一種雙歧乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法及其凍干菌粉制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雙歧乳桿菌V9的高密度發(fā)酵方法及其凍干菌粉的制備方法，屬于益生菌發(fā)酵領(lǐng)域。雙歧乳桿菌V9（Bifidobacterium?animalis?subsp.lactis?V9，Bifidobacterium?lactis?V9）是從健康蒙古族兒童腸道中分離得到的耐酸和耐膽鹽的益生菌，保藏編號為CGMCC?No.5470。雙歧乳桿菌V9在優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件控制下實現(xiàn)菌體高密度發(fā)酵，發(fā)酵液活菌數(shù)可達2.0×1010cfu/ml以上，該發(fā)酵液制備的雙歧乳桿菌V9凍干菌粉中活菌總數(shù)可以達到6.0×1011cfu/g以上，可應(yīng)用于益生菌發(fā)酵劑或益生菌制劑。
【專利說明】一種雙歧乳桿菌的高密度培養(yǎng)方法及其凍干菌粉制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種乳酸菌的高密度發(fā)酵方法及其凍干菌粉制備方法，尤其涉及一種雙歧乳桿菌V9的高密度發(fā)酵及其凍干菌粉的制備方法。屬于益生菌發(fā)酵領(lǐng)域。
技術(shù)背景
[0002]雙岐乳桿菌與人類的生活關(guān)系密切，是一種常見于奶油、肉類及許多蔬菜發(fā)酵制品中的乳酸菌，能通過胃并定植于腸道發(fā)揮有益作用。它對腸道微生物有重要影響，無論在食品發(fā)酵，還是在工業(yè)乳酸發(fā)酵以及醫(yī)療保健等領(lǐng)域，都有著廣泛的應(yīng)用。
[0003]本發(fā)明使用的雙歧乳桿菌V9是一株自健康蒙古族兒童腸道中分離篩選出的益生菌。研究表明，雙歧乳桿菌V9對常見腸道致病菌(大腸桿菌、鼠傷沙門氏菌、弗氏志賀氏菌、單胞李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌)具有顯著的抑制效果，并可降低動物因腹瀉導(dǎo)致的死亡率。雙歧乳桿菌V9對腹瀉和便秘患者具有顯著的治療作用。2009年完成了雙歧乳桿菌V9的全基因組測序及分析，基因組學(xué)研究結(jié)果表明其遺傳穩(wěn)定，傳代保藏過程中突變重組較少，突變幾率極小。目前該菌株已成功應(yīng)用于發(fā)酵益生菌酸牛乳、發(fā)酵乳飲料、益生菌片劑、益生菌固體飲料等食品或保健食品中，具有良好的應(yīng)用前景。經(jīng)過多年系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究，自主解決了其產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵技術(shù)問題，包括直投式發(fā)酵劑、發(fā)酵豆乳益生菌飲料、發(fā)酵乳制品、益生菌奶粉、益生菌 固體飲料、益生菌片劑和益生菌膠囊等產(chǎn)品，并實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化。
[0004]高密度培養(yǎng)技術(shù)(High Cell Density Culture)，也就是高密度發(fā)酵技術(shù)。由于各個菌種所能達到的最高菌體濃度相差較大，目前的文獻中并沒有對高密度培養(yǎng)有確切的定義。一般來說，高密度培養(yǎng)是指應(yīng)用一定的培養(yǎng)技術(shù)或裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度較傳統(tǒng)培養(yǎng)方式有顯著的提高，從而達到減少培養(yǎng)體積，還可以縮短生產(chǎn)周期，最終提高特定產(chǎn)物的生產(chǎn)速率，減少設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本，提高在市場上的競爭力。
