒，在鱗翅目昆蟲或上述鱗翅目昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)。
[0013]本發(fā)明通過(guò)利用鱗翅目昆蟲或該鱗翅目昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，可簡(jiǎn)便并且大量地制造Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1:是顯示蠶來(lái)源的培養(yǎng)細(xì)胞中的各蛋白質(zhì)的表達(dá)量的照片，所述蠶來(lái)源的培養(yǎng)細(xì)胞是被用于將GGCX、NQ01及VKOR分別單獨(dú)表達(dá)，或者將它們之中的2種共表達(dá)的重組桿狀病毒的感染的細(xì)胞。
[0015]圖2:圖2A是顯示在感染了實(shí)施例1中制作的各種的重組桿狀病毒，和用于表達(dá)人第X因子的重組桿狀病毒的蠶幼蟲中的人第X因子的表達(dá)量的照片，圖2B是顯示表達(dá)的人第X因子的Y-谷氨酰羧基化的程度的照片。
[0016]圖3:圖3A是顯示在感染了用于共表達(dá)GGCX及NQOl的重組桿狀病毒，和用于表達(dá)人凝血酶原的重組桿狀病毒的蠶蛹中的人凝血酶原的表達(dá)量的照片，圖3B是顯示表達(dá)的人凝血酶原的Y-谷氨酰羧基化的程度的照片。
[0017]圖4:圖4A是顯示在感染了實(shí)施例1中制作的各種的重組桿狀病毒，和用于表達(dá)人第X因子的重組桿狀病毒的蠶幼蟲中的人第X因子的表達(dá)量的照片，圖4B是顯示表達(dá)的人第X因子的Y-谷氨酰羧基化的程度的照片。
[0018]發(fā)明詳述
[0019]以下參照附圖描述本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式。
[0020]本發(fā)明的重組桿狀病毒整合了編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因，可在鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞中共表達(dá)GGCX及NQ01。本發(fā)明的重組桿狀病毒可在鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)時(shí)適宜地使用。即，通過(guò)用本發(fā)明的重組桿狀病毒，和整合編碼希望的維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因的重組桿狀病毒感染鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞，可在該昆蟲或培養(yǎng)細(xì)胞中大量地表達(dá)Y -谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)。
[0021]在本說(shuō)明書中，維生素K依賴性蛋白質(zhì)是指，在維生素K的存在下，由GGCX羧基化指定的谷氨酸殘基而將其變換為Gla的蛋白質(zhì)。作為那樣的蛋白質(zhì)，可舉出例如，維生素K依賴性凝血因子、骨Gla蛋白質(zhì)、基質(zhì)Gla蛋白質(zhì)、增殖抑制特異性蛋白質(zhì)6及棘蛇亞科(Acanthophiinae) FXa樣蛋白等。另外,維生素K依賴性凝血因子只要是通過(guò)被Y _谷氨酰羧基化而活化，或者能接受活化反應(yīng)的凝血因子，就沒(méi)有特別限定，可舉出例如，凝血酶原(第II因子)、第VII因子、第IX因子、第X因子、蛋白C、蛋白S、蛋白Z等。
[0022]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，編碼GGCX的基因(以下，也稱為“GGCX基因”)只要是從具有GGCX的期望的生物種來(lái)源的GGCX基因，就沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為人GGCX基因，更優(yōu)選為編碼SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列的基因。再有，人GGCX基因的堿基序列本身是公知的，例如，可在由美國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)圖書館的國(guó)立生物信息中心(Nat1nal Center forB1technology Informat1n:NCBI )提供的數(shù)據(jù)庫(kù)，以登記號(hào)EU847509訪問(wèn)。或者，作為GGCX基因，也可使用編碼與野生型GGCX有同等的生物活性的變異型GGCX的基因。
[0023]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，編碼NQOl的基因(以下，也稱為“NQ01基因”)只要是從有NQOl的期望的生物種來(lái)源的NQOl基因，就沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為人NQOl基因，更優(yōu)選為編碼SEQ ID N0:2所表示的氨基酸序列的基因。再有，人NQOl基因的堿基序列本身是公知的，例如，在由NCBI提供的數(shù)據(jù)庫(kù)，以登記號(hào)AK312368訪問(wèn)?；蛘?，作為NQOl基因，也可使用編碼與野生型NQOl有同等的生物活性的變異型NQOl的基因。
[0024]在本發(fā)明的重組桿狀病毒的DNA中的GGCX基因及NQOl基因的位置是只要各基因所編碼的酶在鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)，就沒(méi)有特別限定。從而，在本發(fā)明的重組桿狀病毒的DNA中，GGCX基因及NQOl基因可連續(xù)插入，也可在互相分離的位置插入。當(dāng)這些基因連續(xù)插入到桿狀病毒DNA時(shí)，GGCX及NQOl作為融合蛋白質(zhì)表達(dá)。再有，GGCX基因及NQOl基因之中，將任何一方作為上游，沒(méi)有特別限定。另一方面，GGCX基因及NQOl基因在桿狀病毒DNA中插入到互相分離的位置時(shí)，GGCX及NQOl分別作為個(gè)別的蛋白質(zhì)表達(dá)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，GGCX基因及NQOl基因在桿狀病毒DNA中插入到互相分離的位置是優(yōu)選的。
[0025]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，桿狀病毒的種類只要是可感染鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞的病毒，就沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為核多角體病病毒(NPV)或其改變型病毒。作為那樣的病毒，可舉出例如BmNPV、HycuNPV, AnpeNPV, AcNPV、蠶蛾科的蠶(Bombyx mori)或夜蛾科的苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)等的兩宿主感染的重組桿狀病毒(參照特開2003-52371號(hào)公報(bào))等。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用半胱氨酸蛋白酶缺損(CPd)桿狀病毒(參照特愿平7-303488號(hào))。
[0026]本發(fā)明的重組桿狀病毒可由本領(lǐng)域公知的方法制作。作為那樣的方法，可舉出例如，使用可由同源重組將希望的基因插入桿狀病毒DNA的轉(zhuǎn)移載體的方法。此方法中，將整合了希望的基因的轉(zhuǎn)移載體，和由限制性內(nèi)切酶等線性化的桿狀病毒DNA共轉(zhuǎn)染到鱗翅目昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞中，通過(guò)篩選感染細(xì)胞，可得到重組桿狀病毒。
[0027]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，轉(zhuǎn)移載體只要是有使在鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞中的基因表達(dá)成為可能的啟動(dòng)子，可在該啟動(dòng)子的下游插入希望的基因的載體DNA，就沒(méi)有特別限定。本領(lǐng)域公知那樣的轉(zhuǎn)移載體本身，可舉出例如PM02、pM23、pCPM、pYNG、pBM030、pBM050、pVL1392等。再有，上述的啟動(dòng)子可從本領(lǐng)域公知的啟動(dòng)子適宜選擇，可舉出例如，多角體蛋白啟動(dòng)子、PlO啟動(dòng)子、蠶肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等。
[0028]使用轉(zhuǎn)移載體制作本發(fā)明的重組桿狀病毒時(shí)，GGCX基因及NQOl基因可整合到相同的轉(zhuǎn)移載體中，也可分別整合到個(gè)別的轉(zhuǎn)移載體中。當(dāng)將GGCX基因及NQOl基因分別整合進(jìn)個(gè)別的轉(zhuǎn)移載體中時(shí)，這2種轉(zhuǎn)移載體優(yōu)選為可將各基因整合到桿狀病毒DNA中的互相不同的位置的載體的組合。作為那樣的載體的組合，可舉出例如，可將桿狀病毒DNA的多角體蛋白基因部位重組為希望的基因的轉(zhuǎn)移載體，和可將桿狀病毒DNA的半胱氨酸蛋白酶基因部位重組為希望的基因的轉(zhuǎn)移載體的組合。
[0029]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，根據(jù)需要，也可向GGCX及NQOl融合蛋白質(zhì)分泌信號(hào)序列。即，在本發(fā)明的重組桿狀病毒中，也可將編碼蛋白質(zhì)分泌信號(hào)序列的基因再分別整合到GGCX基因及NQOl基因的上游或下游。那樣的蛋白質(zhì)分泌信號(hào)序列，可根據(jù)重組型維生素K依賴性蛋白質(zhì)的種類等，在利用鱗翅目昆蟲的表達(dá)系統(tǒng)中，從使用的公知的序列適宜選擇?？膳e出例如，凝血酶原來(lái)源分泌信號(hào)序列(SEQ ID NO: 3)、蠶來(lái)源30K信號(hào)序列(SEQID NO:4)及蠶來(lái)源SP信號(hào)序列(SEQ ID NO: 5)等。