[0005]隨著發(fā)酵劑的商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的迅速增加，工業(yè)發(fā)酵的基本目標(biāo)自然轉(zhuǎn)向了以最小的代價獲得最大的產(chǎn)值和利潤，而實現(xiàn)這一目標(biāo)的工程手段是針對每個特定過程建立相應(yīng)的高效發(fā)酵模式。因此，進行工業(yè)化生產(chǎn)，大規(guī)模培養(yǎng)非遺傳修飾菌和工程菌的技術(shù)和工藝就顯得日趨重要。乳酸菌濃縮發(fā)酵劑制備的關(guān)鍵是要實現(xiàn)對其進行高活性、高密度的培養(yǎng)。
[0006]專利《一種能在豆乳發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化異黃酮的雙歧桿菌》，CN102851223A,公開了一株雙歧桿菌可在豆乳發(fā)酵過程中使無活性的異黃酮轉(zhuǎn)化為功能性活性異黃酮，所述雙歧桿菌已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心，保藏號CGMCCN0.5470，保藏日期為2011年11月18日。
[0007]專利《用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的干酪乳桿菌、動物雙歧桿菌和植物乳桿菌》，CN103421710A,公開了采用干酪乳桿菌CGMCC N0.6735、植物乳桿菌CGMCC N0.6744和動物雙歧桿菌CGMCC N0.5470進行混菌固態(tài)發(fā)酵，制備出含有益生菌的豆柏發(fā)酵制品。
[0008]專利《用于飼料添加劑益生菌固體發(fā)酵的動物雙歧桿菌和枯草芽孢桿菌》，CN103421712A,公開了采用枯草芽孢桿菌CGMCC N0.6733和動物雙歧桿菌CGMCC N0.5470進行混菌固態(tài)發(fā)酵豆柏，制備出含有益生菌的豆柏發(fā)酵制品。
[0009]本發(fā)明針對一株經(jīng)過體外耐酸性試驗、耐膽鹽試驗等一系列試驗篩選得到的益生菌株一雙歧乳桿菌V9，通過優(yōu)化液體培養(yǎng)基以及對培養(yǎng)條件的控制等方法實現(xiàn)高密度發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)離心收集菌體、添加保護劑后冷凍干燥得到凍干菌粉，可以應(yīng)用于益生菌發(fā)酵劑和益生菌制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種雙歧乳桿菌V9 (Bifidobacterium animal is subsp.1actis V9, Bifidobacterium lactis V9)的高密度培養(yǎng)方法。所述雙歧乳桿菌V9(Bifidobacterium animal is subsp.lactis V9, Bifidobacterium lactis V9)是從健康蒙古族兒童腸道內(nèi)分離得到的耐酸和耐膽鹽的益生菌；該菌菌株已于2011年11月18日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心保藏，保藏號為CGMCC N0.5470，分類名稱為動物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacterium animal is subsp.lactis),地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
[0011]本發(fā)明的又一目的在于提供該菌株凍干菌粉的制備方法，凍干菌粉可以應(yīng)用于益生菌發(fā)酵劑和益生菌制劑。
[0012]本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的: [0013]一種雙歧乳桿菌V9的高密度培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0014]a.菌種的活化:
[0015]將_40°C冷凍保存的雙歧乳桿菌V9接種于121°C 15min滅菌后的TPY液體培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)18~24小時，如此傳代培養(yǎng)I~2次得到活化菌種；
[0016]b.優(yōu)化培養(yǎng)基的配制:
[0017]將優(yōu)化培養(yǎng)基各成份按比例配制，混合均勻后調(diào)pH值為6.5，121 °C下滅菌15min ；
[0018]優(yōu)化培養(yǎng)基組成如下:
[0019]乳糖8.0~12.0kg,牛肉膏2.0~7.0kg,酵母粉2.0~7.0kg,酪蛋白胨8.0~12.0kg,大豆蛋白胨 2.0 ~7.0kg, KH2PO4L O ~4.0kg, K2HPO4L O ~4.0kg, MgSO40.05 ~
0.15kg,吐溫-800.15~0.35kg, L-半胱氨酸鹽酸鹽0.2~0.7kg,碳酸鈣0.8~1.2kg,蒸餾水1000L。
[0020]c.種子液的制備:
[0021]取步驟a中活化好的菌種接種于b中配制的培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)至pH值為
4.5~4.8時停止；
[0022]d.接種與培養(yǎng):
[0023]將步驟c的種子液，接種于b中配制的培養(yǎng)基中，在控制的發(fā)酵條件下發(fā)酵12~18h ；
[0024]發(fā)酵條件控制為:發(fā)酵前期，30_35°C恒溫培養(yǎng)，自然發(fā)酵至pH為5.0-5.8 ;再調(diào)整發(fā)酵溫度為33-37°C恒溫培養(yǎng)，并控制pH保持5.4~6.0，保持厭氧發(fā)酵。
[0025]上述過程中可以通過流加中和劑的方法控制pH，其中中和劑可以是NaOH、Κ0Η、Na2CO3或氨水溶液等無機堿水溶液。[0026]其中厭氧條件可以通過通氮氣0.02~0.05vvm,或每兩個小時通氮氣一次的方法實現(xiàn)。
[0027]e.終止發(fā)酵
[0028]當(dāng)菌體產(chǎn)酸停止時終止發(fā)酵，得到雙歧乳桿菌V9的高密度發(fā)酵液，發(fā)酵液活菌數(shù)達到 2.0X1010cfu/ml 以上。
[0029]其中可根據(jù)pH不再降低，中和劑流加停止來判斷產(chǎn)酸是否停止。
[0030]一種如上所述的雙歧乳桿菌V9凍干菌粉的制備方法，包括如下步驟:
[0031]a.菌體濃縮:高密度發(fā)酵液經(jīng)8000~12000g離心濃縮菌體；
[0032]b.添加保護劑:菌體濃縮液添加3~8倍的保護劑溶液；
[0033]保護劑溶液的組成如下:
[0034]脫脂乳10-15kg,乳糖8-12kg,維生素Cl_2kg,谷氨酸鈉l_2kg,蒸懼水1000L。
[0035]c.干燥:將上述添加保護劑后的菌懸液經(jīng)冷凍干燥得到凍干菌粉，菌粉中活菌總數(shù)達到6.0X10ncfu/g以上。
[0036]本發(fā)明所述方法制備的雙歧乳桿菌V9凍干菌粉可以應(yīng)用于益生菌發(fā)酵劑或益生菌制劑，如:直投式 發(fā)酵劑、發(fā)酵豆乳益生菌飲料、發(fā)酵乳制品、益生菌奶粉、益生菌固體飲料、益生菌片劑和益生菌膠囊等產(chǎn)品。
[0037]有益效果:
[0038]本發(fā)明的雙歧乳桿菌V9 (Bifidobacterium animal is subsp.lactis V9,Bifidobacterium lactis V9)對酸和膽鹽耐受能力強,并且顯著抑制致病菌和降低動物因腹瀉導(dǎo)致的死亡率等多種益生功能，經(jīng)高密度發(fā)酵后，添加保護劑冷凍干燥，可得到高活力的凍干菌粉，滿足了對于益生菌發(fā)揮益生功效所需的高活力的要求，可直接應(yīng)用于益生菌制劑或益生菌發(fā)酵劑。
[0039]本發(fā)明高密度發(fā)酵方法得到雙歧乳桿菌V9的發(fā)酵液，發(fā)酵液活菌數(shù)可達2.0X1010cfu/ml以上，比目前報道的高密度發(fā)酵的活菌數(shù)高5_15倍(胡曼:兩歧雙歧桿菌培養(yǎng)及凍干保護劑的研究，陜西科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2012)。
[0040]本發(fā)明方法得到的雙歧乳桿菌V9凍干菌粉，菌粉活菌總數(shù)可以達到
6.0X 10ncfu/g以上，比目前報道的雙歧桿菌凍干菌粉的活菌數(shù)高2-10倍(發(fā)明專利:一種雙歧桿菌凍干粉的制備方法及其產(chǎn)品和用途，專利申請?zhí)?200310103234.0)，可以應(yīng)用于益生菌發(fā)酵劑或益生菌制劑。
【具體實施方式】
[0041]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明；以下實施例僅為說明性的，本發(fā)明并不受這些實施例的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0042]實施例1:
[0043]雙歧乳桿菌V9(Bifidobacterium animal is subsp.lactis V9, Bifidobacteriumlactis V9)的高密度發(fā)酵:
[0044]a.菌種的活化:將-40°C冷凍保存的雙歧乳桿菌V9(Bif idobacterium animal issubsp.lactis V9, Bifidobacterium lactis V9)接種于 5ml TPY 液體培養(yǎng)基中(TPY 培養(yǎng)基:乳糖10g，牛肉膏5g，酵母粉5g，酪蛋白胨10g，大豆蛋白胨5g，ΚΗ2Ρ042.5g，Κ2ΗΡ042.5g，MgSO40.1g,吐溫-800.25g，蒸餾水 1000mL, ρΗ7.0,121。。15min 滅菌)，37°C厭氧培養(yǎng) 20 小時，如此傳代培養(yǎng)2次得到活化的菌種。
[0045]b.配制優(yōu)化培養(yǎng)基，將乳糖8.0kg，牛肉膏2.0kg，酵母粉7.0kg，酪蛋白胨8.0kg,大豆蛋白胨 rL 0kg，KH2PO4L 0kg,K2HP044.0kg7MgSO40.05kg,吐溫-800.15kg，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.2kg，碳酸鈣0.8kg，蒸餾水1000L，充分溶解。
[0046]c.制備種子培養(yǎng)液:將上述活化好的菌種5%接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)至PH值為4.5時停止。
[0047]d.接種發(fā)酵:將種子培養(yǎng)液7%接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，先30°C恒溫培養(yǎng)，自然發(fā)酵至pH為5.0-5.8 ;再調(diào)整發(fā)酵溫度為35°C恒溫培養(yǎng)，自動控制流加氨水保持pH5.4~6.0，通過通氮氣0.02~0.05vvm保持厭氧發(fā)酵。發(fā)酵至產(chǎn)酸停止，氨水不再流加時終止發(fā)酵，得到雙歧乳桿菌V9高密度培養(yǎng)液，經(jīng)檢測發(fā)酵液中活菌數(shù)達到3.0X 101(lCfu/ml。
[0048]實施例2:
[0049]雙歧乳桿菌V9(Bifidobacterium animal is subsp.lactis V9, Bif idobacteriumlactis V9)的高密度發(fā)酵:
[0050]a.菌種的活化:將-40°C冷凍保存的雙歧乳桿菌V9(Bif idobacterium animal issubsp.lactis V9, Bifidobacterium lactis V9)接種于 5ml TPY 液體培養(yǎng)基中(TPY 培養(yǎng)基:乳糖10g，牛肉膏5g，酵母粉5g，酪蛋白胨10g，大豆蛋白胨5g，ΚΗ2Ρ042.5g，Κ2ΗΡ042.5g，MgSO40.1g,吐溫-800.25g，蒸餾水 1000mL, ρΗ7.0,121。。15min 滅菌)，37°C厭氧培養(yǎng) 20 小時，如此傳代培養(yǎng)2次得到活化的菌種。 [0051]b.配制優(yōu)化培養(yǎng)基，將乳糖12.0kg，牛肉膏5.0kg，酵母粉5.0kg，酪蛋白胨12.0kg,大豆蛋白胨 5.0kg, ΚΗ2Ρ044.0kg，Κ2ΗΡ042.0kg，MgSO40.15kg，吐溫-800.35kg，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5kg，碳酸鈣1.2kg，蒸餾水1000L，充分溶解。
[0052]c.制備種子培養(yǎng)液:將上述活化好的菌種8%接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，37°C厭氧培養(yǎng)至PH值為4.8時停止。
[0053]d.接種發(fā)酵:將種子培養(yǎng)液10%接種于優(yōu)化培養(yǎng)基中，先32°C恒溫培養(yǎng)，自然發(fā)酵至pH為5.0-5.8 ;再調(diào)整發(fā)酵溫度為37°C恒溫培養(yǎng)，通過每兩個小時通氮氣一次的方法保持厭氧發(fā)酵，自動控制流加lOmol/L NaOH溶液保持pH5.9發(fā)酵至產(chǎn)酸停止，得到雙歧乳桿菌V9高密度培養(yǎng)液。經(jīng)檢測發(fā)酵液中活菌數(shù)達到2.8X 101(lCfu/ml。