[0030]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，根據(jù)需要，也可向GGCX及NQOl融合功能性標(biāo)簽。即，在本發(fā)明的重組桿狀病毒中，也可將編碼功能性標(biāo)簽的基因再分別整合到GGCX基因及NQOl基因的上游或下游。作為那樣的功能性標(biāo)簽的種類，特別優(yōu)選蛋白質(zhì)純化用標(biāo)簽，可舉出例如，F(xiàn)LAG標(biāo)簽、6 X Hi s標(biāo)簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)標(biāo)簽等。
[0031]在本發(fā)明的別的實(shí)施方式中，也可向整合了 GGCX基因及NQOl基因的重組桿狀病毒再整合有編碼維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因。此時(shí)，編碼維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因，在桿狀病毒DNA中，以可表達(dá)的方式整合到與GGCX基因及NQOl基因分離的位置是優(yōu)選的。即，維生素K依賴性蛋白質(zhì)作為與GGCX及NQOl個(gè)別的蛋白質(zhì)表達(dá)。通過(guò)這樣的重組桿狀病毒，使得單獨(dú)用該病毒在鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞中大量地表達(dá)Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)成為可能。
[0032]在本發(fā)明的范圍內(nèi)還包括，通過(guò)用上述的本發(fā)明的重組桿狀病毒感染鱗翅目昆蟲或鱗翅目昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞而得到的宿主細(xì)胞。
[0033]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，鱗翅目昆蟲只要是適宜于重組蛋白質(zhì)的表達(dá)的公知的鱗翅目昆蟲，就沒(méi)有特別限定，可舉出例如，蠶(Bombyx mori)、黃領(lǐng)麻紋燈蛾(Spilosomaimpari I is)、作香(Antheraea pernyi )、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)等。在它們之中，特別優(yōu)選蠶。再有，鱗翅目昆蟲可以是成蟲、蛹及幼蟲中的任何一種形態(tài)，但從絲氨酸蛋白酶的活性和對(duì)桿狀病毒的感受性的角度來(lái)看，優(yōu)選使用蛹或幼蟲。另外，作為鱗翅目昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞，只要是由適宜于重組型蛋白質(zhì)的表達(dá)的鱗翅目昆蟲建立的細(xì)胞株，就沒(méi)有特別限定，可舉出例如BmN、BmN4、SpIm、Anpe、Sf9、Sf21、High5 等。
[0034]用本發(fā)明的重組桿狀病毒感染鱗翅目昆蟲或此鱗翅目昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞的手段沒(méi)有特別限定，可從本領(lǐng)域公知的方法適宜選擇。例如，當(dāng)感染鱗翅目昆蟲時(shí)，可舉出將含重組桿狀病毒的液體注射進(jìn)該昆蟲的方法等。另外，當(dāng)感染培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，也可將含重組桿狀病毒的液體添加到培養(yǎng)基中。向鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞感染重組桿狀病毒起飼育或培養(yǎng)5~8天，則在宿主細(xì)胞中，重組蛋白質(zhì)表達(dá)。
[0035]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，可在向鱗翅目昆蟲或此鱗翅目昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞感染整合了 GGCX基因及NQOl基因的重組桿狀病毒之后，再感染整合編碼希望的維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因的重組桿狀病毒。
[0036]在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括整合了編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因的重組桿狀病毒，也包括重組維生素K依賴性蛋白質(zhì)的制造用試劑盒(以下，也簡(jiǎn)稱為“試劑盒”)。再有，對(duì)于此重組桿狀病毒而言，與對(duì)于本發(fā)明的重組桿狀病毒所描述的內(nèi)容相同。
[0037]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，優(yōu)選重組桿狀病毒再整合編碼維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因。即，在桿狀病毒DNA中，整合有GGCX基因、NQOl基因及編碼維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因這3種。對(duì)于此實(shí)施方式的重組桿狀病毒而言，與對(duì)于本發(fā)明的重組桿狀病毒所描述的內(nèi)容相同。
[0038]在別的實(shí)施方式中，本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選還含有整合編碼維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因的重組桿狀病毒。再有，此桿狀病毒，除了作為希望的基因使用編碼維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因以外，可如本發(fā)明的桿狀病毒同樣方式地制作。其中，整合了編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因的重組桿狀病毒也稱為“第I桿狀病毒”，整合了編碼維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因的重組桿狀病毒也稱為“第2桿狀病毒”。在此實(shí)施方式的試劑盒中，第I桿狀病毒和第2桿狀病毒可在分開的容器中保存，也可將兩者混合而在I個(gè)容器中保存。再有，將第I桿狀病毒和第2桿狀病毒混合保存時(shí)，兩者的混合比例沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選按照病毒效價(jià)1:1來(lái)混合。
[0039]在本發(fā)明的范圍內(nèi)包括重組型維生素K依賴性蛋白質(zhì)的制造方法(以下，也簡(jiǎn)稱為“制造方法”)，其包括下述步驟:使用整合了編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因的重組桿狀病毒，將Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)在鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)。再有，對(duì)于此重組桿狀病毒、鱗翅目昆蟲及此昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞而言，與對(duì)本發(fā)明的重組桿狀病毒所描述的內(nèi)容相同。
[0040]在本發(fā)明的實(shí)施方式中，優(yōu)選重組桿狀病毒再整合編碼維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因。對(duì)于此實(shí)施方式的重組桿狀病毒而言，與對(duì)本發(fā)明的重組桿狀病毒所描述的內(nèi)容相同?；蛘?，與整合了編碼GGCX的基因及編碼NQOl的基因的重組桿狀病毒(第I桿狀病毒)一同使用整合編碼維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因的重組桿狀病毒(第2桿狀病毒)是優(yōu)選的。
[0041]在本發(fā)明的制造方法中，可通過(guò)用上述的重組桿狀病毒感染鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞來(lái)表達(dá)Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)。再有，感染手段與對(duì)本發(fā)明的宿主細(xì)胞所描述內(nèi)容相同。
[0042]在本發(fā)明的制造方法中，當(dāng)使用第I桿狀病毒及第2桿狀病毒時(shí)，可同時(shí)感染到鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞，也可在感染其中一種重組桿狀病毒之后，再感染另一種重組桿狀病毒。此時(shí)，從第1次的感染I周之內(nèi)進(jìn)行第2次的感染是優(yōu)選的。再有，第I桿狀病毒和第2桿狀病毒的使用量的比例沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選為病毒效價(jià)為1:1的量。
[0043]通常，可通過(guò)向鱗翅目昆蟲或其昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞感染重組桿狀病毒起飼育或培養(yǎng)5~8天來(lái)表達(dá)Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，從表達(dá)目的蛋白質(zhì)的鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞取得該蛋白質(zhì)的手段沒(méi)有特別限定。例如，使用鱗翅目昆蟲時(shí)，可通過(guò)采集體液，或者將該昆蟲破碎而制備勻漿來(lái)取得Y -谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)。另外，使用培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，可通過(guò)將該細(xì)胞物理性破碎，或者在含表面活性劑等的細(xì)胞溶解劑的溶液中溶解來(lái)取得Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)。