[0054]實施例3:
[0055]雙歧乳桿菌V9(Bifidobacterium animal is subsp.lactis V9, Bif idobacteriumlactis V9)凍干菌粉的制備:
[0056]將雙歧乳桿菌V9高密度發(fā)酵液經(jīng)1000Og離心得到濃縮菌體，按濃縮菌體與保護劑溶液比例1:5加入保護劑溶液(脫脂乳IOkg,乳糖8kg,維生素Clkg,谷氨酸鈉Ikg,蒸懼水1000L)，混合均勻后入冷凍干燥機中冷凍干燥30小時，得到雙歧乳桿菌V9凍干菌粉。菌粉的活菌數(shù)可達6.0X10ncfU/g以上，可直接應(yīng)用于益生菌發(fā)酵劑或益生菌制劑。
【權(quán)利要求】
1.一種雙歧乳桿菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于，發(fā)酵過程中發(fā)酵條件控制為:發(fā)酵前期，30-35°C恒溫培養(yǎng)，自然發(fā)酵至pH為5.0-5.8 ;再調(diào)整發(fā)酵溫度為33_37°C恒溫培養(yǎng)，并控制PH保持5.4~6.0，保持厭氧發(fā)酵；當(dāng)菌體產(chǎn)酸停止時終止發(fā)酵，發(fā)酵液活菌數(shù)達到2.0X 101Qcfu/ml以上；所述雙歧乳桿菌保藏編號為CGMCC N0.5470。
2.如權(quán)利要求1所述的一種雙歧乳桿菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于，所述發(fā)酵過程中發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下:乳糖8.0~12.0kg，牛肉膏2.0~7.0kg，酵母粉2.0~7.0kg,酪蛋白胨 8.0 ~12.0kg，大豆蛋白胨 2.0 ~7.0kg，KH2PO4L O ~4.0kg，K2HPO4L O ~4.0kg,MgSO40.05~0.15kg，吐溫-800.15~0.35kg，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.2~0.7kg，碳酸鈣0.8~1.2kg,蒸懼水1000L,混合均勻后調(diào)pH值為6.5,121°C下滅菌15min。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種雙歧乳桿菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于，所述控制PH保持5.4~6.0是通過流加中和劑的方法控制，所述中和劑是NaOH溶液、KOH溶液、Na2CO3溶液或氨水溶液中的任意一種。
4.如權(quán)利要求1或2所述的一種雙歧乳桿菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于，所述厭氧發(fā)酵是通過通氮氣0.02~0.05vvm或每兩個小時通氮氣一次的方法實現(xiàn)。
5.如權(quán)利要求1或2所述的一種雙歧乳桿菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于，所述雙歧乳桿菌CGMCC N0.5470在發(fā)酵過程前還經(jīng)過種子液的制備，是在權(quán)利要求2所述培養(yǎng)基中37 °C厭氧培養(yǎng)至pH值為4.5~4.8時停止。
6.利用權(quán)利要求1-5任一方法得到的發(fā)酵液制備雙歧乳桿菌凍干菌粉的方法，包括如下步驟: a.菌體濃縮:高密度發(fā)酵液經(jīng)8000~12000g離心濃縮菌體； b.添加保護劑:菌體濃縮液添加3~8倍的保護劑溶液； 所述保護劑溶液的組成如下:脫脂乳10_15kg，乳糖8-12kg，維生素Cl-2kg，谷氨酸鈉l-2kg，蒸餾水 1000L ； c.干燥:將上述添加保護劑后的菌懸液經(jīng)冷凍干燥得到凍干菌粉，菌粉中活菌總數(shù)達到 6.0X10ncfu/g 以上。
【文檔編號】C12N1/20GK103898018SQ201410123146
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年3月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月28日
【發(fā)明者】高鵬飛, 趙旭, 張善亭 申請人:北京和美科盛生物技術(shù)有限公司