[0044]在本發(fā)明的制造方法中，根據(jù)需要，可再包括從上述的表達(dá)步驟得到的鱗翅目昆蟲或此昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞取得含Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)的可溶性級(jí)分的步驟?？赏ㄟ^(guò)將如上述一樣得到的鱗翅目昆蟲的體液或勻漿、或者細(xì)胞破碎液或細(xì)胞裂解物過(guò)濾或離心，分離上清而得到可溶性級(jí)分。再有，離心時(shí)，也可向樣品任意地添加適當(dāng)?shù)木彌_液。那樣的緩沖液只要是適宜于蛋白質(zhì)的保存，就沒(méi)有特別限定，可舉出例如，TriS緩沖液、磷酸緩沖液等。
[0045]接下來(lái)，通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例
[0046]實(shí)施例1:重組桿狀病毒的制作及表達(dá)的探討
[0047](I)分別編碼GGCX、NQOl及VKOR的基因的亞克隆
[0048]基于已經(jīng)報(bào)告的人GGCX基因的堿基序列(NCBI Acc.N0.EU847509)、人NQOl基因的喊基序列(NCBI Acc.N0.AK312368)及人VKOR基因的喊基序列(NCBI Acc.N0.AY521634)，設(shè)計(jì)用于亞克隆各基因的引物組。下面顯示了各引物的堿基序列。再有，在各引物各自附加適宜的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的堿基序列。
[0049](i) GGCX基因用引物組
[0050]F:5’-GGGGTACCATGGCGGTGTCTGCCGGGTCCGC-3’(SEQ ID NO:6)
[0051]R:5，-GCTCTAGAGAACTCTGAGTGGACAGGATCA-3’(SEQ ID NO:7)
[0052](ii) NQOl基因用引物組
[0053]F:5’-GAAGATCTATGGTCGGCAGAAGAGCACTGATCGTA-3’(SEQ ID NO:8)
[0054]R:5’-GCTCTAGATTTTCTAGCTTTGATCTGGTTGTCAGTT-3’(SEQ ID NO:9)
[0055](iii) VKOR基因用引物組
[0056]F:5’-GGGGTACCATGGGCAGCACCTGGGGGAGCCCT-3’ (SEQ ID NO:10)
[0057]R:5’-GCTCTAGATCAGTGCCTCTTAGCCTTGCCCTG-3’ (SEQ ID NO:11)
[0058]使用上述的引物組，通過(guò)以人肝臟cDNA庫(kù)(clontech公司)作為模板的PCR法分離GGCX基因、NQOl基因及VKOR基因。將分離的各基因的DNA片段使用QIAquick (QIAGEN公司)純化，用限制性內(nèi)切酶(GGCX =KpnI及Xba1、NQOl:XbaI, VKOR =KpnI及XbaI)處理。將得到的各片段整合到PM23載體(Sysmex株式會(huì)社)的多克隆位點(diǎn)。將得到的質(zhì)粒構(gòu)建體各自稱為pM-GGCX、pM-NQ01及pM_VK0R。這些的質(zhì)粒是Polh部位重組用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。另外，將上述的限制性內(nèi)切酶處理后的各DNA片段整合到pCPM載體(Sysmex株式會(huì)社)的多克隆位點(diǎn)。將得到的質(zhì)粒構(gòu)建體各自稱為pCPM-GGCX、pCPM-NQ01及pCPM_VK0R。這些質(zhì)粒是CP部位重組用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒。
[0059]再有，上述的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒均在導(dǎo)入基因的下游整合有編碼FLAG標(biāo)簽的基因，所以在使用各轉(zhuǎn)移質(zhì)粒表達(dá)的蛋白質(zhì)的C末端融合有FLAG標(biāo)簽。
[0060](2)重組桿狀病毒的制作
[0061](2-1)單獨(dú)表達(dá)病毒的制作
[0062]制作用于分別單獨(dú)表達(dá)GGCX、NQOl及VKOR的重組桿狀病毒。這些重組桿狀病毒的制作是將 Maeda 等的方法(InverterbrateCell system 及 Applicat1ns, Vol.1，p.167-181，CRC Press, Boca Raton (1989))改變而進(jìn)行。具體而言如下。首先，將上述的Polh部位重組用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒用質(zhì)粒純化試劑盒(QIAGEN公司)純化。然后，將各轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(0.5μ g)和直鏈化的CPd桿狀病毒(ATCC VR2500)的DNA (0.2μ g)使用脂轉(zhuǎn)染試劑(X-tremeGENE9DNA轉(zhuǎn)染試劑:Roche公司)共轉(zhuǎn)染進(jìn)BmN細(xì)胞(Maeda，1989)。篩選通過(guò)利用96孔板的有限稀釋法進(jìn)行，挑選確認(rèn)感染跡象的病毒，回收培養(yǎng)上清。由此，得到分別整合GGCX基因、NQOl基因及VKOR基因的重組桿狀病毒。將得到的病毒分別稱為GGCX單獨(dú)表達(dá)病毒、NQOl單獨(dú)表達(dá)病毒及VKOR單獨(dú)表達(dá)病毒。
[0063](2-2)共表達(dá)病毒的制作
[0064]制作用于分別共表達(dá)GGCX及NQOl、以及GGCX及VKOR的各自的組合的重組桿狀病毒。這些重組桿狀病毒的制作通過(guò)改變上述(2-1)的方法來(lái)進(jìn)行。具體而言如下。將上述的Polh 部位重組用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒及CP部位重組用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒由質(zhì)粒純化試劑盒(QIAGEN公司)純化。然后，將各Polh部位重組用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(0.5 μ g)、各CP部位重組用轉(zhuǎn)移質(zhì)粒(0.5 μ g),和 5cut CPd 桿狀病毒(ATCC VR2500)的 DNA (0.2 μ g)，使用脂轉(zhuǎn)染試劑(X_tremeGENE9DNA轉(zhuǎn)染試劑=Roche公司)共轉(zhuǎn)染進(jìn)BmN細(xì)胞(Maeda，1989)。篩選通過(guò)利用96孔板的有限稀釋法進(jìn)行，挑選確認(rèn)感染跡象的病毒，回收培養(yǎng)上清。由此，得到分別整合GGCX基因、NQOl基因及VKOR基因的重組桿狀病毒。將得到的病毒分別稱為GGCX/NQ01共表達(dá)病毒及GGCX/VKOR共表達(dá)病毒。
[0065](3) BmN細(xì)胞中的標(biāo)簽融合凝血酶原的表達(dá)的探討
[0066]回收上清后，制備BmN細(xì)胞的裂解物。對(duì)于得到的裂解物，用SDS-PAGE及使用抗FLAG抗體(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社)的蛋白印跡進(jìn)行解析。結(jié)果示于圖1。由圖1確認(rèn)，BmN裂解物中表達(dá)具有被預(yù)測(cè)為是GGCX、NQOl及VKOR的分子量的蛋白質(zhì)。
[0067]實(shí)施例2:蠶中的維生素K依賴性蛋白質(zhì)的表達(dá)及Y -谷氨酰谷氨酰羧基化的探討
[0068](I)分別編碼第X因子及凝血酶原的基因的亞克隆
[0069]基于數(shù)據(jù)庫(kù)中公開的人第X因子基因(以下，也稱為hFX基因)的堿基序列(NCBIAcc.N0.BC_040125)及人凝血酶原基因(以下，也稱為hPTH基因)的堿基序列(NCBI Acc.N0.NM_000506)，設(shè)計(jì)用于克隆各基因的引物組。以下顯示各引物的序列。再有，向各引物分別附加適宜的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的堿基序列。
[0070](i) hFX基因用引物組
[0071]F:5’-AAGGTACCCGGGGATCCATGGGGCGCCCACTG-3’ (SEQ ID NO:12)
[0072]R:5’-AATCTAGATCACTTTAATGGAGAGGACGTTAT-3’ (SEQ ID NO:13)
[0073](ii)hPTH基因用引物組
[0074]F:5’-AAGAATTCATGGCCAACACCTTCTTGGAGGAG-3’ (SEQ ID NO:14)
[0075]R:5’-AATCTAGACTACTCTCCAAACTGATCAATGACCTT-3’ (SEQ ID NO:15)
[0076]使用上述的引物組，通過(guò)以人肝臟cDNA庫(kù)(clontech公司)作為模板的PCR法分離hFX基因及hPTH基因。將分離的DNA片段使用QIAquick (QIAGEN公司)進(jìn)行純化，用限制性內(nèi)切酶KpnI及XbaI處理之后，整合到pM23載體(Sysmex株式會(huì)社)的多克隆位點(diǎn)。將得到的質(zhì)粒構(gòu)建體分別稱為PM-FX及pM-PTH。
[0077](2)重組桿狀病毒的制作
[0078]制作用于分別單獨(dú)表達(dá)第X因子及凝血酶原的重組桿狀病毒。這些重組桿狀病毒的制作是，使用PM-FX及pM-PTH，如上述實(shí)施例1的(2-1)同樣地進(jìn)行。由此得到分別整合第X因子基因及凝血酶原基因的重組桿狀病毒。將得到的病毒分別稱為FX單獨(dú)表達(dá)病毒及PTH單獨(dú)表達(dá)病毒。
[0079](3)維生素K依賴性蛋白質(zhì)的表達(dá)及Y-谷氨酰羧基化
[0080](3-1)人第X因子
[0081](i)人第X因子的表達(dá)及Y-谷氨酰羧基化的探討
[0082]將FX單獨(dú)表達(dá)病毒，和上述的實(shí)施例1中制作的各表達(dá)病毒混合至病毒效價(jià)為1:1的比率,將其接種于蠶幼蟲(品種:近秋錦和。從上田蠶種公司購(gòu)入蠶卵，由Sysmex株式會(huì)社人工飼育至幼蟲)。另外，作為對(duì)照，僅將FX單獨(dú)表達(dá)病毒接種于蠶幼蟲。病毒接種7天后，從感染幼蟲提取體液。為了確認(rèn)第X因子的表達(dá)量，對(duì)于得到的體液之一部分，用SDS-PAGE及使用抗因子X(jué)抗體(Enzyme research Laboratories公司)的蛋白印跡進(jìn)行解析。另外，為了檢測(cè)Y-谷氨酰羧基化的第X因子，對(duì)于得到的體液，使用抗Gla-結(jié)構(gòu)域抗體(積水Medical株式會(huì)社)進(jìn)行免疫沉降，對(duì)于得到的沉降物，用SDS-PAGE及使用抗因子X(jué)抗體(Enzyme research Laboratories公司)的蛋白印跡進(jìn)行解析。結(jié)果示于圖2。再有，圖2的各試驗(yàn)區(qū)中的樣品如下。
[0083]試驗(yàn)區(qū)1:GGCX/NQ01共表達(dá)病毒及FX單獨(dú)表達(dá)病毒
[0084]試驗(yàn)區(qū)2:GGCX/VK0R共表達(dá)病毒及FX單獨(dú)表達(dá)病毒
[0085]試驗(yàn)區(qū)3 =GGCX單獨(dú)表達(dá)病毒及FX單獨(dú)表達(dá)病毒
[0086]試驗(yàn)區(qū)4 =NQOl 單獨(dú)表達(dá)病毒及FX單獨(dú)表達(dá)病毒
[0087]試驗(yàn)區(qū)5 =VKOR單獨(dú)表達(dá)病毒及FX單獨(dú)表達(dá)病毒
[0088]試驗(yàn)區(qū)6:FX單獨(dú)表達(dá)病毒
[0089]PC:天然型人第 X 因子(Haematologic Technologies 公司)
[0090]NC:未感染蠶幼蟲體液
[0091]從圖2A知，在試驗(yàn)區(qū)I~6均確認(rèn)條帶，在第X因子的表達(dá)量上未見到大的差異。從圖2B知，在感染FX單獨(dú)表達(dá)病毒和GGCX/NQ01共表達(dá)病毒的樣品(試驗(yàn)區(qū)I)中，相比其他樣品(試驗(yàn)區(qū)2~6)，得到顯著高的信號(hào)。結(jié)果提示，在蠶幼蟲中共表達(dá)GGCX及NQOl和第X因子時(shí)，有效得到Y(jié)-谷氨酰羧基化的第X因子。
[0092](ii)人第X因子的表達(dá)量的探討
[0093]將感染GGCX/NQ01共表達(dá)病毒及FX單獨(dú)表達(dá)病毒的蠶幼蟲的體液中含的人第X因子的濃度由使用人因子X(jué) ELISA試劑盒(Assaypro公司)的夾心ELISA法測(cè)定。結(jié)果得知，在體液中含500μ g/ml左右的人第X因子。每I只蠶幼蟲的體液的回收量是0.4ml左右，所以預(yù)測(cè)每I只蠶幼蟲的表達(dá)量是200 μ g左右。
[0094](3-2)關(guān)于人凝血酶原
[0095]將PTH單獨(dú)表達(dá)病毒和GGCX/NQ01共表達(dá)病毒混合至病毒效價(jià)成1:1的比率，將其接種于蠶蛹(品種:近秋錦和。長(zhǎng)上田蠶種公司購(gòu)入蠶卵，由Sysmex株式會(huì)社人工飼育至蛹)。另外，作為對(duì)照，僅將PTH單獨(dú)表達(dá)病毒接種于蠶幼蟲。病毒接種7天后，回收感染的蛹，將其于_80°C冷凍。將冷凍的蛹用混合機(jī)破碎。將得到的破碎液中的蛹?xì)堅(jiān)退匐x心處理及并通過(guò)過(guò)濾除去，得到勻漿。為了確認(rèn)凝血酶原的表達(dá)量，對(duì)于得到的勻漿之一部分,用SDS-PAGE及使用抗凝血酶抗體(Novus公司)的蛋白印跡進(jìn)行解析。另外，為了檢測(cè)
Y-谷氨酰羧基化的凝血酶原，對(duì)于得到的體液，使用抗Gla-結(jié)構(gòu)域抗體(積水Medical株式會(huì)社)進(jìn)行免疫沉降，對(duì)于得到的沉降物，用SDS-PAGE及使用抗凝血酶抗體(Novus公司)的蛋白印跡進(jìn)行解析。結(jié)果示于圖3。再有，圖3的各試驗(yàn)區(qū)中的樣品如下。
[0096]試驗(yàn)區(qū)1:GGCX/NQ01共表達(dá)病毒及PTH單獨(dú)表達(dá)病毒
[0097]試驗(yàn)區(qū)2 =PTH單獨(dú)表達(dá)病毒
[0098]PC:天然型人凝血酶原(人血衆(zhòng)來(lái)源、Calb1chem公司)
[0099]NC:未感染蠶勻漿
[0100]從圖3A知，試驗(yàn)區(qū)I及2均確認(rèn)條帶，所以凝血酶原的表達(dá)量未見大的差異。從圖3B得知，在感染PTH單獨(dú)表達(dá)病毒和GGCX/NQ01共表達(dá)病毒的樣品(試驗(yàn)區(qū)I)中，相比其他樣品(試驗(yàn)區(qū)2)得到顯著高的信號(hào)。結(jié)果提示，在蠶蛹中共表達(dá)GGCX及NQOl和凝血酶原時(shí)，有效得到Y(jié)-谷氨酰羧基化的凝血酶原。
[0101]實(shí)施例3:蠶中的維生素K依賴性蛋白質(zhì)的Y -谷氨酰羧基化的條件的探討
[0102]將上述的實(shí)施例2中制作的FX單獨(dú)表達(dá)病毒，和上述的實(shí)施例1中制作的各表達(dá)病毒混合至病毒效價(jià)成下述比率，將其接種于蠶幼蟲(品種:近秋錦和。從上田蠶種公司購(gòu)入蠶卵，由Sysmex株式會(huì)社人工飼育至幼蟲)(試驗(yàn)區(qū)I~4)。另外,作為對(duì)照,僅將FX單獨(dú)表達(dá)病毒接種于蠶幼蟲(試驗(yàn)區(qū)5)。
[0103]病毒接種7天后，從感染幼蟲提取體液。為了確認(rèn)第X因子的表達(dá)量，對(duì)于得到的體液之一部分，用SDS-PAGE及使用抗因子X(jué)抗體(Enzyme research Laboratories公司)的蛋白印跡進(jìn)行解析。另外，為了檢測(cè)Y-谷氨酰羧基化的第X因子，對(duì)于得到的體液，使用抗Gla-結(jié)構(gòu)域抗體(積水Medical株式會(huì)社)進(jìn)行免疫沉降,對(duì)于得到的沉降物,用SDS-PAGE及使用抗因子X(jué)抗體(Enzyme research Laboratories公司)的蛋白印跡進(jìn)行解析。結(jié)果示于圖4。圖4的各試驗(yàn)區(qū)中的樣品如下。
[0104]試驗(yàn)區(qū)1:GGCX單獨(dú)表達(dá)病毒:NQ01單獨(dú)表達(dá)病毒:FX單獨(dú)表達(dá)病毒=1:1:1
[0105]試驗(yàn)區(qū)2 =GGCX單獨(dú)表達(dá)病毒:VKOR單獨(dú)表達(dá)病毒:FX單獨(dú)表達(dá)病毒=1:1:1
[0106]試驗(yàn)區(qū)3 =GGCX單獨(dú)表達(dá)病毒:NQ01單獨(dú)表達(dá)病毒:VK0R單獨(dú)表達(dá)病毒:FX單獨(dú)表達(dá)病毒=1:1:1:1
[0107]試驗(yàn)區(qū)4:GGCX/NQ01共表達(dá)病毒:FX單獨(dú)表達(dá)病毒=1:1
[0108]試驗(yàn)區(qū)5:FX單獨(dú)表達(dá)病毒
[0109]PC:天然型人第 X 因子(Haematologic Technologies 公司)
[0110]從圖4A得知，試驗(yàn)區(qū)I~5均確認(rèn)條帶，所以第X因子的表達(dá)量未見大的差異。從圖4B得知，在感染FX單獨(dú)表達(dá)病毒和GGCX/NQ01共表達(dá)病毒的樣品(試驗(yàn)區(qū)I)中，相比其他樣品(試驗(yàn)區(qū)I~3及5)，得到顯著高的信號(hào)。從結(jié)果得知，在蠶幼蟲中，在使用分別單獨(dú)表達(dá)與Y -谷氨酰羧基化相關(guān)的各因子(GGCX、NQOl及VK0R)和第X因子的桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng)中幾乎得不到Y(jié)-谷氨酰羧基化的第X因子。從而顯示，為了有效得到Y(jié)-谷氨酰羧基化的第X因子，有使用GGCX基因及NQOl基因整合到相同的桿狀病毒的GGCX/NQ01共表達(dá)病毒的必要。
【權(quán)利要求】
1.重組桿狀病毒，其整合了編碼Y-谷氨酰羧化酶的基因和編碼DT-黃遞酶的基因。
2.權(quán)利要求1所述的重組桿狀病毒，其中進(jìn)一步整合有編碼維生素K依賴性蛋白質(zhì)的基因。
3.權(quán)利要求2所述的重組桿狀病毒，其中上述維生素K依賴性蛋白質(zhì)是維生素K依賴性凝固因子。
4.權(quán)利要求3所述的重組桿狀病毒，其中上述維生素K依賴性凝固因子選自:凝血酶原、第VII因子、第IX因子、第X因子、蛋白C、蛋白S及蛋白Z。
5.宿主細(xì)胞,其通過(guò)用權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的重組桿狀病毒感染鱗翅目昆蟲或鱗翅目昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞而得到。
6.權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其中上述鱗翅目昆蟲是蠶。
7.重組維生素K依賴性蛋白質(zhì)的制備用試劑盒，其包含整合了編碼Y-谷氨酰羧化酶的基因和編碼DT-黃遞酶的基因的重組桿狀病毒。
8.重組型維生素K依賴性蛋白質(zhì)的制備方法，其包括下述步驟:使用整合了編碼Y-谷氨酰羧化酶的基因和編碼DT-黃遞酶的基因的重組桿狀病毒，使Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)在鱗翅目昆蟲或上述鱗翅目昆蟲的培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)。
9.權(quán)利要求8所述的制備方法，其中上述表達(dá)步驟是在鱗翅目昆蟲中表達(dá)Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)的步驟。
10.權(quán)利要求9所述的制備方法，其中上述表達(dá)步驟是在鱗翅目昆蟲的幼蟲或蛹中表達(dá)Y-谷氨酰羧基化的維生素K依賴性蛋白質(zhì)步驟。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK104073471SQ201410122911
【公開日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月29日
【發(fā)明者】坂東孝彥, 菅井睦美 申請(qǐng)人:希森美康株式會(huì)社